Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financé par la subvention des NIH #5P01DK119130-02. Les auteurs tiennent à remercier l’UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (dirigé par le Dr Phelps) et son personnel (Abhijit Bugde et Marcel Mettlen), soutenus en partie par la subvention des NIH #1S10OD021684-01, une ressource partagée du Harold C. Simmons Cancer Center, soutenue en partie par une subvention de soutien du NCI Cancer Center, P30 CA142543.

REMARQUE: Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles de type sauvage sur un fond pur C57BL / 6J. Au total, 4 souris ont été utilisées pour le multiplex ISH. Toutes les souris avaient environ 8 semaines au moment du sacrifice. Une souris mâle (âgée d’environ un an) a également été utilisée pour démontrer une fluorescence endogène associée au vieillissement. Les animaux étaient logés dans des cages ventilées à l’intérieur d’une installation de barrière avec un accès ad libitum...

La technique de l’ISH a été inventée à la fin des années 196042. Cependant, ce n’est qu’au milieu des années 1980 qu’il a été appliqué pour la détection des ARNm dans les systèmes nerveux central et périphérique43,44. Compte tenu de l’hétérogénéité du système nerveux et des problèmes récurrents avec les anticorps, la localisation d’un transcrit particulier au niveau cellulaire reste un outil inestimable. N?...

Les corps cellulaires des afférences vagales sont contenus dans les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses1,2,3. Leurs axones voyagent ensemble via plusieurs branches du nerf vague vers les territoires craniocervicaux, thoraciques et abdominaux4,5,6,7. À partir de leurs terminaisons viscérales, les afférences vagales peuvent répondre à un large éventail de stimuli physiologiques et nocifs8,9,10. Cependant, la distribution des molécules de signalisation et des récepteurs impliqués dans la détection vagale reste mal caractérisée. C’est en partie parce que les ganglions vagales, malgré leur petite taille, expriment un large spectre de récepteurs, y compris un grand nombre de RCPG8,11,12,13. De plus, les neurones afférents vagals sont intrinsèquement hétérogènes et présentent des profils moléculaires distincts14. Pour compliquer la question, les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses sont attachés dans la souris, formant ainsi une seule masse ganglionnaire. Enfin, chez un sous-ensemble d’animaux, le ganglion nodosé est attaché au ganglion cervical supérieur sympathique15.
Dans le passé, les chercheurs se sont tournés vers l’immunohistochimie pour étudier la composition neurochimique des neurones afférentsvagals 16,17,18. Bien que l’immunohistochimie utilisant des anticorps validés soit utile, les résultats des études immunohistochimiques doivent être interprétés avec prudence. Par exemple, de nombreux efforts pour identifier des anticorps spécifiques contre les RCPG ont échoué19,20,21,22,23,24,25, ce qui a conduit les chercheurs à conclure que la majorité des anticorps contre les RCPG ne sont pas fiables. Pour contourner ces problèmes, la PCR quantitative (qPCR) a été largement utilisée pour évaluer l’expression des gènes dans la masse ganglionnaire vagale du rongeur26,27,28,29. Cependant, l’examen de l’expression des gènes à l’aide de la qPCR se fait au prix d’une perte d’information spatiale. En particulier, il est impossible de prédire combien de cellules ou quel(s) type(s) cellulaire(s) expriment un gène particulier d’intérêt (p. ex., nodose vs cellules jugulaires). Les problèmes récurrents comprennent également la contamination par les tissus adjacents et l’inclusion de longueurs variables du nerf vague, des ganglions cervicaux supérieurs et jugulaires pendant la dissection15. En raison des difficultés ci-dessus, la controverse entoure l’expression et la distribution de plusieurs RCPG dans les neurones afférents vagals. Un exemple particulièrement déroutant concerne le récepteur de la ghréline (Ghsr). Alors que certaines études ont trouvé une expression répandue de ce récepteur dans les neurones afférents vagaux30,31,32, d’autres ont trouvé que l’ARNm Ghsr était presque indétectable dans le ganglion nodosé11,14. Une cartographie détaillée de l’ARNm Ghsr dans la masse ganglionnaire vagale est donc justifiée.
L’hybridation in situ (ISH) a également été utilisée pour évaluer les modèles d’expression génique dans la masse ganglionnaire vagale7,11,12,33,34,35. Parce que les techniques à base d’ARN restent plus fiables et spécifiques que les techniques à base d’anticorps dans la plupart des circonstances36,37, les études ISH se sont avérées précieuses pour une meilleure compréhension du codage neurochimique des neurones afférents vagal. Néanmoins, les techniques ISH traditionnelles elles-mêmes ne sont pas sans réserves. L’ISH radioactif est sensible mais génère un fond et reste encombrant38. L’ISH non radioactif est moins compliqué mais aussi moins sensible38. En revanche, la méthode RNAscope ISH récemment développée est très sensible et génère un arrière-plan minimal39. La présente étude a appliqué un ARN fluorescent multiplex à la détection de RCPG dans les neurones afférents vagaux de la souris. Nous nous sommes concentrés sur la cartographie de la distribution de Ghsr et avons comparé sa distribution à celle du récepteur de la cholécystokinine (Cck1r), un autre RCPG bien connu pour être exprimé dans le ganglion nodostique34. Enfin, les deux facteurs de transcription, l’homéobox 2b de type apparié (Phox2b) et la protéine de doigt de zinc du domaine PR 12 (Prdm12), ont été utilisés comme marqueurs sélectifs pour les neurones nodose et afférent jugulaire, respectivement14. Sans visualiser Phox2b ou Prdm12, il serait difficile d’identifier avec certitude les afférences jugulaires par rapport aux nodoses. Les pièges techniques potentiels sont également discutés tout au long de l’article.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

Cette étude décrit un protocole pour l’hybridation multiplex in situ (ISH) des ganglions jugulaires-noduoses de souris, avec un accent particulier sur la détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les ganglions jugulaires-noduoses fixés au formol ont été traités avec la technologie RNAscope pour détecter simultanément l’expression de deux RCPG représentatifs (récepteurs de la cholécystokinine et de la ghréline) en combinaison avec un gène marqueur de nodose (homéobox appariée 2b, Phox2b) ou de neurones afférents jugulaires (protéine de doigt de zinc du domaine PR 12, Prdm12). Les ganglions marqués ont été imagés à l’aide de la microscopie confocale pour déterminer la distribution et les modèles d’expression des transcriptions susmentionnées. En bref, les neurones afférents de Phox2b ont été trouvés pour exprimer abondamment le récepteur de la cholécystokinine (Cck1r) mais pas le récepteur de la ghréline (Ghsr). Un petit sous-ensemble de neurones afférents Prdm12 a également été trouvé pour exprimer Ghsr et / ou Cck1r. Les mises en garde techniques potentielles dans la conception, le traitement et l’interprétation du multiplex ISH sont discutées. L’approche décrite dans cet article peut aider les scientifiques à générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Bien que RNAScope puisse être appliqué à des animaux de tout âge, sexe ou bagage génétique, il est conseillé de travailler avec de jeunes adultes (<3 mois). En effet, les artefacts fluorescents (par exemple, la lipofuscine) sont des résultats courants dans les neurones d’animaux plus âgés41. Les ganglions fixés au formol de souris plus âgées contiennent souvent une fluorescence endogène étonnamment intense qui peut facilement être confondue avec une véritable coloration<strong c...

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Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

L’hybridation multiplex in situ (ISH) a été utilisée pour visualiser simultanément les transcriptions de deux récepteurs couplés à la protéine G et d’un facteur de transcription dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Ce protocole pourrait être utilisé pour générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.

Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Cette procédure est très sensible et permet une visualisation de plusieurs transcriptions avec un minimum d’arrière-plan. Cette méthode permet de générer des cartes précises du profil transcriptionnel de types cellulaires très hétérogènes. La démonstration de la procédure sera faite par moi et Johnson Bob-manuel, un technicien de recherche au laboratoire.Commencez par collecter toute la masse ganglionnaire vagale de la souris âgée de huit semaines de chaque côté, à l’aide d’une lunette de dissection et d’instruments chirurgicaux. Après la décapitation de la souris, utilisez une petite pince pour enlever les muscles sternohyoïdes et omohyoïdes latéralement à la trachée pour exposer l’os occipital. Nettoyez toute la région des muscles et des tissus jusqu’à ce que l’artère carotide, le nerf vague et hypoglosse et le foramen magnum soient visibles.Ensuite, coupez tout le nerf hypoglosse avec de petits ciseaux à ressort. Localiser pour le ganglion nodosé comme une masse translucide près du foramen magnum. À l’aide de petits ciseaux, cassez soigneusement l’os occipital.Pour exposer davantage le ganglion jugulaire, localisez les mélanocytes noirs à la surface de la jugulaire comme point de repère visuel. Lorsque les ganglions sont trouvés, coupez les attaches nerveuses entre la masse ganglionnaire vagale et tirez doucement sur l’extrémité périphérique du nerf vague tout en coupant simultanément le ganglion jugulaire vers le tronc cérébral avec de petits ciseaux à ressort pour l’extraction de toute la masse ganglionnaire. Enlevez le tissu conjonctif, la masse ganglionnaire et la graisse qui adhèrent au nerf vague.Garder environ un demi-centimètre du nerf vague pour faciliter la manipulation et la localisation des échantillons. Placez le retrait sur les ganglions à l’aide de pinces fines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millimètre. Et incuber à quatre degrés Celsius dans le formol pendant 24 heures.Et puis avec 30% de saccharose pendant 24 heures. Après l’incubation, placez les ganglions à l’intérieur d’une goutte de quatre millimètres de diamètre de milieu de température de coupe optimale sur un morceau de papier d’aluminium. Et formulez l’échantillon sur un lit de glace carbonique.Coupez les échantillons congelés avec un cryostat en sections de 14 micromètres d’épaisseur à moins 20 degrés Celsius et collectez les sections coupées sur les lames de microscope en verre à trois séries espacées de 42 micromètres. Rincez les lames avec des coupes de tissu dans PBS. Et cuire au four pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius dans un four à pâtisserie.Ensuite, postfixez les lames dans du formol à 4% pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Déshydratez en série les lames dans 50% 70% et 100% d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Et appliquer une solution de peroxyde d’hydrogène sur les échantillons pendant 10 minutes avant de rincer dans de l’eau distillée double.Pour l’hybridation in situ, ou ISH, traiter les échantillons avec le réactif de récupération cible pendant cinq minutes. Ensuite, rincez séquentiellement les échantillons dans de l’eau distillée double et de l’éthanol à 100%, puis séchez à l’air. À l’aide d’un stylo hydrophobe, créez une barrière autour des échantillons.Pendant que les échantillons sont traités avec de la protéase pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius et un four d’hybridation, préchauffer les sondes à 40 degrés Celsius et les refroidir à température ambiante avant utilisation. Après être sorti du four, incuber les lames avec la combinaison souhaitée de sondes cibles pendant deux heures à 40 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Incuber le tissu témoin négatif avec la dihydrodipicolinate réductase ou DapB, sonde cible C1 pendant deux heures à 40 degrés Celsius.Rincez les lames dans un tampon de lavage et conservez-les dans cinq fois le citrate de sodium salin à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, rincez les lames avec un tampon de lavage avant l’incubation avec des réactifs d’amplification. Et traitez avec des réactifs spécifiques au canal comme décrit dans le manuscrit.Lavez les lames suivies d’un traitement avec DapB pendant 30 secondes. Ensuite, appliquez immédiatement le support de montage sur chaque glissière et placez un glissement de couverture sur la section de tissu. Gardez les tissus horizontaux dans un porte-lames à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.Préparez un microscope confocal pour l’imagerie en définissant les paramètres requis. Acquérir les images avec une moyenne de ligne de quatre et une taille de pixel d’au moins 1024 par 1024 pour améliorer la qualité des images. Une fois satisfait des paramètres d’acquisition, commencez à acquérir les images en utilisant les mêmes paramètres.Attribuez de fausses couleurs à chaque canal pour faciliter la visualisation. À l’aide des images numériques, effectuez le comptage cellulaire en identifiant le contour des profils positifs de portée de l’ARN avec un noyau légèrement coloré avec DapB. Calculez le pourcentage de profils positifs de portée de l’ARN exprimant chaque transcription.Les paramètres d’acquisition optimaux ont été choisis pour chaque laser en fonction de la fluorescence non spécifique obtenue dans le tissu témoin négatif. La fluorescence endogène dans le ganglion de nodose d’une souris jeune adulte est minime. Et l’incubation avec une sonde DapB, cela n’a pas donné de signaux.À une puissance accrue du laser et du gain avec le laser de 488 nanomètres, un arrière-plan indésirable et des points fluorescents aléatoires apparaissent. La technique de portée de l’ARN a été appliquée pour détecter trois gènes dans des sections tissulaires de la masse ganglionnaire vagale. Le profil tissulaire était positif pour le GHSR et le CCK1R.Le profil comprenait à la fois des transcriptions Phox2b et CCK1R dans la partie rostrale du ganglion nodosé. À la suite de l’ISH multiplex dans les neurones afférents nodosés, les signaux Phox2b se sont spécifiquement accumulés dans les neurones afférents, situés dans le ganglion nodose. Les signaux CCK1R ont intensément marqué de nombreux neurones dans le ganglion nodosé.À faible grossissement, les cellules exprimant de faibles signaux CCK1R ou GSHR ne pouvaient pas être observées facilement. DapB a aidé à visualiser le tissu et à identifier les neurones afférents vagals avec un noyau grand et légèrement coloré. À fort grossissement, les profils positifs de Phox2b sont évidents.Les profils deux et trois sont des cellules Phox2b avec des signaux CCK1R élevés et modérés. Le profil quatre exprimait à la fois le GHSR et le CCK1R. En raison de l’ISH multiplex des neurones afférents jugulaires, le transcrit PRDM12 a pu être vu spécifiquement accumulé dans les neurones afférents situés dans le ganglion jugulaire.À fort grossissement, des signaux modérés pour CCK1R ont été détectés dans les profils un et deux. Le profil trois est un représentant des cellules PRDM12 négatives pour CCK1R ou GHSR. La cohérence de la dissection est un facteur important.Il est tout aussi important de vérifier que les paramètres d’acquisition d’imagerie ne génèrent pas de signaux d’arrière-plan indésirables. L’hybridation multiplex in situ est devenue la référence en matière moléculaire établie, en particulier dans le domaine de la neuroanatomie. Cette méthode peut être facilement combinée avec l’immunohistochimie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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