Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
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इस कार्य को एनआईएच ग्रांट #5P01DK119130-02 द्वारा वित्तपोषित न्यूरोएनाटॉमी/हिस्टोलॉजी/ब्रेन इंजेक्शन कोर द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक यूटी पश्चिमी लाइव सेल इमेजिंग सुविधा (डॉ फेल्प्स की अध्यक्षता में) और उसके कर्मचारियों (अभिजीत बुगडे और मार्सेल मेटलेन) की सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं, जो एनआईएच ग्रांट #1S10OD021684-01 द्वारा भाग में समर्थित है, जो एक एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट द्वारा भाग में समर्थित है, P30 CA142543।

नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों एक शुद्ध C57BL/6J पृष्ठभूमि पर जंगली प्रकार के पुरुष थे । मल्टीप्लेक्स ईश के लिए कुल 4 चूहों का इस्तेमाल किया गया। बलिदान के समय सभी चूहे लगभग 8 सप्ताह पुराने थे। एक पुरुष माउ?...

ईश की तकनीक का आविष्कार 1960 के दशक के अंत में42के दशक में किया गया था । हालांकि, 1 9 80 के दशक के मध्य तक यह नहीं है कि इसे केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र43,44में एमआरएएनए का पता ल?...

वागल एफरेंट्स के सेल निकायों में जुगुलर, पेट्रोसल और नोडोज गैंगलिया1,2,3शामिल हैं। उनके अक्षों को एक साथ वेगस तंत्रिका की कई शाखाओं के माध्यम से क्रैनियोसर्विकल,वक्ष और पेट केक्षेत्रों 4,5,6, 7तक यात्राकरतेहैं। उनके आंत के अंत से, वैगल एफरेंट्स शारीरिक और हानिकारक उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब दे सकते हैं8,9,10। हालांकि, वैगल सेंसिंग में शामिल सिग्नलिंग अणुओं और रिसेप्टर्स का वितरण खराब विशेषता बना हुआ है। यह आंशिक रूप से इसलिए है क्योंकि वागल गैंगलिया, अपने छोटे आकार के बावजूद, रिसेप्टर्स का एक व्यापक स्पेक्ट्रम व्यक्त करते हैं, जिसमें बड़ी संख्या में जीपीसीआर8,11,12, 13शामिल हैं। इसके अलावा, vagal afferent न्यूरॉन्स स्वाभाविक विषम हैं और अलग आणविक प्रोफाइल14प्रदर्शित करते हैं । मामले को जटिल बनाने के लिए, माउस में जुगुलर, पेट्रोसल और नोडोज गैंगलिया संलग्न होते हैं, जिससे एक ही गैंगलियोनिक द्रव्यमान बन जाता है। अंत में, जानवरों के सबसेट में, नोडोज गैंगलियन सहानुभूति बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलियन15से जुड़ा हुआ है।
अतीत में, जांचकर्ताओं ने वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स16, 17, 18के न्यूरोकेमिकल मेकअप का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोहिस्टकेमिस्ट्री की ओर रुख किया है। जबकि मान्य एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री उपयोगी है, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययनों के परिणामों की सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, जीपीसीआर के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने के कईप्रयास19, 20,21,22,23,24,25,प्रमुख जांचकर्ताओं को यह निष्कर्ष निकालने में विफल रहे हैं कि जीपीसीआर के खिलाफ अधिकांश एंटीबॉडी अविश्वसनीय हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, कृंतक वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान 26 , 27 ,28,29में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है । हालांकि, क्यूपीसीआर का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की जांच स्थानिक जानकारी के नुकसान की कीमत पर होती है। विशेष रूप से, यह अनुमान नहीं लगाया जा सकता कि कितनी कोशिकाएं या कौन सी कोशिका प्रकार (एस) ब्याज के एक विशेष जीन को व्यक्त करती हैं (उदाहरण के लिए, नोडोज बनाम जुगुलर कोशिकाएं)। आवर्ती मुद्दों में आसन्न ऊतकों के साथ संदूषण और विच्छेदन15के दौरान वेगस तंत्रिका, बेहतर गर्भाशय ग्रीवा और जुगुलर गैंगलिया की चर लंबाई को शामिल करना भी शामिल है। उपरोक्त कठिनाइयों के परिणामस्वरूप, विवाद वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स में कई जीपीसीआर की अभिव्यक्ति और वितरण को घेरे हुए है। एक विशेष रूप से पेचीदा उदाहरण ghrelin रिसेप्टर (Ghsr) से संबंधित है। जबकि कुछ अध्ययनों में इस रिसेप्टर की व्यापक अभिव्यक्ति वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स30 , 31,32में पाई गई है , अन्य ने गस्सर एमआरएनए को नोडोज गैंगलियन 11,14में लगभग अज्ञेय पाया है । इसलिए वागल गैंगलियोनिक द्रव्यमान में जीएचएसआर एमआरएनए की विस्तृत मैपिंग की आवश्यकता है।
सीटू संकरण (ISH) में भी वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान 7 , 11,12,33,34,35में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। चूंकि आरएनए-आधारित तकनीकें अधिकांश परिस्थितियों में एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों की तुलना में अधिक विश्वसनीय और विशिष्ट बनी हुई हैं36,37,ईश अध्ययन ने वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स के न्यूरोकेमिकल कोडिंग की बेहतर समझ के लिए मूल्यवान साबित किया है। बहरहाल, पारंपरिक ISH तकनीकों खुद चेतावनी के बिना नहीं कर रहे हैं । रेडियोधर्मी ईश संवेदनशील है लेकिन पृष्ठभूमि उत्पन्न करता है और38बोझिल रहता है । गैर रेडियोधर्मी ISH कम जटिल है, लेकिन यह भी कम संवेदनशील३८। इसके विपरीत, हाल ही में विकसित आरएनएस्कोप ईश विधि अत्यधिक संवेदनशील है और न्यूनतम पृष्ठभूमि39उत्पन्न करती है। वर्तमान अध्ययन ने माउस के वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स में जीपीसीआर का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आरएनएस्कोप को लागू किया। हमने जीएचएसआर के वितरण की मैपिंग पर ध्यान केंद्रित किया और इसके वितरण की तुलना कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर (Cck1r) से की, एक और जीपीसीआर जिसे नोडोज गैंगलियन34में व्यक्त किया जाना जाता है। अंत में, दो प्रतिलेखन कारकों, बनती-जैसे होमोबॉक्स 2b (Phox2b) और पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12 (Prdm12), क्रमशः14,nodose और जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स के लिए चयनात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । Phox2b या Prdm12 की कल्पना किए बिना, निश्चितता के साथ जुगलबंदी बनाम नोडोज afferents की पहचान करना चुनौतीपूर्ण होगा। संभावित तकनीकी नुकसान भी लेख भर में चर्चा कर रहे हैं ।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

इस अध्ययन में माउस जुगलबंदी-नोज गैंगलिया के सीटू संकरण (ISH) में मल्टीप्लेक्स के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसमें जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) की अभिव्यक्ति का पता लगाने पर विशेष जोर दिया गया है। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड जुगलबंदी-नोडोज गैंगलिया को आरएनएस्कोप तकनीक के साथ संसाधित किया गया था ताकि एक साथ दो प्रतिनिधि जीपीसीआरएस (कोलेसिस्टोकिनिन और घोरलिन रिसेप्टर्स) की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सके, जो या तो नोडोज (जोड़ी-जैसे होमोबॉक्स 2b, फोक्स2बी) या जुगुलर एफेरेंट न्यूरॉन्स (पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12, Prdm12) के एक मार्कर जीन के संयोजन में था। लेबल किए गए गैंगलिया को उपरोक्त टेप के वितरण और अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेज किया गया था। संक्षेप में, Phox2b afferent न्यूरॉन्स बहुतायत से कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर (Cck1r) व्यक्त करने के लिए पाया गया, लेकिन नहीं ghrelin रिसेप्टर (Ghsr) । Prdm12 afferent न्यूरॉन्स का एक छोटा सा सबसेट भी Ghsr और/या Cck1r व्यक्त करने के लिए पाया गया था । मल्टीप्लेक्स ISH के डिजाइन, प्रसंस्करण और व्याख्या में संभावित तकनीकी चेतावनी पर चर्चा की जाती है । इस लेख में वर्णित दृष्टिकोण वैज्ञानिकों को वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न करने में मदद कर सकता है।

जबकि आरएनएस्कोप को किसी भी उम्र, लिंग या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों पर लागू किया जा सकता है, युवा वयस्कों (<3 महीने पुराने) के साथ काम करने की सलाह दी जाती है। इसका कारण यह है कि फ्लोरोसेंट कलाकृतियों (ज...

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Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

सीटू संकरण (ISH) में मल्टीप्लेक्स को वयस्क माउस के पूरे वागल गैंगलियोनिक परिसर में दो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स और एक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के लिए टेप की कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वेगल एफेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

सीटू संकरण में मल्टीप्लेक्स का उपयोग करके माउस वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स में जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर अभिव्यक्ति का पता लगाना

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

यह प्रक्रिया अत्यधिक संवेदनशील है और न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ कई प्रतिलिपियों के दृश्य की अनुमति देती है। यह विधि अत्यधिक विषम कोशिका प्रकारों के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न कर सकती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मुझे और जॉनसन बॉब-मैनुअल, प्रयोगशाला में एक अनुसंधान तकनीशियन होगा ।एक विच्छेदन गुंजाइश और शल्य चिकित्सा उपकरणों की मदद से, प्रत्येक पक्ष से आठ सप्ताह पुराने माउस से पूरे वागल गैंगलियोनिक द्रव्यमान को इकट्ठा करके शुरू करें। माउस के डेपुटेशन के बाद, ऑक्सीपिटल हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए ट्रेकिओयइड और ओमोहॉयड मांसपेशियों को श्वासनली में हटाने के लिए छोटे संदंश का उपयोग करें। मांसपेशियों और ऊतकों के पूरे क्षेत्र को साफ़ करें जब तक कि कैरोटिड धमनी, वेगस और हाइपोग्लोसल तंत्रिका और फोरमेन मैग्नम दिखाई न दें।फिर छोटे वसंत कैंची के साथ पूरे हाइपोग्लोसल तंत्रिका काटें। फोरमेन मैग्नम के करीब एक पारदर्शी द्रव्यमान के रूप में नोडोज गैंगलियन के लिए पता लगाएं। छोटी कैंची का उपयोग करके, सावधानी से ऑक्सीपिटल हड्डी को तोड़ें।जुगलबंदी गैंगलियन को आगे उजागर करने के लिए, एक दृश्य मील का पत्थर के रूप में जुगलबंदी की सतह पर काले मेलानोसाइट्स का पता लगाएं। जब गैंगलियन पाए जाते हैं, तो वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान के बीच तंत्रिका अनुलग्नकों को काट लें और धीरे-धीरे वैगस तंत्रिका के परिधीय छोर पर खींचें, साथ ही पूरे गैंगलियोनिक द्रव्यमान की निकासी के लिए छोटे वसंत कैंची के साथ ब्रेनस्टेम की ओर जुगुलर गैंगलियन को काटें। कंजक्टिव टिश्यू, गैंगलियोनिक मास और फैट को वैगस नर्व से चिपकाकर निकालें।नमूनों की हैंडलिंग और स्थानीयकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए लगभग आधा सेंटीमीटर वेगस तंत्रिका रखते हुए। 1.5 मिलीमीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में ठीक संदंश की मदद से गंगलिया को हटा दें। और 24 घंटे के लिए फॉर्मलिन में चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।और फिर 24 घंटे के लिए 30% सुक्रोज के साथ। इनक्यूबेशन के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर इष्टतम काटने के तापमान माध्यम के चार मिलीमीटर व्यास की एक बूंद के अंदर गैंगलिया की स्थिति । और सूखी बर्फ के एक बिस्तर पर नमूना वाक्यांश।शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर 14 माइक्रोमीटर मोटाई के वर्गों में एक क्रायोस्टेट के साथ जमे हुए नमूनों को काटें और तीन श्रृंखला 42 माइक्रोमीटर के अलावा ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कट सेक्शन एकत्र करें। पीबीएस में टिश्यू सेक्शन के साथ स्लाइड्स कुल्ला। और एक बेकिंग ओवन में ६० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेंकना ।फिर, चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4% फॉर्मलिन में स्लाइड पोस्टफिक्स । सीरियलली स्लाइड्स को 50%70% और 100% इथेनॉल में पांच मिनट के लिए डिहाइड्रेट करें। और डबल आसुत पानी में कुल्ला करने से पहले 10 मिनट के लिए नमूनों के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान लागू करें।सीटू संकरण, या ISH में, पांच मिनट के लिए लक्ष्य पुनः प्राप्ति अभिवाक के साथ नमूनों का इलाज करें। फिर क्रमिक रूप से डबल आसुत पानी और 100% इथेनॉल में नमूनों को कुल्ला जाता है जिसके बाद हवा सूखने लगती है। हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके, नमूनों के चारों ओर एक बाधा बनाएं।जबकि नमूनों को ४० डिग्री सेल्सियस और एक संकरण ओवन पर 30 मिनट के लिए प्रोटीज के साथ इलाज किया जा रहा है, ४० डिग्री सेल्सियस पर जांच prewarm और उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर उंहें शांत । ओवन से जाने के बाद, एक संकरण ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए लक्ष्य जांच के वांछित संयोजन के साथ स्लाइड इनक्यूबेट । डियडरोडिपिकोलिनेट रिडक्टेज या डीएपीबी के साथ नकारात्मक नियंत्रण ऊतक को इनक्यूबेट करें, 40 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए सी 1 जांच का लक्ष्य रखें।स्लाइड्स में धो बफर में कुल्ला और रात भर कमरे के तापमान पर पांच बार खारा सोडियम साइट्रेट में स्टोर करें। अगले दिन, प्रवर्धन रिएजेंट्स के साथ इनक्यूबेशन से पहले वॉश बफर के साथ स्लाइड्स कुल्ला। और पांडुलिपि में वर्णित चैनल विशिष्ट अभिकर्दकों के साथ व्यवहार करें।आगे की स्लाइड्स में जानें 30 सेकंड तक डीएपीबी से इलाज के बाद। इसके बाद तुरंत हर स्लाइड पर बढ़ते मीडियम को लगाएं और टिश्यू सेक्शन के ऊपर कवर स्लिप रखें। इमेजिंग तक ऊतकों को एक स्लाइड धारक में चार डिग्री सेल्सियस पर क्षैतिज रखें।आवश्यक मापदंडों को निर्धारित करके इमेजिंग के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप तैयार करें। छवियों की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए 1024 तक कम से कम 1024 के चार और पिक्सेल आकार के औसत के साथ छवियों को प्राप्त करें। एक बार अधिग्रहण मापदंडों से संतुष्ट होने के बाद, एक ही सेटिंग्स का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करना शुरू करें।दृश्य की सुविधा के लिए प्रत्येक चैनल के लिए झूठे रंगों का श्रेय दें। डिजिटल छवियों का उपयोग करना, डीएपीबी के साथ हल्के से दाग एक नाभिक के साथ आरएनए स्कोप सकारात्मक प्रोफाइल की रूपरेखा की पहचान करके सेल गिनती करें। प्रत्येक ट्रांसक्रिप्ट को व्यक्त करते हुए आरएनए स्कोप सकारात्मक प्रोफाइल के प्रतिशत की गणना करें।नकारात्मक नियंत्रण ऊतक में प्राप्त अविशिष्ट फ्लोरेसेंस के आधार पर प्रत्येक लेजर के लिए इष्टतम अधिग्रहण मापदंडों को चुना गया था। एक युवा वयस्क माउस के नोडोज गैंगलियन में अंतर्जात फ्लोरेसेंस कम है। और डीएपीबी जांच के साथ इनक्यूबेशन, यह संकेतों में परिणाम नहीं था ।488 नैनोमीटर लेजर, अवांछित पृष्ठभूमि और यादृच्छिक फ्लोरोसेंट डॉट्स के साथ बढ़ी हुई शक्ति लेजर और लाभ दिखाई देते हैं। वीएल स्कोप तकनीक को वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान के ऊतक वर्गों में तीन जीन का पता लगाने के लिए लागू किया गया था। जीएचएसआर और सीके1आर के लिए टिश्यू प्रोफाइल पॉजिटिव था ।प्रोफाइल में नोडोज गैंगलियन के रोस्ट्रल पार्ट में फोक्स2बी और सीके1आर ट्रांसक्रिप्ट दोनों शामिल थे । नोडोज अफ़रेंट न्यूरॉन्स में मल्टीप्लेक्स ईश के परिणामस्वरूप, फोक्स 2बी विशेष रूप से नोडोज गैंगलियन में स्थित अफरेंट न्यूरॉन्स में जमा होता है। CCK1R संकेतों तीव्रता से nodose गैंगलियन में कई न्यूरॉन्स लेबल ।कम आवर्धन पर, कम CCK1R या GSHR संकेतों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को आसानी से नहीं देखा जा सकता था। डीएपीबी ने ऊतक की कल्पना करने और एक बड़े और हल्के से दाग वाले नाभिक के साथ वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स की पहचान करने में मदद की। उच्च आवर्धन पर, Phox2b सकारात्मक प्रोफाइल स्पष्ट हैं।प्रोफाइल दो और तीन उच्च और मध्यम CCK1R संकेतों के साथ Phox2b कोशिकाएं हैं। प्रोफाइल फोर ने जीएचएसआर और सीके1आर दोनों को व्यक्त किया । जुगलबंदी अफ़रीद न्यूरॉन्स के मल्टीप्लेक्स ईश के परिणामस्वरूप, पीआरडीएम12 ट्रांसक्रिप्ट को विशेष रूप से जुगलबंदी गैंगलियन में स्थित अफरेंट न्यूरॉन्स में संचित देखा जा सकता है।उच्च आवर्धन पर, CCK1R के लिए मध्यम संकेतों को प्रोफाइल एक और दो में पाया गया । प्रोफाइल तीन CCK1R या GHSR के लिए नकारात्मक PRDM12 कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि है । विच्छेदन की निरंतरता एक महत्वपूर्ण कारक है।यह सत्यापित करना भी उतना ही महत्वपूर्ण है कि इमेजिंग अधिग्रहण पैरामीटर अवांछित पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न नहीं करते हैं। मल्टीप्लेक्स सीटू संकरण आणविक में सोने का मानक बन गया है, विशेष रूप से न्यूरोएनाटॉमी के क्षेत्र में। इस विधि को आसानी से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ जोड़ा जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

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डबल प्रतिदीप्ति बगल में</emताजा ब्रेन धारा में> संकरण

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

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Lipophilic डाई संयोजन, बगल में संकरण, immunohistochemistry, और प्रोटोकॉल

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

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प्रोटीन Palmitoylation immunoprecipitation और एसाइल बायोटिन विनिमय (अबे) द्वारा संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स में जांच

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

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फ्लोरिसेंट द्वारा neuronal ऊतकों में एक लगातार डीएनए वायरस के जीनोम और देखिए की जांच सीटू संकरण Immunostaining के साथ संयुक्त

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

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उच्च संकल्प का उपयोग मस्तिष्क वर्गों में Axonally स्थानीयकृत mRNAs का पता लगाने<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

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डबल प्रतिदीप्ति का मेल<em&gt; बगल में</em&gt; माउस मस्तिष्क वर्गों में तीन जीनों की अभिव्यक्ति की जांच के लिए Immunolabelling साथ संकरण

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

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माउस मध्यांत्रीय और colonic अनुभाग में Mesenteric अभिवाही तंत्रिका गतिविधि के इन विट्रो रिकॉर्डिंग में

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

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आरएनए द्वारा टिड्ड एंटीना में गंधी रिसेप्टर जीन का स्थानीयकरण<em&gt; क्षेत्र में</em&gt; संकरण

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

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कुतर नाभिक के भीतर डोपामाइन D1-अल्फा रिसेप्टर की पहचान सीटू का पता लगाने प्रौद्योगिकी में एक अभिनव आरएनए द्वारा Accumbens

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

तैयारी और पूरे सेल पैच दबाना के लिए प्रोटोकॉल Xenopus laevis Tectal ंयूरॉंस की रिकॉर्डिंग

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...