Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
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この研究は、NIH助成金#5P01DK119130-02によって資金提供された神経解剖学/神学/脳注射コアによって支えられた。著者らは、NCIがんセンター支援グラントの一部が支援するハロルド・C・シモンズがんセンターの共有資源であるNIHグラント#1S10OD021684-01の支援を受けたUTサウスウェスタン・ライブ・セル・イメージング・ファシリティ(フェルプス博士が率いる)とそのスタッフ(アビジット・バグデとマルセル・メトレン)の支援を認めたいと考えています。 P30 CA142543.

注:この研究で使用されたマウスは、純粋なC57BL / 6Jバックグラウンドで野生型の雄でした。多重化のISHには合計4匹のマウスを用いた。すべてのマウスは、犠牲の時点で約8週齢であった。1つの雄マウス(およそ1歳)も老化に関連する内因性蛍光を示すために使用された。動物は、食料と水への アドリビタム アクセスを備えたバリア施設内の換気ケージに収容されました。UTサウスウェス?...

ISHの技術は1960年代後半42年に発明された。しかし、1980年代半ばになって初めて、中枢神経系および末梢神経系43,44におけるmRNAの検出に適用された。神経系の異質性と抗体の繰り返しの問題を考慮すると、細胞レベルで特定のトランスクリプトを局所化することは非常に貴重なツールのままです。それにもかかわらず、伝統的なISH?...

迷走性の細胞体は、頸部、ペトロサル、および無用量神経節1、2、3に含まれている。彼らの軸索は、頭蓋神経、胸部、および腹部の領域4、5、6、7に迷走神経のいくつかの枝を介して一緒に移動します。彼らの内臓の終わりから、迷走者は生理学的および有害な刺激の広い範囲に応答することができます8、9、10.しかし、バジクエンセンシングに関与するシグナル伝達分子や受容体の分布は、依然として十分に特徴付けされていません。これは、迷走性神経節が、その小さなサイズにもかかわらず、多数のGPCRs8、11、12、13を含む幅広い受容体スペクトルを発現するためである。さらに、迷走性の無フェレントニューロンは本質的に異種であり、明確な分子プロファイル14を表示する。問題を複雑にするために、頸部、ペトロサル、およびノードーズ神経節がマウスに取り付けられ、それによって単一の神経節塊を形成する。最後に、動物のサブセットにおいて、無用量神経節は交感神経節15に交感神経節に付着している。
過去に、研究者は、迷走性の神経細胞16、17、18の神経化学的構成を研究するために免疫体系化学に目を向けました。検証された抗体を用いた免疫組織化学は有用であるが、免疫組織化学の研究結果は慎重に解釈されなければならない。例えば、GPCRsに対する特定の抗体を同定するための数多くの努力は、19、20、21、22、23、24、25に失敗し、研究者はGPCBに対する抗体の大半が信頼できないと結論付けました。これらの問題を回避するために、定量PCR(qPCR)は、げっ歯類迷膜神経節系質量26、27、28、29における遺伝子発現を評価するために広く使用されている。しかし、qPCRを用いた遺伝子発現の検討は、空間情報の損失を犠牲にして生じる。特に、対象となる特定の遺伝子(例えば、無用量対頸部細胞)を発現する細胞の数や細胞タイプは予測できない。また、反復的な問題としては、隣接組織との汚染や迷走神経の可変長、上頸部、および解剖15中の頸管神経節の含めることも含まれる。上記の困難の結果として、論争は、迷走性の神経細胞におけるいくつかのGPCBの発現と分布を取り巻く。特に不可解な例の1つは、グレリン受容体(Ghsr)に関する。いくつかの研究は、バガルの無フェレントニューロン30、31、32でこの受容体の広範な発現を発見しているのに対し、他の研究は、Gsr mRNAが、11,14の無用量でほとんど検出できないことが判明した。したがって、迷走神経節系質量におけるGhsr mRNAの詳細なマッピングが保証される。
また、この中で、迷走神経節塊7、11、12、33、34、35の遺伝子発現パターンを評価するためにも使用されている。RNAベースの技術は、ほとんどの状況下で抗体ベースの技術よりも信頼性が高く、特異的なままであるため、36、37、ISH研究は、迷膜の発泡神経細胞の神経化学的コーディングのより良い理解のために価値があることが証明されています。それにもかかわらず、伝統的なISH技術自体は注意点がないわけではありません。放射性ISHは敏感であるが、背景を生成し、面倒な38のままです。非放射性のISHは複雑ではなく、感度が低い38です。対照的に、最近開発されたRNAscope ISH法は高感度で、最小限の背景39を生成します。現在の研究では、マウスの迷走性の神経細胞におけるGPCBの検出に多重蛍光RNAscopeを適用した。我々は、Ghsrの分布をマッピングすることに焦点を当て、その分布をコレシストキニン受容体(Cck1r)と比較し、無用量神経節34で発現することがよく知られている別のGPCRである。最後に、2つの転写因子は、ペアドライホメオボックス2b(Phox2b)およびPRドメインジンクフィンガータンパク質12(Prdm12)と、それぞれ14個の無用量および頸状の帯状神経細胞に対する選択マーカーとして使用した。Phox2bまたはPrdm12を視覚化しなければ、確実に頸部対無用量のアフェレントを特定することは困難です。潜在的な技術的な落とし穴についても、記事全体で説明されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

本研究では、マウスの 遺伝子 組み換え(ISH)における多重化のプロトコルを説明し、特にGタンパク質共役受容体(GPCRs)の発現を検出することに重点を置いた。ホルマリン固定頸部-結節神経節は、RNAscope技術を用いて処理され、2つの代表的なGPDR(コレシストキニンおよびグレリン受容体)の発現を、ノードーズ(ペアドホメオボックス2b、Phox2b)または頸管失フェルニューロン(PRドメイン亜鉛フィンガータンパク質12、Prdm12)の1つのマーカー遺伝子と組み合わせて同時に検出した。標識された神経素は、前述の転写物の分布および発現パターンを決定するために共焦点顕微鏡を用いて画像化した。簡単に言えば、Phox2bのアッフェレントニューロンは、コレシストキニン受容体(Cck1r)を豊富に発現するが、グレリン受容体(Ghsr)を豊富に発現しないことが判明した。Prdm12の小さなサブセットの発泡性ニューロンは、Ghsrおよび/またはCck1rを発現することも発見された。この記事で説明されているアプローチは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成する際に科学者を助けるかもしれません。

RNAScopeは、年齢、性別、または遺伝的背景を持つ動物に適用できますが、若い成人(生後3ヶ月 <)と一緒に働くことをお勧めします。これは、蛍光性アーチファクト(例えば、リポフスチン)が古い動物41のニューロンにおける一般的な知見であるからである。古いマウスからのホルマリン固定神経節は、多くの場合、本物の染色と間違えられやすい驚くほど強烈な内因性蛍光を?...

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Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

この手順は非常に敏感であり、最小限の背景を持ついくつかのトランスクリプトの可視化を可能にする。この方法は、非常に異種細胞型の転写プロファイルの正確な地図を生成することができる。この手順を実証することは、私と研究室の研究技術者であるジョンソン・ボブ・マヌエルです。解剖スコープと手術器具の助けを借りて、8週齢のマウスから8週間前のマウスから全迷走神経節塊を収集することから始めます。マウスの切断後、小さな鉗子を使用して、後頭部の骨を露出させるために、気管に向けてステノヒロイドおよびオモヨイド筋肉を取り除く。頸動脈、迷走および低光沢神経および前門のマグナムが見えるまで、筋肉および組織の領域全体をクリアする。その後、小さな春のはさみで低光沢神経全体をカットします。口腔マグナムに近い半透明の塊として、無用量ガングリオンを見つけます。小さいはさみを使って、後頭部骨を慎重に折る。さらに、頸神経節を露出するには、視覚的なランドマークとして、頸部の表面に黒いメラノサイトを見つけます。神経節が見つかったら、迷走神経節系の間の神経の付着を切断し、迷走神経の末端を優しく引っ張りながら、神経節系質量全体の抽出のために小さなスプリングハサミで脳幹に向かって頸神経節を切断する。結合組織、神経節性質量および迷走神経に付着した脂肪を除去する。迷走神経の約半分のセンチメートルを維持し、サンプルの取り扱いと局在化を容易にします。1.5ミリメートルマイクロ遠心管の細かい鉗子の助けを借りて神経節に除去を置きます。そして、24時間ホルマリンで摂氏4度でインキュベートします。そして、24時間30%スクロースで。インキュベーション後、アルミホイルの上に最適な切削温度媒体の4ミリメートル直径のドロップ内に神経節を配置します。そして、ドライアイスのベッドの上にサンプルをフレーズ。凍結したサンプルを凍結したサンプルを氷像で14マイクロメートルの厚さのセクションにマイナス20°Cで切り、ガラス顕微鏡スライド上の切片を42マイクロメートル離れたところに集めます。PBSの組織切片でスライドをすすいでください。そして、ベーキングオーブンで摂氏60度で30分間焼きます。その後、4%ホルマリンにスライドを4°Cで15分間後置きします。スライドを50%70%、100%エタノールでそれぞれ5分間連続脱水します。そして、二重蒸留水ですする前に10分間、試料に過酸化水素溶液を塗布する。in situハイブリダイゼーション(ISH)では、サンプルを対象の回収試薬で5分間処理します。その後、サンプルを二重蒸留水と100%エタノールで連続して水乾燥させます。疎水性ペンを使用して、サンプルの周囲にバリアを作成します。サンプルは摂氏40度で30分間プロテアーゼとハイブリダイゼーションオーブンで処理されている間、プローブを摂氏40度で予熱し、使用前に室温で冷却します。オーブンから移動した後、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で2時間、目的のプローブの所望の組み合わせでスライドをインキュベートします。ジヒドロジピコリン酸還元法またはDapBを用いて陰性対照組織をインキュベートし、摂氏40度で2時間標的C1プローブを用いた。スライドを洗浄バッファーで洗い流し、室温でクエン酸ナトリウムを一晩5倍に保存します。翌日、増幅試薬でインキュベーションする前に、洗浄バッファーでスライドを洗い流します。そして、原稿に記載されているようにチャネル特異的試薬で治療する。スライドを洗い、DapBで30秒間洗います。次に、各スライドに取り付け媒体をすぐに塗布し、カバースリップを組織セクションの上に置きます。画像が撮れるまで、スライドホルダの組織を4°Cに水平に保ちます。必要なパラメータを設定して、画像化のための共焦点顕微鏡を準備します。画像の品質を向上させるために、4のライン平均と1024 x 1024以上のピクセルサイズで画像を取得します。取得パラメータに満足したら、同じ設定を使用して画像の取得を開始します。各チャネルに誤った色を設定して、視覚化を容易にします。デジタル画像を用いて、DapBで軽く染色された1つの核を有するRNAスコープ陽性プロファイルの輪郭を同定して細胞カウントを行う。各転写物を発現するRNAスコープ陽性プロファイルの割合を計算します。最適な集録パラメータは、陰性対照組織で得られた非特異的蛍光に基づいて、各レーザーに対して選択された。若年成人マウスの無用量神経節における内因性蛍光は最小限である。DapBプローブを用いたインキュベーションとは、シグナルをもたらさなかった。488ナノメートルレーザーで増加したパワーレーザーとゲインで、不要な背景とランダムな蛍光ドットが表示されます。RNAスコープ技術は、迷走神経節塊の組織切片における3つの遺伝子を検出するために適用された。組織プロファイルはGHSRおよびCCK1Rに陽性であった。プロファイルには、ノドーズガングリオンのロストラル部分にPhox2bおよびCCK1Rトランスクリプトの両方が含まれていました。無用量無フェレントニューロンにおける多重ISHの結果として、Phox2bシグナルは、特に無用量神経節に位置する無フェレントニューロンに蓄積された。CCK1R シグナルは、無用量神経節の多くのニューロンを強烈に標識した。低倍率では、低いCCK1RまたはGSHR信号を発現する細胞は容易に観察できなかった。DapBは、組織を視覚化し、大きく軽く染色された核を持つ迷走性の無呼吸ニューロンを同定するのに役立ちました。高倍率では、Phox2b陽性プロファイルが明らかである。プロファイル2および3は、高および中等度のCCK1Rシグナルを有するPhox2b細胞である。プロファイル4は、GHSRおよびCCK1Rの両方を発現した。頸管不フェレントニューロンの多重化のISHの結果として、PRDM12転写産物は、頸神経節に位置する不発泡ニューロンに特異的に蓄積されて見ることができた。高倍率では、CCK1Rの中程度の信号がプロファイル1と2で検出されました。プロファイル3は、CCK1RまたはGHSRに対する陰性のPRDM12細胞の代表である。解剖の一貫性は重要な要素です。イメージング取得パラメータが望ましくないバックグラウンド信号を生成しないことを確認することも同様に重要です。多重化イン・シン・ハイブリダイゼーションは、特に神経解剖学の分野において確立された分子におけるゴールドスタンダードとなっている。この方法は、免疫体化学と容易に組み合わせることができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

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二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

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Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

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Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

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Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

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Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

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ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

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Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

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Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

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検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

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マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

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