Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Núcleo de Neuronatomia/Histologia/Injeção Cerebral financiado pela concessão do NIH #5P01DK119130-02. Os autores gostariam de reconhecer a assistência do UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (liderado pelo Dr. Phelps) e sua equipe (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), apoiado em parte pelo NIH Grant #1S10OD021684-01, um recurso compartilhado do Centro de Câncer Harold C. Simmons, apoiado em parte por uma subvenção de apoio ao Centro de Câncer NCI, P30 CA142543.

NOTA: Os camundongos utilizados neste estudo eram machos do tipo selvagem em um fundo C57BL/6J puro. Um total de 4 camundongos foram usados para multiplex ISH. Todos os ratos tinham aproximadamente 8 semanas de idade na época do sacrifício. Um rato macho (aproximadamente um ano de idade) também foi usado para demonstrar fluorescência endógena associada ao envelhecimento. Os animais estavam alojados em gaiolas ventiladas dentro de uma instalação de barreira com acesso a ad libitum a alimentos e água. O Co...

A técnica do ISH foi inventada no final da década de 196042. No entanto, não é até meados da década de 1980 que foi aplicado para a detecção de mRNAs nos sistemas nervosos central e periférico43,44. Considerando a heterogeneidade do sistema nervoso e questões recorrentes com anticorpos, a localização de uma transcrição específica no nível celular continua sendo uma ferramenta inestimável. No entanto, os métodos tradiciona...

Os corpos celulares de afferents vagais estão contidos na jugular, petrosal e nodose ganglia1,2,3. Seus axônios viajam juntos através de vários ramos do nervo vago para os territórios craniocervical, torácico e abdominal4,5,6,7. A partir de seus finais viscerais, os aferentes vagais podem responder a uma ampla gama de estímulos fisiológicos e nocivos8,9,10. No entanto, a distribuição de moléculas de sinalização e receptores envolvidos no sensor de detecção vagal permanece pouco caracterizada. Isso ocorre em parte porque os gânglios vagais, apesar de seu pequeno tamanho, expressam um amplo espectro de receptores, incluindo um grande número de GPCRs8,11,12,13. Além disso, os neurônios aferentes vagal são inerentemente heterogêneos e apresentam perfis moleculares distintos14. Para complicar a questão, a jugular, petrosal e nodose gânglios estão presos no rato, formando assim uma única massa gangliônica. Por último, em um subconjunto de animais, o gânglio de nodose é ligado ao simpático gânglio cervical superior15.
No passado, os pesquisadores recorreram à imunohistoquímica para estudar a maquiagem neuroquímica dos neurônios aferentesvagal 16,17,18. Embora a imunohistoquímica usando anticorpos validados seja útil, os resultados de estudos imunohistoquímicos devem ser interpretados com cautela. Por exemplo, inúmeros esforços para identificar anticorpos específicos contra GPCRs falharam19,20,21,22,23,24,25, levando os investigadores a concluir que a maioria dos anticorpos contra GPCRs não são confiáveis. Para contornar essas questões, o PCR quantitativo (qPCR) tem sido amplamente utilizado para avaliar a expressão genética na massa gangliônica do rodente vagal26,27,28,29. No entanto, examinar a expressão genética usando qPCR ocorre ao custo de uma perda de informações espaciais. Em particular, não se pode prever quantas células ou quais tipos de células expressam um determinado gene de interesse (por exemplo, nodose vs. células jugulares). As questões recorrentes também incluem a contaminação com tecidos adjacentes e a inclusão de comprimentos variáveis do nervo vago, gânglio cervical superior e jugular durante a dissecação15. Como resultado das dificuldades acima, a controvérsia envolve a expressão e distribuição de vários GPCRs em neurônios aferentes vagal. Um exemplo particularmente intrigante diz respeito ao receptor de grelina (Ghsr). Considerando que alguns estudos encontraram expressão generalizada deste receptor em neurônios aferentes vagal30,31,32, outros descobriram que Ghsr mRNA é quase indetectável no gânglio nodose11,14. O mapeamento detalhado do MRNA ghsr na massa gânnica vagal é, portanto, justificado.
A hibridização in situ (ISH) também tem sido utilizada para avaliar padrões de expressão genética na massa gânnica vagal7,11,12,33,34,35. Como as técnicas baseadas em RNA permanecem mais confiáveis e específicas do que as técnicas baseadas em anticorpos na maioria das circunstâncias36,37, estudos do ISH têm se mostrado valiosos para uma melhor compreensão da codificação neuroquímica de neurônios aferentes vagais. No entanto, as técnicas tradicionais do ISH em si não são sem ressalvas. O ISH radioativo é sensível, mas gera antecedentes e permanece pesado38. O ISH não radioativo é menos complicado, mas também menos sensível38. Em contraste, o método RNAscope ISH recentemente desenvolvido é altamente sensível e gera um mínimo de fundo39. O presente estudo aplicou o RNAscope fluorescente multiplex à detecção de GPCRs em neurônios aferentes do camundongo. Focamos no mapeamento da distribuição de Ghsr e comparamos sua distribuição com a do receptor de colecistocina (Cck1r), outro GPCR bem conhecido por ser expresso no gânglio34. Por fim, os dois fatores de transcrição, homeobox emparelhado 2b (Phox2b) e proteína de dedo de zinco de domínio pr 12 (Prdm12), foram usados como marcadores seletivos para neurônios aferentes de nodose e jugular,respectivamente 14. Sem visualizar Phox2b ou Prdm12, seria desafiador identificar as diferenças jugular vs. nodose com certeza. Potenciais armadilhas técnicas também são discutidas ao longo do artigo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

Este estudo descreve um protocolo para o multiplex in situ hibridização (ISH) do gânglio jugular-nodose do mouse, com ênfase especial na detecção da expressão de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A gália jugular-nodose com formalina fixa foi processada com a tecnologia RNAscope para detectar simultaneamente a expressão de dois GPCRs representativos (receptores de colecistocina e grelina) em combinação com um gene marcador de nodose (homeobox emparelhado 2b, Phox2b) ou neurônios afferent (proteína de dedo de zinco 12, Prdm12). Os gânglios rotulados foram imagens usando microscopia confocal para determinar os padrões de distribuição e expressão das transcrições acima mencionadas. Resumidamente, os neurônios aferentes phox2b foram encontrados para expressar abundantemente o receptor de colecistocina (Cck1r), mas não o receptor de grelina (Ghsr). Um pequeno subconjunto de neurônios aferentes Prdm12 também foi encontrado para expressar Ghsr e/ou Cck1r. Potenciais ressalvas técnicas no projeto, processamento e interpretação do MULTIPLEX ISH são discutidas. A abordagem descrita neste artigo pode ajudar os cientistas a gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Embora o RNAScope possa ser aplicado a animais de qualquer idade, sexo ou origem genética, é aconselhável trabalhar com adultos jovens (<3 meses de idade). Isso ocorre porque artefatos fluorescentes (por exemplo, lipofuscina) são achados comuns em neurônios de animais mais velhos41. Os gânglios fixos formalina de camundongos mais velhos geralmente contêm fluorescência endógena surpreendentemente intensa que pode ser facilmente confundida com coloração genuína(Figur...

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Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Este procedimento é altamente sensível e permite uma visualização de várias transcrições com mínimo de fundo. Este método pode gerar mapas precisos do perfil transcricional de tipos de células altamente heterogêneas. Demonstrando o procedimento, seremos eu e Johnson Bob-manuel, um técnico de pesquisa no laboratório.Comece coletando toda a massa gânrmônica vagal do rato de oito semanas de cada lado, com a ajuda de um escopo dissecando e instrumentos cirúrgicos. Após a decapitação do camundongo, use pequenos fórceps para remover o esternohyide e os músculos omohióides laterais à traqueia para expor o osso occipital. Limpe toda a região dos músculos e tecidos até que a artéria carótida, o nervo vago e hipoglossal e o foramen magnum sejam visíveis.Em seguida, corte todo o nervo hipoglossal com uma pequena tesoura de mola. Localize para o gânglio de nodose como uma massa translúcida perto do foramen magnum. Usando uma tesoura pequena, quebre cuidadosamente o osso occipital.Para expor ainda mais o gânglio jugular, localize melanócitos negros na superfície da jugular como um marco visual. Quando os gânglios são encontrados, corte os laços nervosos entre a massa gangliônica vagal e puxe suavemente a extremidade periférica do nervo vago enquanto simultaneamente corta o gânglio jugular em direção ao tronco cerebral com pequenas tesouras de mola para a extração de toda a massa gangliônica. Remova o tecido conjuntivo, a massa gangliônica e a gordura grudada no nervo vago.Mantendo aproximadamente meio centímetro do nervo vago para facilitar o manuseio e localização das amostras. Coloque a remoção para gânglios com a ajuda de fórceps finos em tubos de micro centrífugas de 1,5 milímetros. E incubar a 4 graus celsius em formalina por 24 horas.E depois com 30% de sacarose por 24 horas. Após a incubação, posicione o gânglio dentro de uma gota de quatro milímetros de diâmetro de meio de temperatura de corte ideal em um pedaço de papel alumínio. E frase a amostra em um leito de gelo seco.Corte as amostras congeladas com um criostat em seções de 14 micrômetros de espessura a menos 20 graus Celsius e colete as seções de corte nos slides do microscópio de vidro como três séries de 42 micrômetros de distância. Enxágüe as lâminas com seções teciduais em PBS. E asse por 30 minutos a 60 graus Celsius em um forno de cozimento.Em seguida, poste os slides em 4% de formalina por 15 minutos a quatro graus Celsius. Desidratar em série os slides em 50%70% e 100% etanol por cinco minutos cada. E aplique a solução de peróxido de hidrogênio nas amostras por 10 minutos antes de enxaguar em água dupla destilada.Para hibridização In situ, ou ISH, trate as amostras com o reagente de recuperação de destino por cinco minutos. Em seguida, enxágue sequencialmente as amostras em água dupla destilada e 100% etanol seguido de secagem de ar. Usando uma caneta hidrofóbica, crie uma barreira ao redor das amostras.Enquanto as amostras estão sendo tratadas com protease por 30 minutos a 40 graus Celsius e um forno de hibridização, pré-aquecimento as sondas a 40 graus Celsius e esfriá-las à temperatura ambiente antes do uso. Depois de sair do forno, incubar os slides com a combinação desejada de sondas-alvo por duas horas a 40 graus Celsius em um forno de hibridização. Incubar tecido de controle negativo com a reductase dihidrodipicolinate ou DapB, sonda C1 alvo por duas horas a 40 graus Celsius.Enxágüe os slides no tampão de lavagem e armazene em cinco vezes o citrato de sódio salino à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, enxágue os slides com tampão de lavagem antes da incubação com reagentes de amplificação. E tratar com reagentes específicos do canal como descrito no manuscrito.Lave os slides seguidos de tratamento com DapB por 30 segundos. Em seguida, aplique imediatamente o meio de montagem em cada slide e coloque um deslizamento de cobertura sobre a seção de tecido. Mantenha os tecidos horizontais em um suporte de slides a quatro graus Celsius até a imagem.Prepare um microscópio confocal para imagens definindo os parâmetros necessários. Adquira as imagens com uma média de quatro linhas e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 até 1024 para melhorar a qualidade das imagens. Uma vez satisfeito com os parâmetros de aquisição, comece a adquirir as imagens usando as mesmas configurações.Atribua cores falsas a cada canal para facilitar a visualização. Usando as imagens digitais, realize a contagem de células identificando o contorno de perfis positivos do escopo RNA com um núcleo levemente manchado com DapB. Calcule a porcentagem de perfis positivos de escopo de RNA expressando cada transcrição.Os parâmetros de aquisição ideais foram escolhidos para cada laser com base na fluorescência inespecífica obtida no tecido de controle negativo. A fluorescência endógena no gânglio de nodose de um rato adulto jovem é mínima. E a incubação com uma sonda DapB, não resultou em sinais.Com o aumento do laser de potência e ganho com o laser de 488 nanômetros, o fundo indesejado e os pontos fluorescentes aleatórios aparecem. A técnica de escopo de RNA foi aplicada para detectar três genes em seções teciduais da massa gangliônica vagal. O perfil tecidual foi positivo para GHSR e CCK1R.O perfil incluía transcrições de Phox2b e CCK1R na parte rostral do gânglio nodose. Como resultado do multiplex ISH em neurônios diferentes, sinais de Phox2b especificamente acumulados em neurônios diferentes, localizados no gânglio de nodose. Os sinais CCK1R rotularam intensamente muitos neurônios no gânglio de nodose.Em baixa ampliação, as células expressando sinais baixos de CCK1R ou GSHR não puderam ser observadas facilmente. DapB ajudou a visualizar o tecido e identificar neurônios vagos com um núcleo grande e levemente manchado. Em alta ampliação, perfis positivos de Phox2b são evidentes.Os perfis dois e três são células Phox2b com sinais CCK1R altos e moderados. O perfil quatro expressou ghsr e CCK1R. Como resultado do multiplex ISH dos neurônios aferentes jugular, a transcrição PRDM12 pôde ser vista especificamente acumulada em neurônios diferentes localizados no gânglio jugular.Na alta ampliação, foram detectados sinais moderados para CCK1R nos perfis um e dois. O perfil três é um representante de células PRDM12 negativas para CCK1R ou GHSR. A consistência da dissecção é um fator importante.É igualmente importante verificar se os parâmetros de aquisição de imagens não geram sinais de fundo indesejados. Multiplex A hibridização in situ tornou-se o padrão-ouro em molecular estabelecido, especialmente no campo da neuroanatomia. Este método pode ser facilmente combinado com a imunohistoquímica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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