Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization at JoVE.com

Эта работа была поддержана Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core, финансируемой грантом NIH #5P01DK119130-02. Авторы хотели бы отметить помощь Юго-западного центра визуализации живых клеток UT (возглавляемого доктором Фелпсом) и его сотрудников (Абхиджит Бугде и Марсель Меттлен), частично поддерживаемых грантом NIH Grant #1S10OD021684-01, общим ресурсом Онкологического центра Гарольда С. Симмонса, частично поддерживаемым грантом поддержки онкологического центра NCI, P30 CA142543.

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами дикого типа на чистом фоне C57BL/6J. В общей сложности 4 мыши были использованы для мультиплексного ISH. Всем мышам было примерно 8 недель на момент жертвоприношения. Один самец мыши (примерно годовалый) также использовался дл?...

Техника ISH была изобретена в конце 1960-х годов42года. Однако только в середине 1980-х годов он был применен для обнаружения мРНК в центральной и периферической нервной системах43,44. Учитывая неоднородность нервной системы и повторяющиеся проблем?...

Клеточные тела вагусных афферентов содержатся в яремных, петрозальных и узловыхганглиях 1,2,3. Их аксоны путешествуют вместе через несколько ветвей блуждающего нерва в краниоцервикальную, грудную и брюшную зоны4,5,6,7. Из своих висцеральных окончаний вагусные афференты могут реагировать на широкий спектр физиологических и вредных раздражителей8,9,10. Однако распределение сигнальных молекул и рецепторов, участвующих в вагусном зондировании, остается плохо охарактеризованным. Отчасти это связано с тем, что вагусные ганглии, несмотря на свои небольшие размеры, экспрессируют широкий спектр рецепторов, включая большое количество GPCR8,11,12,13. Кроме того, вагусные афферентные нейроны по своей природе неоднородны и имеют различные молекулярные профили14. Чтобы усложнить дело, яремные, петрозальные и узловые ганглии прикрепляются к мыши, образуя тем самым единую ганглионную массу. Наконец, у подмножества животных узелковый ганглий прикреплен к симпатическому верхнему шейному ганглию15.
В прошлом исследователи обращались к иммуногистохимии для изучения нейрохимического состава вагусных афферентных нейронов16,17,18. Хотя иммуногистохимия с использованием валидированных антител полезна, результаты иммуногистохимических исследований следует интерпретировать с осторожностью. Например, многочисленные усилия по выявлению специфических антител против GPCR потерпели неудачу19,20,21,22,23,24,25,что привело исследователей к выводу, что большинство антител против GPCR ненадежны. Чтобы обойти эти проблемы, количественная ПЦР (qPCR) широко используется для оценки экспрессии генов у ганглионной массы блуждающего блуждающего нерва26,27,28,29. Однако изучение экспрессии генов с помощью qPCR происходит за счет потери пространственной информации. В частности, невозможно предсказать, сколько клеток или какой тип (типы) клеток экспрессируют конкретный ген, представляющий интерес (например, узелковые или яремные клетки). Повторяющиеся проблемы также включают загрязнение соседними тканями и включение переменной длины блуждающего нерва, верхнего шейного отдела и яремных ганглиев во время рассечения15. В результате вышеуказанных трудностей споры окружают экспрессию и распределение нескольких GPCR в вагусных афферентных нейронах. Один особенно загадочный пример относится к рецептору грелина (Ghsr). В то время как некоторые исследования обнаружили широкую экспрессию этого рецептора в вагусных афферентных нейронах30,31,32,другие обнаружили, что мРНК Ghsr почти не обнаруживается в узловом ганглиях11,14. Поэтому детальное картирование мРНК Ghsr в ганглионной массе блуждающего нерва оправдано.
Гибридизация in situ (ISH) также использовалась для оценки паттернов экспрессии генов в вагусной ганглионной массе7,11,12,33,34,35. Поскольку методы на основе РНК остаются более надежными и специфичными, чем методы на основе антител в большинстве случаев36,37,исследования ISH оказались ценными для лучшего понимания нейрохимического кодирования вагусных афферентных нейронов. Тем не менее, традиционные техники ISH сами по себе не лишены предостережений. Радиоактивный ISH чувствителен, но генерирует фон и остается громоздким38. Нерадиоактивный ISH менее сложен, но именее чувствителен 38. Напротив, недавно разработанный метод RNAscope ISH является высокочувствительным и генерирует минимальный фон39. В текущем исследовании применялся мультиплексный флуоресцентный РНКАскоп для обнаружения GPCR в вагусных афферентных нейронах мыши. Мы сосредоточились на картировании распределения Ghsr и сравнили его распределение с распределением рецептора холецистокинина (Cck1r), другого GPCR, который, как известно, экспрессируется в узловом ганглии34. Наконец, два фактора транскрипции, пароподобный гомеобокс 2b (Phox2b) и PR-домен цинкового белка пальца 12 (Prdm12), были использованы в качестве селективных маркеров для узловых и яремных афферентных нейронов, соответственно14. Без визуализации Phox2b или Prdm12 было бы сложно с уверенностью идентифицировать яремные и узловатые афференты. Потенциальные технические подводные камни также обсуждаются на протяжении всей статьи.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

В этом исследовании описывается протокол мультиплексной гибридизации in situ (ISH) яремно-узловатых ганглиев мышей с особым акцентом на обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Формалин-фиксированные яремно-узловатые ганглии обрабатывали с помощью технологии RNAscope для одновременного обнаружения экспрессии двух репрезентативных GPCR (холецистокининовых и грелиновых рецепторов) в сочетании с одним маркерным геном либо узелка (парно-подобный гомеобокс 2b, Phox2b), либо яремных афферентных нейронов (PR-домен цинкового белка пальца 12, Prdm12). Меченые ганглии были изображены с использованием конфокальной микроскопии для определения распределения и паттернов экспрессии вышеупомянутых транскриптов. Вкратце, было обнаружено, что афферентные нейроны Phox2b обильно экспрессируют рецептор холецистокинина (Cck1r), но не рецептор грелина (Ghsr). Было также обнаружено, что небольшое подмножество афферентных нейронов Prdm12 экспрессирует Ghsr и / или Cck1r. Обсуждаются потенциальные технические предостережения при проектировании, обработке и интерпретации мультиплексного ISH. Подход, описанный в этой статье, может помочь ученым в создании точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.

В то время как RNAScope может применяться к животным любого возраста, пола или генетического фона, рекомендуется работать с молодыми людьми (<3 месяца). Это связано с тем, что флуоресцентные артефакты (например, липофусцин) являются общими находками в нейронах пожилых животных41. ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Мультиплексная гибридизация in situ (ISH) использовалась для одновременной визуализации транскриптов для двух рецепторов, связанных с G-белком, и одного фактора транскрипции во всем вагусном ганглионном комплексе взрослой мыши. Этот протокол может быть использован для создания точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.

Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Эта процедура очень чувствительна и позволяет визуализировать несколько расшифровок с минимальным фоном. Этот метод может генерировать точные карты транскрипционного профиля высоко гетерогенных типов клеток. Демонстрировать процедуру будут я и Джонсон Боб-Мануэль, техник-исследователь в лаборатории.Начните с сбора всей вагусной ганглионной массы от восьминедельной мыши с каждой стороны, с помощью рассекающего прицела и хирургических инструментов. После обезглавливания мыши используйте небольшие щипцы, чтобы удалить грудиногиоидные и омогиоидные мышцы, расположенные сбоку от трахеи, чтобы обнажить затылочную кость. Очистите всю область мышц и тканей до тех пор, пока не будут видны сонная артерия, блуждающий и подъязычный нерв и большое отверстие.Затем перережьте весь подъязычный нерв небольшими пружинными ножницами. Расположите узелковый ганглий в виде полупрозрачной массы, близкой к большому отверстию. Используя небольшие ножницы, аккуратно разбейте затылочную кость.Чтобы обнажить яремный ганглий дальше, расположите черные меланоциты на поверхности яремного столба в качестве визуального ориентира. Когда ганглии обнаружены, перережьте нервные прикрепления между вагусной ганглионной массой и осторожно потяните за периферический конец блуждающего нерва, одновременно разрезая яремный ганглий к стволу мозга небольшими пружинными ножницами для извлечения всей ганглионной массы. Удалите соединительную ткань, ганглионную массу и жир, прилипший к блуждающему нерву.Сохранение примерно полусантиметра блуждающего нерва для облегчения обработки и локализации образцов. Поместите удаление в ганглии с помощью тонких щипцов в 1,5-миллиметровые микроцентрифужные трубки. И инкубировать при четырех градусах Цельсия в формалине в течение 24 часов.А затем с 30% сахарозой в течение 24 часов. После инкубации расположите ганглии внутри капли диаметром четыре миллиметра оптимальной температуры режущей среды на куске алюминиевой фольги. И фраза образца на ложе сухого льда.Разрезайте замороженные образцы с помощью криостата на участки толщиной 14 микрометров при минус 20 градусах Цельсия и соберите разрезанные участки на предметных стеклах микроскопа в виде трех серий на расстоянии 42 микрометров друг от друга. Промойте слайды срезами тканей в PBS. И выпекать 30 минут при температуре 60 градусов Цельсия в духовке для выпечки.Затем постфиксируйте слайды в 4%-ном формалине в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Последовательно обезвоживайте слайды в 50%70% и 100% этаноле в течение пяти минут каждый. И нанесите раствор перекиси водорода на образцы в течение 10 минут перед промывкой в двойной дистиллированной воде.Для гибридизации In situ, или ISH, обработайте образцы целевым реагентом извлечения в течение пяти минут. Затем последовательно промывайте образцы в двойной дистиллированной воде и 100% этаноле с последующей сушкой на воздухе. Используя гидрофобную ручку, создайте барьер вокруг образцов.В то время как образцы обрабатываются протеазой в течение 30 минут при 40 градусах Цельсия и печью гибридизации, предварительно разогрейте зонды при 40 градусах Цельсия и охладите их при комнатной температуре перед использованием. После выхода из духовки инкубируйте слайды с нужной комбинацией целевых зондов в течение двух часов при 40 градусах Цельсия в гибридизационной печи. Инкубируйте отрицательную контрольную ткань с дигидродипиколинатредуктазой или DapB, мишенью зонда C1 в течение двух часов при 40 градусах Цельсия.Промойте слайды в буфере для стирки и храните в пятикратном физиологическом растворе цитрат натрия при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день промыть горки промывочным буфером перед инкубацией с амплификационными реагентами. И лечить канальными специфическими реагентами, как описано в рукописи.Вымойте слайды с последующей обработкой DapB в течение 30 секунд. Затем сразу же нанесите монтажную среду на каждый слайд и поместите крышку на участок ткани. Держите ткани горизонтально в держателе слайда при четырех градусах Цельсия до получения изображения.Подготовьте конфокальный микроскоп для визуализации, установив необходимые параметры. Получайте изображения с усреднением линий четыре и размером пикселя не менее 1024 на 1024 для улучшения качества изображений. Убедившись в параметрах получения, начните получать изображения, используя те же настройки.Приписывайте ложные цвета каждому каналу для облегчения визуализации. Используя цифровые изображения, выполните подсчет клеток, идентифицируя контур положительных профилей области РНК с одним ядром, слегка окрашенным DapB. Рассчитайте процент положительных профилей области РНК, выражающих каждую расшифровку.Оптимальные параметры сбора были выбраны для каждого лазера на основе неспецифической флуоресценции, полученной в отрицательной контрольной ткани. Эндогенная флуоресценция в узловом ганглии молодой взрослой мыши минимальна. И инкубация с помощью зонда DapB не привела к сигналам.При повышенной мощности лазера и усилении с 488-нанометровым лазером появляются нежелательные фоновые и случайные флуоресцентные точки. Метод РНК-скопа был применен для обнаружения трех генов в тканевых участках вагусной ганглионной массы. Профиль тканей был положительным для GHSR и CCK1R.Профиль включал транскрипты Phox2b и CCK1R в ростральной части узелкового ганглия. В результате мультиплекса ISH в узловых афферентных нейронах сигналы Phox2b специфически накапливались в афферентных нейронах, расположенных в узловом ганглии. Сигналы CCK1R интенсивно мечили многие нейроны в узловом ганглии.При низком увеличении клетки, экспрессирующие низкие сигналы CCK1R или GSHR, не могли легко наблюдаться. DapB помог визуализировать ткань и идентифицировать вагусные афферентные нейроны с большим и слегка окрашенным ядром. При большом увеличении положительные профили Phox2b очевидны.Второй и третий профили представляют собой ячейки Phox2b с высокими и умеренными сигналами CCK1R. Четвертый профиль выражал как GHSR, так и CCK1R. В результате мультиплексного ISH яремных афферентных нейронов транскрипт PRDM12 можно было увидеть специфически накопленным в афферентных нейронах, расположенных в яремном ганглии.При большом увеличении умеренные сигналы для CCK1R были обнаружены в профилях один и два. Третий профиль является представителем клеток PRDM12, отрицательных для CCK1R или GHSR. Консистенция рассечения является важным фактором.Не менее важно убедиться, что параметры получения изображений не генерируют нежелательные фоновые сигналы. Мультиплексная гибридизация In situ стала золотым стандартом в молекулярных установках, особенно в области нейроанатомии. Этот метод можно легко сочетать с иммуногистохимией.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Дважды флуоресценции На месте Гибридизация в пресной разделы мозга

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Объединение Липофильные краситель, На месте Гибридизация, иммуногистохимии, и гистологии

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Обнаружение генома и стенограммы о стойких вирусов ДНК в нейронных тканей люминесцентными В месте Гибридизация сочетании с Иммуноокрашивание

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Обнаружение Axonally локализованного мРНК в срезах мозга с помощью высоким разрешением<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Сочетание Double Флуорецсенция<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация с Immunolabelling для обнаружения экспрессии трех генов в мышином Срезы мозга

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Экстракорпоральное записи мезентериального афферентными нервными активность у мышей тощей и ободочной кишки Сегменты

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Локализация генов-рецепторов одоранта в аутоантителе с помощью РНК<em&gt; Разное</em&gt; Гибридизация

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Идентификация Дофаминовый рецептор D1-альфа в пределах грызунов прилежащем инновационные РНК в месте обнаружения технологии

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...