Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financiado por la subvención de los NIH #5P01DK119130-02. Los autores desean agradecer la asistencia del UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (encabezado por el Dr. Phelps) y su personal (Abhijit Bugde y Marcel Mettlen), apoyado en parte por la Subvención nih #1S10OD021684-01, un recurso compartido del Centro Oncológico Harold C. Simmons, apoyado en parte por una subvención de apoyo del Centro Oncológico del NCI, P30 CA142543.

NOTA: Los ratones utilizados en este estudio eran machos de tipo salvaje en un fondo puro de C57BL / 6J. Se utilizaron un total de 4 ratones para multiplex ISH. Todos los ratones tenían aproximadamente 8 semanas de edad en el momento del sacrificio. También se utilizó un ratón macho (aproximadamente de un año de edad) para demostrar la fluorescencia endógena asociada con el envejecimiento. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas dentro de una instalación de barrera con acceso ad libitum a alimen...

La técnica de ISH fue inventada a finales de la década de 196042. Sin embargo, no es hasta mediados de la década de 1980 que se aplicó para la detección de ARNm en los sistemas nerviosos central y periférico43,44. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del sistema nervioso y los problemas recurrentes con los anticuerpos, la localización de una transcripción particular a nivel celular sigue siendo una herramienta invaluable. No obstan...

Los cuerpos celulares de los aferentes vagales están contenidos en los ganglios yugular, petrosal y nodosis1,2,3. Sus axones viajan juntos a través de varias ramas del nervio vago a los territorios craneocervicical, torácico y abdominal4,5,6,7. Desde sus terminaciones viscerales, las aferencias vagales pueden responder a una amplia gama de estímulos fisiológicos y nocivos8,9,10. Sin embargo, la distribución de las moléculas de señalización y los receptores involucrados en la detección vagagal sigue estando mal caracterizada. Esto se debe en parte a que los ganglios vagales, a pesar de su pequeño tamaño, expresan un amplio espectro de receptores, incluyendo un gran número de GPCR8,11,12,13. Además, las neuronas aferentes vagales son inherentemente heterogéneas y muestran perfiles moleculares distintos14. Para complicar el asunto, los ganglios yugular, petrosal y nodoso se unen en el ratón, formando así una sola masa ganglionar. Por último, en un subconjunto de animales, el ganglio de la nodosa está unido al ganglio cervical superior simpático15.
En el pasado, los investigadores han recurrido a la inmunohistoquímica para estudiar la composición neuroquímica de las neuronas aferentes vagales16,17,18. Si bien la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos validados es útil, los resultados de los estudios inmunohistoquímicos deben interpretarse con precaución. Por ejemplo, numerosos esfuerzos para identificar anticuerpos específicos contra los GPCR han fallado19,20,21,22,23,24,25,lo que lleva a los investigadores a concluir que la mayoría de los anticuerpos contra los GPCR no son confiables. Para eludir estos problemas, la PCR cuantitativa (qPCR) se ha utilizado ampliamente para evaluar la expresión génica en la masa ganglionar vagal de roedores26,27,28,29. Sin embargo, el examen de la expresión génica utilizando qPCR ocurre a costa de una pérdida de información espacial. En particular, no se puede predecir cuántas células o qué tipo de célula expresan un gen particular de interés (por ejemplo, nodosa vs. células yugulares). Los problemas recurrentes también incluyen la contaminación con tejidos adyacentes y la inclusión de longitudes variables del nervio vago, los ganglios cervicales superiores y yugulares durante la disección15. Como resultado de las dificultades anteriores, la controversia rodea la expresión y distribución de varios GPCR en neuronas aferentes vagales. Un ejemplo particularmente desconcertante se relaciona con el receptor de grelina (Ghsr). Mientras que algunos estudios han encontrado una expresión generalizada de este receptor en las neuronas aferentes vagales30,31,32,otros han encontrado que el ARNm de Ghsr es casi indetectable en el ganglio de la nodosis11,14. Por lo tanto, se justifica un mapeo detallado del ARNm de Ghsr en la masa ganglionar vagal.
La hibridación in situ (ISH) también se ha utilizado para evaluar patrones de expresión génica en la masa ganglionar vagal7,11,12,33,34,35. Debido a que las técnicas basadas en ARN siguen siendo más confiables y específicas que las técnicas basadas en anticuerpos en la mayoría de las circunstancias36,37, los estudios de ISH han demostrado ser valiosos para una mejor comprensión de la codificación neuroquímica de las neuronas aferentes vagales. Sin embargo, las técnicas tradicionales de ISH en sí mismas no están exentas de advertencias. La ISH radiactiva es sensible pero genera fondo y sigue siendo engorrosa38. La ISH no radiactiva es menos complicada pero también menos sensible38. En contraste, el método RNAscope ISH recientemente desarrollado es altamente sensible y genera un fondo mínimo39. El estudio actual aplicó RNAscope fluorescente multiplex a la detección de GPCR en neuronas aferentes vagales del ratón. Nos centramos en mapear la distribución de Ghsr y comparamos su distribución con la del receptor de colecistoquinina (Cck1r), otro GPCR bien conocido por expresarse en el ganglio de la nodosis34. Por último, los dos factores de transcripción, homeobox 2b (Phox2b) y proteína 12 del dedo de zinc del dominio PR (Prdm12), se utilizaron como marcadores selectivos para las neuronas aferentes de nodosa y yugular, respectivamente14. Sin visualizar Phox2b o Prdm12, sería difícil identificar las aferencias yugulares frente a las nodosas con certeza. Las posibles trampas técnicas también se discuten a lo largo del artículo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

Este estudio describe un protocolo para la hibridación multiplex in situ (ISH) de los ganglios yugulares-nodosis de ratón, con un énfasis particular en la detección de la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los ganglios de yugular-nodosa fijados con formalina se procesaron con la tecnología RNAscope para detectar simultáneamente la expresión de dos GPCR representativos (receptores de colecistoquinina y grelina) en combinación con un gen marcador de nodosa (homeobox 2b, Phox2b) o neuronas aferentes yugulares (proteína de dedo de zinc de dominio PR 12, Prdm12). Los ganglios marcados fueron fotografiados utilizando microscopía confocal para determinar la distribución y los patrones de expresión de las transcripciones antes mencionadas. Brevemente, se encontró que las neuronas aferentes Phox2b expresan abundantemente el receptor de colecistoquinina (Cck1r) pero no el receptor de grelina (Ghsr). También se encontró que un pequeño subconjunto de neuronas aferentes Prdm12 expresan Ghsr y / o Cck1r. Se discuten posibles advertencias técnicas en el diseño, procesamiento e interpretación de multiplex ISH. El enfoque descrito en este artículo puede ayudar a los científicos a generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Si bien RNAScope se puede aplicar a animales de cualquier edad, sexo o antecedentes genéticos, es recomendable trabajar con adultos jóvenes (<3 meses de edad). Esto se debe a que los artefactos fluorescentes (por ejemplo, lipofuscina) son hallazgos comunes en las neuronas de animales mayores41. Los ganglios fijados con formalina de ratones más viejos a menudo contienen una fluorescencia endógena sorprendentemente intensa que puede confundirse fácilmente con una tinción genuina<strong class="...

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Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization (Video) | JoVE

Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Este procedimiento es altamente sensible y permite una visualización de varias transcripciones con un fondo mínimo. Este método puede generar mapas precisos del perfil transcripcional de tipos de células altamente heterogéneas. Demostrando el procedimiento estaremos Johnson Bob-manuel y yo, un técnico de investigación en el laboratorio.Comience recolectando toda la masa ganglionar vagal del ratón de ocho semanas de edad de cada lado, con la ayuda de un endoscopio de disección e instrumentos quirúrgicos. Después de la decapitación del ratón, use pinzas pequeñas para eliminar el esternohioideo y los músculos omohioides laterales a la tráquea para exponer el hueso occipital. Limpie toda la región de músculos y tejidos hasta que la arteria carótida, el nervio vago e hipogloso y el foramen magnum sean visibles.Luego corte todo el nervio hipogloso con pequeñas tijeras de resorte. Localice el ganglio de la dosis como una masa translúcida cerca del foramen magnum. Usando tijeras pequeñas, rompa cuidadosamente el hueso occipital.Para exponer aún más el ganglio yugular, ubique los melanocitos negros en la superficie de la yugular como un hito visual. Cuando se encuentren los ganglios, corte las uniones nerviosas entre la masa ganglionar vagal y tire suavemente del extremo periférico del nervio vago mientras corta simultáneamente el ganglio yugular hacia el tronco encefálico con pequeñas tijeras de resorte para la extracción de toda la masa ganglionar. Retire el tejido conjuntivo, la masa ganglionar y la grasa que se adhieren al nervio vago.Manteniendo aproximadamente medio centímetro del nervio vago para facilitar el manejo y localización de las muestras. Coloque el removedor a los ganglios con la ayuda de fórceps finos en tubos de micro centrífuga de 1,5 milímetros. E incubar a cuatro grados centígrados en formalina durante 24 horas.Y luego con 30% de sacarosa durante 24 horas. Después de la incubación, coloque los ganglios dentro de una gota de un diámetro de cuatro milímetros de medio de temperatura de corte óptima en una pieza de papel de aluminio. Y frasee la muestra en un lecho de hielo seco.Corte las muestras congeladas con un criostato en secciones de 14 micrómetros de espesor a menos 20 grados centígrados y recoja las secciones cortadas en los portaobjetos de microscopio de vidrio como tres series separadas por 42 micrómetros. Enjuague los portaobjetos con secciones de tejido en PBS. Y hornea durante 30 minutos a 60 grados centígrados en un horno de hornear.Luego, coloque las diapositivas en 4% de formalina durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deshidratar en serie los portaobjetos en 50%70% y 100% etanol durante cinco minutos cada uno. Y aplique la solución de peróxido de hidrógeno a las muestras durante 10 minutos antes de enjuagar en agua destilada doble.Para la hibridación in situ, o ISH, trate las muestras con el reactivo de recuperación objetivo durante cinco minutos. Luego enjuague secuencialmente las muestras en agua destilada doble y etanol 100%, seguido de secado al aire. Usando una pluma hidrofóbica, cree una barrera alrededor de las muestras.Mientras las muestras se tratan con proteasa durante 30 minutos a 40 grados centígrados y un horno de hibridación, precalentar las sondas a 40 grados centígrados y enfriarlas a temperatura ambiente antes de su uso. Después de salir del horno, incube las diapositivas con la combinación deseada de sondas objetivo durante dos horas a 40 grados centígrados en un horno de hibridación. Incubar tejido de control negativo con la dihidrodipicolinato reductasa o DapB, sonda C1 objetivo durante dos horas a 40 grados centígrados.Enjuague los portaobjetos en tampón de lavado y guárdelo cinco veces citrato de sodio salino a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, enjuague las diapositivas con tampón de lavado antes de la incubación con reactivos de amplificación. Y tratar con reactivos específicos del canal como se describe en el manuscrito.Lave los portaobjetos seguido de un tratamiento con DapB durante 30 segundos. Luego aplique inmediatamente el medio de montaje en cada diapositiva y coloque un deslizamiento de cubierta sobre la sección de tejido. Mantenga los tejidos horizontales en un portaobjetos a cuatro grados centígrados hasta la toma de imágenes.Prepare un microscopio confocal para la obtención de imágenes estableciendo los parámetros requeridos. Adquiera las imágenes con un promedio de cuatro líneas y un tamaño de píxeles de al menos 1024 para 1024 para mejorar la calidad de las imágenes. Una vez satisfecho con los parámetros de adquisición, comience a adquirir las imágenes utilizando la misma configuración.Atribuye colores falsos a cada canal para facilitar la visualización. Utilizando las imágenes digitales, realice el conteo celular identificando el contorno de los perfiles positivos del alcance del ARN con un núcleo ligeramente teñido con DapB. Calcule el porcentaje de perfiles positivos de ARN que expresan cada transcripción.Se eligieron los parámetros óptimos de adquisición para cada láser en función de la fluorescencia inespecífica obtenida en el tejido de control negativo. La fluorescencia endógena en el ganglio de nodosis de un ratón adulto joven es mínima. Y la incubación con una sonda DapB, no dio lugar a señales.A mayor potencia láser y ganancia con el láser de 488 nanómetros, aparecen fondos no deseados y puntos fluorescentes aleatorios. Se aplicó la técnica de alcance de ARN para detectar tres genes en secciones tisulares de la masa ganglionar vagal. El perfil tisular fue positivo para GHSR y CCK1R.El perfil incluyó transcripciones de Phox2b y CCK1R en la parte rostral del ganglio de la nodosis. Como resultado del ISH multiplex en las neuronas aferentes nodosas, las señales Phox2b se acumularon específicamente en las neuronas aferentes, ubicadas en el ganglio de la nodosis. Las señales CCK1R marcaron intensamente muchas neuronas en el ganglio de la nodosis.A bajo aumento, las células que expresaban señales bajas de CCK1R o GSHR no se podían observar fácilmente. DapB ayudó a visualizar el tejido e identificar neuronas aferentes vagales con un núcleo grande y ligeramente teñido. A gran aumento, los perfiles positivos de Phox2b son evidentes.Los perfiles dos y tres son células Phox2b con señales CCK1R altas y moderadas. El perfil cuatro expresó tanto GHSR como CCK1R. Como resultado del ISH múltiplex de las neuronas aferentes yugulares, la transcripción PRDM12 se pudo ver específicamente acumulada en neuronas aferentes ubicadas en el ganglio yugular.A gran aumento, se detectaron señales moderadas para CCK1R en los perfiles uno y dos. El perfil tres es un representante de las células PRDM12 negativas para CCK1R o GHSR. La consistencia de la disección es un factor importante.Es igualmente importante verificar que los parámetros de adquisición de imágenes no generen señales de fondo no deseadas. La hibridación multiplex in situ se ha convertido en el estándar de oro en el establecimiento molecular, especialmente en el campo de la neuroanatomía. Este método se puede combinar fácilmente con inmunohistoquímica.

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