Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Forfatterne takker Bucknell University og Institut for Kemi for deres støtte til dette arbejde.

1. Forbered analyseløsninger til skærmen
BEMÆRK: Koncentrationerne af substrater, der anvendes i dette assay, kan tilpasses. For RFTS-manglende DNMT1 er de eksperimentelt bestemte Km-værdier for hårnålens DNA-substrat og SAM 1-2 nM og 2 μM, henholdsvis26,40.
<ol><li>Der fremstilles 600 μL af hver analysetilstand, der testes i mikrocentrifugerør på is. BEMÆRK: Den samlede mængde analyseopløs...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disease-associated+germline+mutations+on+structure+function+relationship+of+DNA+methyltransferases.">Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases.</a> Genes. 10 (5), 369 (2019).</li><li>Foulks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+drug+discovery:+targeting+DNA+methyltransferases.">Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).</li><li>Goll, M. G., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+cytosine+methyltransferases.">Eukaryotic cytosine methyltransferases.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).</li><li>Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+human+DNA+Methyltransferase+(dnmt1)+gene.">Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene.</a> Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).</li><li>Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+3'-untranslated+element+mediates+growth+regulation+of+DNA+methyltransferase+1+and+inhibits+its+transforming+activity.">A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).</li><li>MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+methylation+by+the+Ras+signaling+pathway.">Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).</li><li>Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+is+a+downstream+effector+of+cellular+transformation+triggered+by+simian+virus+40+large+T+antigen.">DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).</li><li>Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genetic+suppression+of+polyp+formation+and+reduction+of+CpG-island+hypermethylation+in+Apc(Min/+)+Dnmt1-hypomorphic+mice.">Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice.</a> Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).</li><li>MacLeod, A. R., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+antisense+to+DNA+methyltransferase+mRNA+induces+DNA+demethylation+and+inhibits+tumorigenesis.">Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).</li><li>Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumorigenesis+by+a+cytosine-DNA,+methyltransferase,+antisense+oligodeoxynucleotide.">Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).</li><li>Ley, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).</li><li>Walter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+DNMT3A+mutations+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).</li><li>Russler-Germain, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R882H+DNMT3A+mutation+associated+with+AML+dominantly+inhibits+wild-type+DNMT3A+by+blocking+its+ability+to+form+active+tetramers.">The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers.</a> Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).</li><li>Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3b+overexpression+contributes+to+a+hypermethylator+phenotype+in+human+breast+cancer+cell+lines.">DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.</a> Molecular Cancer. 7, 15 (2008).</li><li>Nosho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3B+expression+might+contribute+to+CpG+island+methylator+phenotype+in+colorectal+cancer.">DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.</a> Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).</li><li>Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+methylation+with+small+molecules:+what's+next.">Targeting DNA methylation with small molecules: what's next.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).</li><li>Chuang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S110,+a+5-Aza-2'-deoxycytidine-containing+dinucleotide,+is+an+effective+DNA+methylation+inhibitor+in+vivo+and+can+reduce+tumor+growth.">S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).</li><li>Issa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+guadecitabine+(SGI-110)+in+patients+with+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukaemia:+a+multicentre,+randomised,+dose-escalation+phase+1+study.">Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study.</a> Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).</li><li>Datta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+quinoline-based+DNA+hypomethylating+agents+reactivates+tumor+suppressor+genes+by+blocking+DNA+methyltransferase+1+activity+and+inducing+its+degradation.">A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation.</a> Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).</li><li>Zambrano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+hydralazine+to+demethylate+and+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes.">A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes.</a> BMC Cancer. 5, 44 (2005).</li><li>Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procainamide+is+a+specific+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).</li><li>Asgatay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+analogues+of+N-phthaloyl-l-tryptophan+(RG108)+as+inhibitors+of+DNA+methyltransferase+1.">Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C5-DNA+methyltransferase+inhibitors:+from+screening+to+effects+on+zebrafish+embryo+development.">C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development.</a> Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).</li><li>Fagan, R. L., Wu, M., Ch&#233;din, F., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+high+throughput+screen+for+DNA+methyltransferase+1-targeted+molecular+probes.">An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes.</a> PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).</li><li>Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccaic+acid+A+is+a+direct,+DNA-competitive+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).</li><li>Eglen, R. M., Reisine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+compounds+that+modulate+epigenetic+regulation+of+the+transcriptome:+an+overview.">Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).</li><li>Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DNA+methyltransferase+(DNMT3A)+observed+in+acute+myeloid+leukemia+patients+disrupt+processive+methylation.">Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).</li><li>Norvil, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3b+methylates+DNA+by+a+noncooperative+mechanism,+and+its+activity+is+unaffected+by+manipulations+at+the+predicted+dimer+interface.">Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface.</a> Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).</li><li>Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+details+of+the+DNA+recognition+by+the+Dnmt1+DNA+methyltransferase.">Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase.</a> FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain.">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li><li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+(SRA)+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA.">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li><li>Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+threonine+1505+in+the+catalytic+domain+stabilizes+mouse+DNA+methyltransferase+1.">Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Dnmt1+for+methylation+of+hemimethylated+CpG+sites+resides+in+its+catalytic+domain.">Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain.</a> Chemistry &amp; Biology. 19 (5), 572-578 (2012).</li><li>Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+mutations+G589A+and+V590F+relieve+replication+focus+targeting+sequence-mediated+autoinhibition+of+DNA+methyltransferase+1.">Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1.</a> Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).</li><li>Kilgore, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNMT1+selective+antagonists+using+a+novel+scintillation+proximity+assay.">Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+inhibitors+of+DNA+methylation+by+screening+of+a+chemical+library.">Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).</li><li>Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+kinetic+assay+for+protein+and+DNA+methyltransferase+enzymatic+activities.">A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 8, 56 (2015).</li><li>Syeda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replication+focus+targeting+sequence+(RFTS)+domain+is+a+DNA-competitive+inhibitor+of+Dnmt1.">The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).</li><li>Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituted+anthraquinones+represent+a+potential+scaffold+for+DNA+methyltransferase+1-specific+inhibitors.">Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors.</a> PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).</li></ol>

For at identificere og karakterisere hæmmere af DNA-methyltransferaser skal enzymets aktivitet måles. Der findes flere metoder til undersøgelse af DNA-methyltransferaseaktivitet. Aktivitet overvåges almindeligvis ved hjælp af radioaktivitet; overførsel af den mærkede methylgruppe af SAM kan kvantificeres 29,30,31,32,33,34.</...

DNA-methylering er et vigtigt epigenetisk mærke, der regulerer genekspression og kromatinstruktur. Methylering forekommer overvejende i CpG-dinukleotider - cytosin efterfulgt af guanosin; methylgruppen tilsættes til 5-positionen af cytosin. Korrekte DNA-methyleringsmønstre og dermed korrekt genekspression er nødvendige for passende cellulær udvikling og funktion. Mange sygdomstilstande har været forbundet med ændringer i det normale methyleringsmønster 1,2,3. For eksempel er der en sammenhæng mellem kræftinitiering og progression og ændringer i DNA-methyleringsmønsteret. Typisk udviser kræftceller lavere samlede niveauer af methylcytosin, hvilket bidrager til genom ustabilitet. Samtidig er methylcytosinet, der er til stede i genomet, koncentreret i promotorregionerne af tumorundertrykkende gener, hvilket fører til genhæmning af disse vigtige proteiner. Især er epigenetiske ændringer dynamiske og reversible, i modsætning til DNA-mutationerne forbundet med tumorigenese. Dette har gjort proteinerne involveret i epigenetisk genregulering interessante lægemiddelmål 2,4.
DNA-methyltransferaser (DNMT'er) er de proteiner, der er ansvarlige for at generere og opretholde DNA-methyleringsmønstre. Tre katalytisk aktive isozymer, DNMT1, DNMT3a og DNMT3b, findes hos mennesker. Under udvikling og differentiering etablerer de novo methyltransferaserne, DNMT3a og DNMT3b, methyleringsmønstre. Begge enzymer kan binde det katalytisk inaktive DNMT3L-protein til dannelse af komplekser, der udviser øget aktivitet 1,5. Efter celledeling indeholder datterceller hemimethyleret DNA - DNA indeholdende methylcytosin i kun en streng af duplexet - fordi det nyligt syntetiserede DNA er blottet for methyleringsmærker. DNMT1's vigtigste funktion er at methylere dette hemimethylerede DNA og dermed genetablere det fulde methyleringsmønster 1,5.
Forbindelser mellem DNMT-aktivitet og kræft er veletablerede. Overekspression af DNMT1, enten ved transkriptionelle eller posttranslationelle mekanismer, er en konsekvens af flere almindelige onkogene veje 6,7,8,9. Genetiske tilgange til lavere DNMT1-aktivitet ved hjælp af hypomorfe alleler resulterer i nedsat tumordannelse i Apc (Min) mus10. Antisense oligonukleotider, der knockdown DNMT1 hæmmer neoplasi i cellekultur og musetumormodeller11,12. Således virker hæmning af DNMT1-aktivitet som en lovende tilgang til kræftbehandling. De roller, som DNMT3 isozymer spiller, er dog ikke så ligetil. DNMT3a mutationer findes i akut myeloid leukæmi13 og myelodysplastisk syndrom14. Mindst en af de identificerede mutationer har vist sig at mindske DNA-methyleringsaktiviteten af enzymet15. DNMT3b er imidlertid overudtrykt i brystkræft16 og kolorektal cancer17. Da de forskellige DNMT-isozymer spiller forskellige roller i carcinogenese, vil identifikation af isozymespecifikke hæmmere være kritisk. Ikke alene vil disse forbindelser være nyttige til udvikling af terapi, men isozymspecifikke hæmmere ville også være et uvurderligt redskab til at dissekere hver DNMT-isozyms rolle i kræftetiologi.
Flere DNMT-hæmmere er blevet rapporteret i litteraturen. Kendte DNMT-hæmmere kan opdeles i to klasser: nukleosid og ikke-nukleosid. Nukleosidhæmmere er typisk cytidinanaloger. Disse forbindelser er inkorporeret i DNA og kovalent fælde DNMT'er. 5-azacytidin og 5-aza-2'-deoxycytidin er blevet godkendt til behandling af myelodysplastisk syndrom og akut myeloid leukæmi 4,18. Den høje toksicitet, lave biotilgængelighed og kemisk ustabilitet af disse forbindelser udgør problemer. Igangværende arbejde undersøger effektiviteten af den næste generation af nukleosidhæmmere; SGI-110, afledt af 5-aza-2'-deoxycytidin, er et eksempel 19,20. Nukleosidhæmmere er ikke isozymespecifikke og vil inaktivere ethvert DNMT-isozym, der opstår. Derfor resulterer behandling med et nukleosid-demethyleringsmiddel i udtømning af alle DNMT-isozymer 4,18. Ikke-nukleosidhæmmere behøver ikke at blive inkorporeret i DNA for at udøve deres hæmmende virkninger. I stedet binder disse molekyler direkte til DNMT'er, hvilket introducerer muligheden for isozymspecifik hæmning. Flere ikke-nukleosidhæmmere er blevet opdaget til dato, herunder SGI-102721, hydralazin 22, procainamid 23, RG108 og derivater 24 og naturlige produkter, (-)-epigallocatechin 3-gallat (EGCG)25 og laccainsyre A 26,27. De fleste af de ikke-nukleosidhæmmere, der er opdaget til dato, er ikke isozymeselektive eller viser svage præferencer for et DNMT-isozym. Derudover skal styrken af disse molekyler forbedres, især i celler 4,18. Der er således behov for at opdage eller udvikle mere potente, isozymeselektive DNMT-hæmmere.
En hindring for at opdage nye små molekylehæmmere af DNMT'er er de besværlige assays, der traditionelt bruges til at undersøge DNMT-aktivitet28. Assays er normalt diskontinuerlige med flere trin. Den enzymatiske aktivitet af DNMT'er analyseres stadig rutinemæssigt ved anvendelse af radioaktivt S-adenosylmethionin (SAM)29,30,31,32,33,34. Ikke-radioaktive assays til DNA-methylering er også blevet udviklet. For eksempel er assays, der anvender methylfølsomme begrænsningsendonukleaser og elektroforese til at adskille fordøjelsesprodukterne, blevet beskrevet35,36. Disse typer diskontinuerlige, multistep assays er ikke let modtagelige for lægemiddelopdagelse. Siden midten af 2000'erne er der udviklet flere DNA-methyleringsassays med en højere gennemstrømning28. Et scintillationsnærhedsassay blev brugt til at screene for DNMT1-hæmmere37. Et andet assay ved hjælp af en methylfølsom restriktionsendonuklease blev brugt til at screene for DNMT3a-hæmmere25,38. Mens begge assays tillod højere gennemstrømning end traditionelle DNA-methyleringsassays, kræver assays flere trin og tillader ikke observation af methyleringsaktivitet i realtid. For nylig er der beskrevet et kontinuerligt kinetikassay, der kobler dannelsen af S-adenosylhomocystein (SAH), et produkt af methyleringsreaktionen, til den spektroskopiske ændring ved 340 nm forbundet med NADPH-oxidation39. Dette assay bruger tre koblingsenzymer til at generere et spektroskopisk signal.
Vi udviklede et fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay, der anvender et enkelt kommercielt tilgængeligt koblingsenzym og kan generere data i realtid (figur 1). Et hårnål oligonukleotid indeholdende tre methylcytosiner anvendes som substrat. Substrat-DNA'et indeholder en fluorophore i 5'-enden og en slukker i 3'-enden. Methylering af det hemimethylerede CpG-sted genererer spaltningsstedet for endonuklease Gla I - fuldt methyleret GCGC. Gla I-spaltning af produktet oligonukleotid frigiver fluoroforen fra slukningsenheden og genererer fluorescens i realtid. Analysen kan bruges til at undersøge aktiviteten af enhver isoform af DNMT; der observeres dog højere aktivitet med DNMT1, da dette isozyme fortrinsvis methylerer hemimethyleret DNA 1,5. Endnu mere robust aktivitet observeres, hvis det autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) domæne fjernes fra DNMT1. Dette domæne, der findes i den N-terminale regulatoriske region, binder til det katalytiske sted og forhindrer DNA-binding. Fjernelse af de første ~600 aminosyrer resulterer i et afkortet enzym, der er signifikant mere aktivt end enzymet i fuld længde (~640 gange stigning i kkat/Km)40. Denne aktiverede form af enzymet, kaldet RFTS-manglende DNMT1 (aminosyrer 621–1616), giver mulighed for lettere identifikation af hæmmere på grund af dets øgede katalytiske kraft. Dette papir præsenterer en protokol til at bruge RFTS-manglende DNMT1 i assays til at screene for potentielle små molekylehæmmere. Ved anvendelse af det endonukleasekoblede kontinuerlige assay bestemmes starthastigheden i nærvær og fravær af nogle få små molekyler. Hver potentiel hæmmer undersøges ved to koncentrationer for at se efter koncentrationsafhængig DNMT1-hæmning. Den procentvise aktivitet, der blev observeret i nærværelse af de små molekyler, blev beregnet i hvert enkelt tilfælde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Figur 1: DNA-methyleringsassay. Et hemimethyleret hårnål-DNA med en fluorophore i 5'-enden og en quencher i 3'-enden bruges som substrat. DNMT1 katalyserer overførslen af methylgruppen fra S-adenosylmethionin til det ikke-methylerede CpG-sted og genererer S-adenosylhomocystein og fuldt methyleret DNA. DNA-produktet indeholder spaltningsstedet for endonuklease Gla I, som spalter fuldt methylerede GCGC-steder. Spaltning af produkt-DNA'et frigiver 5'-fluoroforen fra 3'-slukningsenheden og genererer fluorescens. Forkortelser: Fl = fluorophore; Q = quencher; DNMT1 = DNA-methyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionin; SAH = S-adenosylhomocystein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

DNA-methylering, en form for epigenetisk genregulering, er vigtig for normal cellulær funktion. I celler etablerer og opretholder proteiner kaldet DNA-methyltransferaser (DNMT'er) DNA-methyleringsmønsteret. Ændringer i det normale DNA-methyleringsmønster er forbundet med kræftudvikling og progression, hvilket gør DNMT'er potentielle kræftlægemiddelmål. Således er identifikation og karakterisering af nye små molekylehæmmere af disse enzymer af stor betydning. Dette papir præsenterer en protokol, der kan bruges til at screene for DNA-methyltransferasehæmmere. Det kontinuerlige koblede kinetikassay gør det muligt at bestemme initialhastigheder af DNA-methylering i nærvær og fravær af potentielle små molekylehæmmere. Analysen bruger den methylfølsomme endonuklease Gla I til at koble methylering af et hemimethyleret DNA-substrat til fluorescensgenerering.
Dette kontinuerlige assay gør det muligt at overvåge enzymaktivitet i realtid. Gennemførelse af analysen i små mængder i mikrotiterplader reducerer omkostningerne ved reagenser. Ved hjælp af dette assay blev der udført en lille eksempelskærm for hæmmere af DNMT1, det mest rigelige DNMT-isozym hos mennesker. Det stærkt substituerede anthraquinon naturlige produkt, laccainsyre A, er en potent, DNA-konkurrencedygtig hæmmer af DNMT1. Her undersøger vi tre potentielle små molekylehæmmere - anthraquinoner eller anthraquinonlignende molekyler med en til tre substituenter - i to koncentrationer for at beskrive analyseprotokollen. Indledende hastigheder bruges til at beregne den procentvise aktivitet, der observeres i nærværelse af hvert molekyle. En af tre undersøgte forbindelser udviser koncentrationsafhængig hæmning af DNMT1-aktivitet, hvilket indikerer, at det er en potentiel hæmmer af DNMT1.

Aktiv DNMT1 er en forudsætning for denne analyse. RFTS-manglende DNMT1 blev udtrykt i E.coli og oprenset til homogenitet efter tidligere offentliggjorte procedurer41. For at sikre, at det oprensede enzym var aktivt, blev et diskontinuerligt endonukleasekoblet assay brugt til at undersøge DNA-methyleringsaktivitet36. Dette assay anvender et 32 basepar duplex DNA med en enkelt hemimethyleret CpG placeret i et Sau3A1 spaltningssted. Sau3A1 kan spalte det hemimethyle...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA-methyltransferaser er potentielle kræftlægemiddelmål. Her præsenteres en protokol til vurdering af små molekyler til DNA-methyltransferasehæmning. Dette assay anvender en endonuklease til at koble DNA-methylering til fluorescensgenerering og gør det muligt at overvåge enzymaktivitet i realtid.

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Et robust pladelæserassay som vores er meget nyttigt til den indledende screening af potentielle methyltransferasehæmmere. Evnen til at indsamle data i realtid er en stor fordel ved det kontinuerlige endonukleasekoblede assay. Start med at forberede 600 mikroliter af analysebetingelserne indeholdende 20 mikromolære og 50 mikromolære forbindelser separat i mikrocentrifugerørene på is.For at gøre dette tilsættes dobbelt destilleret vand og 5X methyleringsbuffer til hvert rør for at opnå en endelig koncentration af 1X methyleringsbuffer. Derefter tilsættes 3,15 mikroliter 20 milligram pr. milliliter bovin serumalbumen eller BSA til hver prøve. Derefter tilsættes to mikroliter 3,15 mikromolært hårnål-DNA-substrat og 1,33 mikroliter 4,75 mikromolær S-adenosylmethionin eller SAM til hver prøve.Der tilsættes inhibitor til de relevante prøver for at opnå en endelig koncentration på 21 mikromolære eller 52,5 mikromolære og en tilsvarende mængde dimethylsulfoxid eller DMSO til en kontrolprøve, inden opløsningerne blandes ved hvirveldannelse ved 3.000 rotationer pr. minut i tre sekunder. Drej derefter prøverne i et par sekunder i en bordbordminicentrifuge ved 1.200 gange G for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret. Aliquot 95 mikroliter af hver analyseopløsning i seks på hinanden følgende brønde i et sort halvt område 96 brøndplade.Der fremstilles 75 mikroliter Gla I eller DNMT1 plus Gla I enzymopløsning i mikrocentrifugerørene som beskrevet før til en endelig koncentration af engangsbuffer. Derefter tilsættes 1,2 mikroliter 10 enheder pr. mikroliter Gla I til hver opløsning for at opnå en endelig koncentration på 0,16 enheder pr. mikroliter. Der tilsættes 0,6 mikroliter fem mikromolære RFTS-manglende DNMT1 til DNMT1 plus Gla I-opløsningen for en endelig koncentration på 40 nanomolarer.Efter skånsom blanding drejes prøverne i et par sekunder i en bordplade minicentrifuge ved 1.200 G for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret. Derefter aliquot 12 mikroliter af hver enzymopløsning i seks brønde i en koniskbundet 96 brøndplade. Til methyleringsanalysen af DNA-prøven forvarmes pladelæseren til 37 grader Celsius.Indsæt derefter den sorte plade, der indeholder analyseopløsningerne, i pladelæseren. Efter at have rystet pladen ved 425 CPM, måles fluorescensen med en excitationsbølgelængde på 485 nanometer og en emissionsbølgelængde på 528 nanometer. Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius i fem minutter.Fjern analysepladen fra pladelæseren, og tilsæt fem mikroliter enzymopløsning til hver brønd, efterfulgt af blanding af opløsningen ved pipettering op og ned. Indsæt pladen i pladelæseren, og ryst pladen, før du registrerer fluorescensen hvert 53. sekund i 30 minutter. Opnå den gennemsnitlige fluorescens af de tredobbelte Gla I-kontrolassays for hver tilstand og trække den gennemsnitlige Gla I, der indeholder kontrolreaktionsbakker, fra de tredobbelte spor, der er opnået i nærværelse af RFTS-manglende DNMT1.Bestem derefter gennemsnits- og standardfejlen for middelværdien for de korrigerede replikater. Afbild det gennemsnitlige korrigerede reaktionsspor, og tilpas den indledende lineære del til en linje for at bestemme starthastigheden. Bestem den procentvise aktivitet ved at dividere hastigheden observeret i nærværelse af en forbindelse med hastigheden observeret i DMSO indeholdende kontrolreaktion og multiplicere med 100.Resultaterne af et diskontinuerligt endonukleasekoblet assay viste, at fuldt methyleret produkt-DNA er beskyttet mod spaltning, hvilket bekræfter, at RFTS-manglende DNMT1 er aktiv og i stand til at methylere det hemimethylerede substrat-DNA. I det fluorescensbaserede assay, i mangel af Gla I, påvirkede tilsætningen af DNMT1 eller buffer alene ikke baggrundsfluorescensen. Efterfølgende tilføjelse af Gla I til alle assays resulterede kun i fluorescensgenerering i assays, der indeholdt DNMT1.Den samtidige tilføjelse af RFTS-manglende DNMT1 og Gla I til tre assays resulterede i robust fluorescensgenerering. Tilsætningen af Gla I alene frembragte ingen fluorescens. For at screene for potentielle hæmmere blev DNA-methyleringsaktiviteten af RFTS-manglende DNMT1 undersøgt i nærværelse af DMSO, forbindelse et, forbindelse to eller forbindelse tre ved 20 og 50 mikromolære koncentrationer.De forbindelser, der reducerer fluorescensgenerering i dette koblede assay, skal valideres yderligere. At sikre, at forbindelserne ikke hæmmer koblingsenzymet, er et vigtigt næste skridt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En Fluorescens-baseret assay phospholipid Scramblase Aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet Assay ved hjælp af nær-infrarødt fluorescerende mærket DNA visualiseret af acrylamid Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Et Fluorogenic peptid kavalergang Assay til at screene for proteolytiske aktivitet: ansøgninger om coronavirus spike protein aktivering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA-glycosylaseassay ved matrixassisteret laserdesorption/ionisering Time-of-flight Massespektrometrianalyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spektroskopi til undersøgelse af DNA-proteininteraktioner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Klar til brug qPCR til påvisning af DNA fra Trypanosoma cruzi eller andre patogene organismer

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...