Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

De auteurs bedanken Bucknell University en het Department of Chemistry voor hun steun aan dit werk.

1. Bereid testoplossingen voor het scherm voor
OPMERKING: De concentraties van substraten die in deze test worden gebruikt, kunnen worden aangepast. Voor RFTS-ontbrekende DNMT1 zijn de experimenteel bepaalde Km-waarden voor het haarspeld-DNA-substraat en SAM 1-2 nM en 2 μM, respectievelijk26,40.
<ol><li>Bereid 600 μL van elke testconditie die wordt getest in microcentrifugebuizen op ijs. OPMERKING: He...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disease-associated+germline+mutations+on+structure+function+relationship+of+DNA+methyltransferases.">Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases.</a> Genes. 10 (5), 369 (2019).</li><li>Foulks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+drug+discovery:+targeting+DNA+methyltransferases.">Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).</li><li>Goll, M. G., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+cytosine+methyltransferases.">Eukaryotic cytosine methyltransferases.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).</li><li>Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+human+DNA+Methyltransferase+(dnmt1)+gene.">Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene.</a> Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).</li><li>Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+3'-untranslated+element+mediates+growth+regulation+of+DNA+methyltransferase+1+and+inhibits+its+transforming+activity.">A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).</li><li>MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+methylation+by+the+Ras+signaling+pathway.">Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).</li><li>Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+is+a+downstream+effector+of+cellular+transformation+triggered+by+simian+virus+40+large+T+antigen.">DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).</li><li>Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genetic+suppression+of+polyp+formation+and+reduction+of+CpG-island+hypermethylation+in+Apc(Min/+)+Dnmt1-hypomorphic+mice.">Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice.</a> Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).</li><li>MacLeod, A. R., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+antisense+to+DNA+methyltransferase+mRNA+induces+DNA+demethylation+and+inhibits+tumorigenesis.">Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).</li><li>Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumorigenesis+by+a+cytosine-DNA,+methyltransferase,+antisense+oligodeoxynucleotide.">Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).</li><li>Ley, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).</li><li>Walter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+DNMT3A+mutations+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).</li><li>Russler-Germain, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R882H+DNMT3A+mutation+associated+with+AML+dominantly+inhibits+wild-type+DNMT3A+by+blocking+its+ability+to+form+active+tetramers.">The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers.</a> Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).</li><li>Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3b+overexpression+contributes+to+a+hypermethylator+phenotype+in+human+breast+cancer+cell+lines.">DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.</a> Molecular Cancer. 7, 15 (2008).</li><li>Nosho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3B+expression+might+contribute+to+CpG+island+methylator+phenotype+in+colorectal+cancer.">DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.</a> Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).</li><li>Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+methylation+with+small+molecules:+what's+next.">Targeting DNA methylation with small molecules: what's next.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).</li><li>Chuang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S110,+a+5-Aza-2'-deoxycytidine-containing+dinucleotide,+is+an+effective+DNA+methylation+inhibitor+in+vivo+and+can+reduce+tumor+growth.">S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).</li><li>Issa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+guadecitabine+(SGI-110)+in+patients+with+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukaemia:+a+multicentre,+randomised,+dose-escalation+phase+1+study.">Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study.</a> Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).</li><li>Datta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+quinoline-based+DNA+hypomethylating+agents+reactivates+tumor+suppressor+genes+by+blocking+DNA+methyltransferase+1+activity+and+inducing+its+degradation.">A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation.</a> Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).</li><li>Zambrano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+hydralazine+to+demethylate+and+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes.">A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes.</a> BMC Cancer. 5, 44 (2005).</li><li>Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procainamide+is+a+specific+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).</li><li>Asgatay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+analogues+of+N-phthaloyl-l-tryptophan+(RG108)+as+inhibitors+of+DNA+methyltransferase+1.">Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C5-DNA+methyltransferase+inhibitors:+from+screening+to+effects+on+zebrafish+embryo+development.">C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development.</a> Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).</li><li>Fagan, R. L., Wu, M., Ch&#233;din, F., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+high+throughput+screen+for+DNA+methyltransferase+1-targeted+molecular+probes.">An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes.</a> PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).</li><li>Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccaic+acid+A+is+a+direct,+DNA-competitive+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).</li><li>Eglen, R. M., Reisine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+compounds+that+modulate+epigenetic+regulation+of+the+transcriptome:+an+overview.">Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).</li><li>Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DNA+methyltransferase+(DNMT3A)+observed+in+acute+myeloid+leukemia+patients+disrupt+processive+methylation.">Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).</li><li>Norvil, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3b+methylates+DNA+by+a+noncooperative+mechanism,+and+its+activity+is+unaffected+by+manipulations+at+the+predicted+dimer+interface.">Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface.</a> Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).</li><li>Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+details+of+the+DNA+recognition+by+the+Dnmt1+DNA+methyltransferase.">Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase.</a> FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain.">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li><li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+(SRA)+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA.">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li><li>Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+threonine+1505+in+the+catalytic+domain+stabilizes+mouse+DNA+methyltransferase+1.">Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Dnmt1+for+methylation+of+hemimethylated+CpG+sites+resides+in+its+catalytic+domain.">Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain.</a> Chemistry &amp; Biology. 19 (5), 572-578 (2012).</li><li>Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+mutations+G589A+and+V590F+relieve+replication+focus+targeting+sequence-mediated+autoinhibition+of+DNA+methyltransferase+1.">Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1.</a> Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).</li><li>Kilgore, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNMT1+selective+antagonists+using+a+novel+scintillation+proximity+assay.">Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+inhibitors+of+DNA+methylation+by+screening+of+a+chemical+library.">Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).</li><li>Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+kinetic+assay+for+protein+and+DNA+methyltransferase+enzymatic+activities.">A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 8, 56 (2015).</li><li>Syeda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replication+focus+targeting+sequence+(RFTS)+domain+is+a+DNA-competitive+inhibitor+of+Dnmt1.">The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).</li><li>Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituted+anthraquinones+represent+a+potential+scaffold+for+DNA+methyltransferase+1-specific+inhibitors.">Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors.</a> PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).</li></ol>

Om remmers van DNA-methyltransferasen te identificeren en te karakteriseren, moet de activiteit van het enzym worden gemeten. Er bestaan verschillende methoden voor het onderzoeken van DNA-methyltransferase-activiteit. Activiteit wordt vaak gecontroleerd met behulp van radioactiviteit; overdracht van de gelabelde methylgroep van SAM kan worden gekwantificeerd 29,30,31,32,33,34.<sup c...

DNA-methylatie is een belangrijk epigenetisch merkteken dat genexpressie en chromatinestructuur reguleert. Methylering treedt voornamelijk op in CpG-dinucleotiden - cytosine gevolgd door guanosine; de methylgroep wordt toegevoegd aan de 5-positie van cytosine. Correcte DNA-methylatiepatronen, en dus de juiste genexpressie, zijn nodig voor een geschikte cellulaire ontwikkeling en functie. Veel ziektetoestanden zijn in verband gebracht met veranderingen in het normale methylatiepatroon 1,2,3. Er is bijvoorbeeld een verband tussen kankerinitiatie en progressie en veranderingen in het DNA-methylatiepatroon. Typisch, kankercellen vertonen lagere algemene niveaus van methylcytosine, die bijdraagt aan genoominstabiliteit. Tegelijkertijd is de methylcytosine die aanwezig is in het genoom geconcentreerd in de promotorregio's van tumorsuppressorgenen, wat leidt tot gen-uitschakeling van deze belangrijke eiwitten. Met name epigenetische veranderingen zijn dynamisch en omkeerbaar, in tegenstelling tot de DNA-mutaties geassocieerd met tumorigenese. Dit heeft de eiwitten die betrokken zijn bij epigenetische genregulatie interessante medicijndoelen 2,4 gemaakt.
DNA-methyltransferasen (DNT's) zijn de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het genereren en onderhouden van DNA-methylatiepatronen. Drie katalytisch actieve isozymen, DNMT1, DNMT3a en DNMT3b, bestaan bij mensen. Tijdens de ontwikkeling en differentiatie stellen de de novo methyltransferasen, DNMT3a en DNMT3b, methylatiepatronen vast. Beide enzymen kunnen het katalytisch inactieve DNMT3L-eiwit binden om complexen te vormen die verhoogde activiteit vertonen 1,5. Na celdeling bevatten dochtercellen hemimethylated DNA - DNA dat methylcytosine bevat in slechts één streng van de duplex - omdat het nieuw gesynthetiseerde DNA verstoken is van methylatiemarkeringen. De belangrijkste functie van DNMT1 is om dit gehemimethyleerde DNA te methyleren, waardoor het volledige methylatiepatroonwordt hersteld 1,5.
Verbanden tussen DNMT-activiteit en kanker zijn goed vastgesteld. Overexpressie van DNMT1, hetzij door transcriptionele of posttranslationele mechanismen, is een gevolg van verschillende veel voorkomende oncogene routes 6,7,8,9. Genetische benaderingen voor lagere DNMT1-activiteit met behulp van hypomorfe allelen resulteren in verminderde tumorvorming bij Apc(Min)-muizen10. Antisense oligonucleotiden die DNMT1 afstoten remmen neoplasie in celkweek en muistumormodellen 11,12. Het remmen van DNMT1-activiteit lijkt dus een veelbelovende benadering van kankertherapie. De rollen die de DNMT3-isozymen spelen, zijn echter niet zo eenvoudig. DNMT3a mutaties worden gevonden bij acute myeloïde leukemie13 en myelodysplastisch syndroom14. Van ten minste één van de geïdentificeerde mutaties is aangetoond dat het de DNA-methylatieactiviteit van het enzym15 vermindert. DNMT3b is echter overexpressie bij borstkanker16 en colorectale kanker17. Omdat de verschillende DNMT-isozymen verschillende rollen spelen in carcinogenese, zal het identificeren van isozymspecifieke remmers van cruciaal belang zijn. Niet alleen zullen deze verbindingen nuttig zijn voor de ontwikkeling van therapeutica, maar isozymspecifieke remmers zouden ook een waardevol hulpmiddel zijn om de rol van elk DNMT-isozym in de kankeretiologie te ontleden.
Verschillende DNMT-remmers zijn gemeld in de literatuur. Bekende DNMT-remmers kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: nucleoside en niet-nucleoside. Nucleosideremmers zijn meestal cytidine-analogen. Deze verbindingen zijn opgenomen in DNA en vangen covalent DNMT's. 5-azacytidine en 5-aza-2'-deoxycytidine zijn goedgekeurd voor de behandeling van myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie 4,18. De hoge toxiciteit, lage biologische beschikbaarheid en chemische instabiliteit van deze verbindingen leveren problemen op. Lopend onderzoek is naar de werkzaamheid van de volgende generatie nucleosideremmers; SGI-110, afgeleid van 5-aza-2'-deoxycytidine, is een voorbeeld19,20. Nucleosideremmers zijn niet isozymspecifiek en zullen elk DNMT-isozym dat wordt aangetroffen inactiveren. Daarom resulteert behandeling met een nucleoside-demethylerend middel in de uitputting van alle DNMT-isozymen 4,18. Niet-nucleosideremmers hoeven niet in het DNA te worden opgenomen om hun remmende effecten uit te oefenen. In plaats daarvan binden deze moleculen zich rechtstreeks aan DNT's, waardoor de mogelijkheid voor isozymspecifieke remming wordt geïntroduceerd. Tot op heden zijn verschillende niet-nucleosideremmers ontdekt, waaronder SGI-102721, hydralazine22, procaïnamide23, RG108 en derivaten24, en natuurlijke producten, (−)-epigallocatechine 3-gallaat (EGCG)25 en laccaïnezuur A26,27. De meeste niet-nucleosideremmers die tot nu toe zijn ontdekt, zijn niet isozymselectief of vertonen zwakke voorkeuren voor één DNMT-isozym. Bovendien moet de potentie van deze moleculen worden verbeterd, vooral in cellen 4,18. Er is dus behoefte aan het ontdekken of ontwikkelen van krachtigere, isozymselectieve DNMT-remmers.
Een hindernis voor het ontdekken van nieuwe kleine molecuulremmers van DNT's zijn de moeizame testen die traditioneel worden gebruikt om DNMT-activiteitte onderzoeken 28. Assays zijn meestal discontinu met meerdere stappen. De enzymatische activiteit van DNMT's wordt nog steeds routinematig getest met behulp van radioactief S-adenosyl methionine (SAM)29,30,31,32,33,34. Er zijn ook niet-radioactieve testen voor DNA-methylatie ontwikkeld. Bijvoorbeeld, assays die methylgevoelige restrictie-endonucleasen en elektroforese gebruiken om de spijsverteringsproducten te scheiden, zijn beschreven35,36. Dit soort discontinue, meerstapstests zijn niet gemakkelijk vatbaar voor medicijnontdekking. Sinds het midden van de jaren 2000 zijn verschillende DNA-methylatietests met een hogere doorvoer ontwikkeld28. Een scintillatie-nabijheidstest werd gebruikt om te screenen op DNMT1-remmers37. Een andere test met behulp van een methylgevoelige restrictie-endonuclease werd gebruikt om te screenen op DNMT3a-remmers25,38. Hoewel beide assays een hogere doorvoer mogelijk maakten dan traditionele DNA-methylatietests, vereisen de assays meerdere stappen en laten ze de observatie van methylatieactiviteit in realtime niet toe. Meer recent is een continue kinetische test beschreven die de vorming van S-adenosylhomocysteïne (SAH), een product van de methylatiereactie, koppelt aan de spectroscopische verandering bij 340 nm geassocieerd met NADPH-oxidatie39. Deze test maakt gebruik van drie koppelende enzymen om een spectroscopisch signaal te genereren.
We ontwikkelden een op fluorescentie gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest die gebruik maakt van een enkel commercieel beschikbaar koppelingsenzym en in realtime gegevens kan genereren (figuur 1). Een haarspeld oligonucleotide met drie methylcytosines wordt gebruikt als substraat. Het substraat-DNA bevat een fluorofoor aan het 5'-uiteinde en een quencher aan het 3'-uiteinde. Methylering van de gehemimethyleerde CpG-site genereert de splitsingsplaats voor de endonuclease Gla I - volledig gemethyleerde GCGC. Gla I splitsing van het product oligonucleotide geeft de fluorofoor vrij uit de quencher en genereert fluorescentie in real time. De test kan worden gebruikt om de activiteit van elke isovorm van DNMT te onderzoeken; er wordt echter een hogere activiteit waargenomen met DNMT1, omdat dit isozym bij voorkeur gehemimethyleerd DNA 1,5 methyleert. Nog robuustere activiteit wordt waargenomen als het RFTS-domein (Autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence) wordt verwijderd uit DNMT1. Dit domein, gevonden in het N-terminale regulatoire gebied, bindt aan de katalytische plaats en voorkomt DNA-binding. Verwijdering van de eerste ~ 600 aminozuren resulteert in een afgeknotte enzym dat aanzienlijk actiever is dan het enzym over de volledige lengte (~ 640-voudige toename van kcat / Km)40. Deze geactiveerde vorm van het enzym, aangeduid als RFTS-ontbrekende DNMT1 (aminozuren 621-1616), maakt de gemakkelijkere identificatie van remmers mogelijk vanwege de verhoogde katalytische kracht. Dit artikel presenteert een protocol om RFTS-ontbrekende DNMT1 te gebruiken in assays om te screenen op potentiële remmers van kleine moleculen. Met behulp van de endonuclease-gekoppelde continue assay wordt de beginsnelheid bepaald in de aan- en afwezigheid van enkele kleine moleculen. Elke potentiële remmer wordt onderzocht bij twee concentraties om te zoeken naar concentratieafhankelijke DNMT1-remming. Het percentage activiteit waargenomen in de aanwezigheid van de kleine moleculen werd in elk geval berekend.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Figuur 1: DNA-methylatietest. Een gehemimethyleerd haarspeld-DNA met een fluorofoor aan het 5'-uiteinde en een quencher aan het 3'-uiteinde wordt als substraat gebruikt. DNMT1 katalyseert de overdracht van de methylgroep van S-adenosylmethionine naar de niet-gemethyleerde CpG-site, waarbij S-adenosylhomocysteïne en volledig gemethyleerd DNA wordt gegenereerd. Het DNA-product bevat de splitsingsplaats voor het endonuclease Gla I, dat volledig gemethyleerde GCGC-sites splijt. Splitsing van het product DNA geeft de 5' fluorofoor vrij uit de 3' quencher, waardoor fluorescentie ontstaat. Afkortingen: Fl = fluorofoor; Q =quencher; DNMT1 = DNA methyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionine; SAH = S-adenosylhomocysteïne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

DNA-methylatie, een vorm van epigenetische genregulatie, is belangrijk voor de normale cellulaire functie. In cellen stellen eiwitten genaamd DNA-methyltransferasen (DNMT's) het DNA-methylatiepatroon vast en onderhouden het. Veranderingen in het normale DNA-methylatiepatroon zijn gekoppeld aan de ontwikkeling en progressie van kanker, waardoor DNMT's potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen zijn. Het identificeren en karakteriseren van nieuwe kleine molecuulremmers van deze enzymen is dus van groot belang. Dit artikel presenteert een protocol dat kan worden gebruikt om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers. De continue gekoppelde kinetische test maakt het mogelijk om de initiële snelheden van DNA-methylatie te bepalen in de aan- en afwezigheid van potentiële kleine molecuulremmers. De test gebruikt de methylgevoelige endonuclease Gla I om methylering van een gehemimethyleerd DNA-substraat te koppelen aan fluorescentiegeneratie.
Deze continue test maakt het mogelijk om de enzymactiviteit in realtime te volgen. Het uitvoeren van de test in kleine volumes in microtiterplaten verlaagt de kosten van reagentia. Met behulp van deze test werd een klein voorbeeldscreening uitgevoerd op remmers van DNMT1, het meest voorkomende DNMT-isozym bij mensen. Het sterk gesubstitueerde anthrachinon natuurlijke product, laccaïnezuur A, is een krachtige, DNA-competitieve remmer van DNMT1. Hier onderzoeken we drie potentiële kleine molecuulremmers - anthrachinonen of anthrachinonachtige moleculen met één tot drie substituenten - in twee concentraties om het testprotocol te beschrijven. Initiële snelheden worden gebruikt om de procentuele activiteit te berekenen die wordt waargenomen in de aanwezigheid van elk molecuul. Een van de drie onderzochte verbindingen vertoont concentratieafhankelijke remming van DNMT1-activiteit, wat aangeeft dat het een potentiële remmer van DNMT1 is.

Actieve DNMT1 is een voorwaarde voor deze analyse. RFTS-ontbrekende DNMT1 werd uitgedrukt in E.coli en gezuiverd tot homogeniteit volgens eerder gepubliceerde procedures41. Om ervoor te zorgen dat het gezuiverde enzym actief was, werd een discontinue endonuclease-gekoppelde test gebruikt om DNA-methylatieactiviteit36 te onderzoeken. Deze test maakt gebruik van een duplex-DNA van 32 basenparen met een enkele gehemimethyleerde CpG op een Sau3A1-splitsingsplaats. Sau3...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Een robuuste plaatlezertest zoals de onze is zeer nuttig voor de eerste screening van potentiële methyltransferaseremmers. De mogelijkheid om gegevens in realtime te verzamelen is een groot voordeel van de continue endonuclease-gekoppelde test. Begin met het bereiden van 600 microliter van de testomstandigheden die 20 micromolaire en 50 micromolaire verbindingen afzonderlijk bevatten in de microcentrifugebuizen op ijs.Voeg hiervoor dubbel gedestilleerd water en 5X methylatiebuffer toe aan elke buis om een uiteindelijke concentratie van 1X methylatiebuffer te bereiken. Voeg vervolgens 3,15 microliter 20 milligram per milliliter runderserumalbumine of BSA toe aan elk monster. Voeg vervolgens twee microliter 3,15 micromolair haarspeld DNA-substraat en 1,33 microliter 4,75 micromolair S-adenosylmethionine of SAM toe aan elk monster.Voeg de remmer toe aan de juiste monsters om een eindconcentratie van 21 micromolair of 52,5 micromolair en een equivalente hoeveelheid dimethylsulfoxide of DMSO aan een controlemonster te bereiken voordat de oplossingen gedurende drie seconden met 3.000 omwentelingen per minuut worden gemengd. Draai vervolgens de monsters gedurende een paar seconden in een tafeltafel minicentrifuge op 1, 200 maal G om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld. Aliquot 95 microliter van elke testoplossing in zes opeenvolgende putten in een zwart half gebied 96 putplaat.Bereid 75 microliter Gla I of DNMT1 plus Gla I enzymoplossing in de microcentrifugebuizen zoals eerder beschreven tot een uiteindelijke concentratie van eenmalige buffer. Voeg vervolgens 1,2 microliter van 10 eenheden per microliter Gla I toe aan elke oplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,16 eenheden per microliter te bereiken. Voeg 0,6 microliter van vijf micromolaire RFTS-ontbrekende DNMT1 toe aan de DNMT1 plus Gla I-oplossing voor een eindconcentratie van 40 nanomolair.Na voorzichtig mengen, draai de monsters gedurende enkele seconden in een tafelblad minicentrifuge op 1.200 G om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld. Vervolgens aliquot 12 microliter van elke enzymoplossing in zes putten in een conisch bodemplaatje van 96 putten. Voor de methylatietest van het DNA-monster verwarmt u de plaatlezer voor op 37 graden Celsius.Plaats vervolgens de zwarte plaat met de testoplossingen in de plaatlezer. Na het schudden van de plaat op 425 CPM, meet de fluorescentie met een excitatiegolflengte van 485 nanometer en een emissiegolflengte van 528 nanometer. Incubeer vervolgens de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Verwijder de testplaat uit de plaatlezer en voeg vijf microliter van de enzymoplossing toe aan elke put, gevolgd door de oplossing te mengen door op en neer te pipetteren. Steek de plaat in de plaatlezer en schud de plaat voordat u de fluorescentie elke 53 seconden gedurende 30 minuten opneemt. Verkrijg de gemiddelde fluorescentie van de drievoudige Gla I-controletests voor elke aandoening en trek de gemiddelde Gla I-met controlereactietrays af van de drievoudige sporen die zijn verkregen in aanwezigheid van RFTS-ontbrekende DNMT1.Bepaal vervolgens de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor de gecorrigeerde replicaties. Plot het gemiddelde gecorrigeerde reactiespoor en pas het initiële lineaire gedeelte aan op een lijn om de beginsnelheid te bepalen. Bepaal het percentage activiteit door de snelheid waargenomen in de aanwezigheid van een verbinding te delen door de snelheid waargenomen in de DMSO die controlereactie bevat en te vermenigvuldigen met 100.De resultaten van een discontinue endonuclease-gekoppelde test toonden aan dat volledig gemethyleerd product-DNA wordt beschermd tegen splitsing, wat bevestigt dat RFTS-ontbrekende DNMT1 actief is en in staat is om het gehemimethyleerde substraat-DNA te methyleren. In de op fluorescentie gebaseerde test had, bij afwezigheid van Gla I, de toevoeging van DNMT1 of buffer alleen geen invloed op de achtergrondfluorescentie. Latere toevoeging van Gla I aan alle assays resulteerde in fluorescentiegeneratie alleen in assays die DNMT1 bevatten.De gelijktijdige toevoeging van RFTS-ontbrekende DNMT1 en Gla I aan drie assays resulteerde in robuuste fluorescentiegeneratie. De toevoeging van Gla I alleen produceerde geen fluorescentie. Om te screenen op potentiële remmers, werd de DNA-methylatieactiviteit van RFTS-ontbrekende DNMT1 onderzocht in aanwezigheid van DMSO, verbinding één, verbinding twee of verbinding drie bij 20 en 50 micromolaire concentraties.De verbindingen die de fluorescentiegeneratie in deze gekoppelde test verminderen, moeten verder worden gevalideerd. Ervoor zorgen dat de verbindingen het koppelende enzym niet remmen, is een belangrijke volgende stap.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Een Fluorogenic Peptide decollete Assay aan het scherm voor Proteolytic activiteit: toepassingen voor coronavirus spike eiwit activering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Kant-en-klare qPCR voor detectie van DNA van Trypanosoma cruzi of andere pathogene organismen

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...