Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Die Autoren danken der Bucknell University und dem Department of Chemistry für ihre Unterstützung dieser Arbeit.

1. Bereiten Sie Assay-Lösungen für den Bildschirm vor
HINWEIS: Die Konzentrationen der in diesem Assay verwendeten Substrate können angepasst werden. Für RFTS-fehlendes DNMT1 betragen die experimentell ermitteltenK-m-Werte für das Haarnadel-DNA-Substrat und SAM 1–2 nM bzw. 2 μM bzw.26,40.
<ol><li>Bereiten Sie 600 μL jeder Testbedingung vor, die in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis getestet wird.<b...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. 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Um Inhibitoren von DNA-Methyltransferasen zu identifizieren und zu charakterisieren, muss die Aktivität des Enzyms gemessen werden. Es gibt mehrere Methoden zur Untersuchung der DNA-Methyltransferase-Aktivität. Die Aktivität wird üblicherweise mit Radioaktivität überwacht; Der Transfer der markierten Methylgruppe von SAM kann quantifiziert werden 29,30,31,32,33,34.<sup class="x...

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Markierung, die die Genexpression und die Chromatinstruktur reguliert. Die Methylierung erfolgt überwiegend in CpG-Dinukleotiden - Cytosin gefolgt von Guanosin; Die Methylgruppe wird zur 5-Position von Cytosin hinzugefügt. Korrekte DNA-Methylierungsmuster und damit die richtige Genexpression sind für eine angemessene zelluläre Entwicklung und Funktion erforderlich. Viele Krankheitszustände wurden mit Veränderungen des normalen Methylierungsmusters 1,2,3 in Verbindung gebracht. Zum Beispiel gibt es einen Zusammenhang zwischen Krebsentstehung und -progression und Veränderungen des DNA-Methylierungsmusters. Typischerweise weisen Krebszellen insgesamt niedrigere Methylcytosinspiegel auf, was zur Instabilität des Genoms beiträgt. Gleichzeitig konzentriert sich das im Erbgut vorhandene Methylcytosin in den Promotorregionen von Tumorsuppressorgenen, was zu einer Gen-Silencierung dieser wichtigen Proteine führt. Insbesondere epigenetische Veränderungen sind dynamisch und reversibel, im Gegensatz zu den DNA-Mutationen, die mit der Tumorgenese assoziiert sind. Dies hat die Proteine, die an der epigenetischen Genregulation beteiligt sind, zu interessantenWirkstoffzielen 2,4 gemacht.
DNA-Methyltransferasen (DNMTs) sind die Proteine, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von DNA-Methylierungsmustern verantwortlich sind. Drei katalytisch aktive Isoenzyme, DNMT1, DNMT3a und DNMT3b, existieren beim Menschen. Während der Entwicklung und Differenzierung etablieren die de novo Methyltransferasen DNMT3a und DNMT3b Methylierungsmuster. Beide Enzyme können das katalytisch inaktive DNMT3L-Protein zu Komplexen binden, die eine erhöhte Aktivitätaufweisen 1,5. Nach der Zellteilung enthalten Tochterzellen hemimethylierte DNA - DNA, die Methylcytosin in nur einem Strang des Duplex enthält -, weil die neu synthetisierte DNA frei von Methylierungsmarkierungen ist. Die Hauptfunktion von DNMT1 besteht darin, diese hemimethylierte DNA zu methylieren, wodurch das vollständige Methylierungsmuster 1,5 wiederhergestellt wird.
Zusammenhänge zwischen DNMT-Aktivität und Krebs sind gut etabliert. Die Überexpression von DNMT1, entweder durch transkriptionelle oder posttranslationale Mechanismen, ist eine Folge mehrerer gemeinsamer onkogener Signalwege 6,7,8,9. Genetische Ansätze zur Senkung der DNMT1-Aktivität unter Verwendung hypomorpher Allele führen zu einer verminderten Tumorbildung bei Apc(Min)Mäusen10. Antisense-Oligonukleotide, die DNMT1 niederschlagen, hemmen Neoplasien in Zellkultur- undMaustumormodellen 11,12. Daher scheint die Hemmung der DNMT1-Aktivität ein vielversprechender Krebstherapieansatz zu sein. Die Rollen, die die DNMT3-Isoenzyme spielen, sind jedoch nicht so einfach. DNMT3a-Mutationen finden sich bei akuter myeloischer Leukämie13 und myelodysplastischem Syndrom14. Es wurde gezeigt, dass mindestens eine der identifizierten Mutationen die DNA-Methylierungsaktivität des Enzyms15 verringert. DNMT3b ist jedoch bei Brustkrebs16 und Darmkrebs17 überexprimiert. Da die verschiedenen DNMT-Isoenzyme unterschiedliche Rollen bei der Karzinogenese spielen, wird die Identifizierung isoenzymspezifischer Inhibitoren entscheidend sein. Diese Verbindungen werden nicht nur für die Entwicklung von Therapeutika nützlich sein, sondern isoenzymspezifische Inhibitoren wären auch ein unschätzbares Werkzeug, um die Rolle jedes DNMT-Isoenzyms in der Krebsätiologie zu analysieren.
Mehrere DNMT-Inhibitoren wurden in der Literatur beschrieben. Bekannte DNMT-Inhibitoren können in zwei Klassen unterteilt werden: Nukleosid und Nicht-Nukleosid. Nukleosidinhibitoren sind typischerweise Cytidinanaloga. Diese Verbindungen werden in die DNA eingebaut und fangen DNMTs kovalent ein. 5-Azacytidin und 5-Aza-2'-Desoxycytidin sind für die Behandlung des myelodysplastischen Syndroms und der akuten myeloischen Leukämie zugelassen 4,18. Die hohe Toxizität, geringe Bioverfügbarkeit und chemische Instabilität dieser Verbindungen stellen Probleme dar. Laufende Arbeiten untersuchen die Wirksamkeit der nächsten Generation von Nukleosidinhibitoren; SGI-110, abgeleitet von 5-Aza-2'-Desoxycytidin, ist ein Beispiel19,20. Nukleosid-Inhibitoren sind nicht isoenzymspezifisch und inaktivieren jedes auftretende DNMT-Isoenzym. Daher führt die Behandlung mit einem nukleosiddemethylierenden Mittel zur Erschöpfung aller DNMT-Isoenzyme 4,18. Nicht-Nukleosid-Inhibitoren müssen nicht in die DNA eingebaut werden, um ihre hemmende Wirkung auszuüben. Stattdessen binden diese Moleküle direkt an DNMTs, was die Möglichkeit einer isoenzymspezifischen Hemmung einführt. Bisher wurden mehrere Nicht-Nukleosid-Inhibitoren entdeckt, darunter SGI-1027 21, Hydralazin-22, Procainamid23, RG108 und Derivate 24 sowie die Naturstoffe (−)-Epigallocateching-3-Gallat (EGCG)25 und Milchsäure A 26,27. Die meisten der bisher entdeckten Nicht-Nukleosid-Inhibitoren sind nicht isoenzymselektiv oder zeigen schwache Präferenzen für ein DNMT-Isoenzym. Darüber hinaus muss die Wirksamkeit dieser Moleküle verbessert werden, insbesondere in Zellen 4,18. Daher besteht die Notwendigkeit, potentere, isoenzymselektive DNMT-Inhibitoren zu entdecken oder zu entwickeln.
Eine Hürde bei der Entdeckung neuer niedermolekularer Inhibitoren von DNMTs sind die aufwendigen Assays, die traditionell zur Untersuchung der DNMT-Aktivität verwendetwerden 28. Assays sind in der Regel diskontinuierlich mit mehreren Schritten. Die enzymatische Aktivität von DNMTs wird immer noch routinemäßig mit radioaktivem S-Adenosylmethionin (SAM) 29,30,31,32,33,34 untersucht. Nicht-radioaktive Assays für die DNA-Methylierung wurden ebenfalls entwickelt. Zum Beispiel wurden Assays beschrieben, die methylsensitive Restriktionsendonukleasen und Elektrophorese zur Trennung der Verdauungsprodukte verwenden35,36. Diese Arten von diskontinuierlichen, mehrstufigen Assays sind für die Wirkstoffforschung nicht ohne weiteres zugänglich. Seit Mitte der 2000er Jahre wurden mehrere DNA-Methylierungsassays mit höherem Durchsatz entwickelt28. Ein Szintillations-Proximity-Assay wurde verwendet, um nach DNMT1-Inhibitoren zu suchen37. Ein weiterer Assay unter Verwendung einer methylsensitiven Restriktionsendonuklease wurde verwendet, um nach DNMT3a-Inhibitoren25,38 zu suchen. Während beide Assays einen höheren Durchsatz als herkömmliche DNA-Methylierungsassays ermöglichten, erfordern die Assays mehrere Schritte und erlauben nicht die Beobachtung der Methylierungsaktivität in Echtzeit. In jüngerer Zeit wurde ein kontinuierlicher Kinetik beschrieben, der die Bildung von S-Adenosylhomocystein (SAH), einem Produkt der Methylierungsreaktion, an die spektroskopische Veränderung bei 340 nm koppelt, die mit der NADPH-Oxidation39 assoziiert ist. Dieser Assay verwendet drei Kopplungsenzyme, um ein spektroskopisches Signal zu erzeugen.
Wir entwickelten einen fluoreszenzbasierten Endonuklease-gekoppelten DNA-Methylierungsassay, der ein einzelnes kommerziell verfügbares Kopplungsenzym verwendet und Daten in Echtzeit generieren kann (Abbildung 1). Als Substrat wird ein Haarnadel-Oligonukleotid verwendet, das drei Methylcytosine enthält. Die Substrat-DNA enthält einen Fluorophor am 5'-Ende und einen Quencher am 3'-Ende. Die Methylierung der hemimethylierten CpG-Stelle erzeugt die Spaltstelle für die Endonuklease Gla I - vollständig methyliertes GCGC. Die Gla-I-Spaltung des Produktoligonukleotids setzt den Fluorophor aus dem Quencher frei und erzeugt Fluoreszenz in Echtzeit. Der Assay kann verwendet werden, um die Aktivität jeder Isoform von DNMT zu untersuchen; jedoch wird eine höhere Aktivität mit DNMT1 beobachtet, da dieses Isoenzym bevorzugt hemimethylierte DNA 1,5 methyliert. Eine noch robustere Aktivität wird beobachtet, wenn die autoinhibitorische RFTS-Domäne (Replication Foci Targeting Sequence) aus DNMT1 entfernt wird. Diese Domäne, die sich in der N-terminalen regulatorischen Region befindet, bindet an die katalytische Stelle und verhindert die DNA-Bindung. Die Entfernung der ersten ~600 Aminosäuren führt zu einem verkürzten Enzym, das signifikant aktiver ist als das Enzym in voller Länge (~640-facher Anstieg in kKatze / Km)40. Diese aktivierte Form des Enzyms, die als RFTS-fehlendes DNMT1 (Aminosäuren 621–1616) bezeichnet wird, ermöglicht aufgrund ihrer erhöhten katalytischen Kraft die leichtere Identifizierung von Inhibitoren. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, um RFTS-fehlendes DNMT1 in Assays zu verwenden, um nach potenziellen niedermolekularen Inhibitoren zu suchen. Mit dem Endonuklease-gekoppelten kontinuierlichen Assay wird die Anfangsgeschwindigkeit in Gegenwart und Abwesenheit einiger kleiner Moleküle bestimmt. Jeder potenzielle Inhibitor wird bei zwei Konzentrationen untersucht, um nach konzentrationsabhängiger DNMT1-Hemmung zu suchen. Die prozentuale Aktivität, die in Gegenwart der kleinen Moleküle beobachtet wurde, wurde jeweils berechnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Abbildung 1: DNA-Methylierungstest. Als Substrat wird eine hemimethylierte Haarnadel-DNA mit einem Fluorophor am 5'-Ende und einem Quencher am 3'-Ende verwendet. DNMT1 katalysiert den Transfer der Methylgruppe von S-Adenosylmethionin zur nicht methylierten CpG-Stelle und erzeugt S-Adenosylhomocystein und vollständig methylierte DNA. Das DNA-Produkt enthält die Spaltstelle für die Endonuklease Gla I, die vollständig methylierte GCGC-Stellen spaltet. Die Spaltung der Produkt-DNA setzt den 5'-Fluorophor aus dem 3'-Quencher frei und erzeugt Fluoreszenz. Abkürzungen: Fl = Fluorophor; Q =Quencher; DNMT1 = DNA-Methyltransferase 1; SAM = S-Adenosylmethionin; SAH = S-Adenosylhomocystein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

DNA-Methylierung, eine Form der epigenetischen Genregulation, ist wichtig für die normale Zellfunktion. In Zellen etablieren und erhalten Proteine, die DNA-Methyltransferasen (DNMTs) genannt werden, das DNA-Methylierungsmuster. Veränderungen des normalen DNA-Methylierungsmusters sind mit der Entwicklung und Progression von Krebs verbunden, was DNMTs zu potenziellen Zielen für Krebsmedikamente macht. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger niedermolekularer Inhibitoren dieser Enzyme von großer Bedeutung. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das verwendet werden kann, um nach DNA-Methyltransferase-Inhibitoren zu suchen. Der Test der kontinuierlichen gekoppelten Kinetik ermöglicht es, die Anfangsgeschwindigkeiten der DNA-Methylierung in Gegenwart und Abwesenheit potenzieller niedermolekularer Inhibitoren zu bestimmen. Der Assay verwendet die methylsensitive Endonuklease Gla I, um die Methylierung eines hemimethylierten DNA-Substrats an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln.
Dieser kontinuierliche Assay ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit. Die Durchführung des Assays in kleinen Volumina in Mikrotiterplatten reduziert die Kosten für Reagenzien. Mit diesem Assay wurde ein kleines Beispiel-Screening für Inhibitoren von DNMT1, dem am häufigsten vorkommenden DNMT-Isoenzym beim Menschen, durchgeführt. Das hochsubstituierte Anthrachinon-Naturprodukt Milchsäure A ist ein potenter, DNA-kompetitiver Inhibitor von DNMT1. Hier untersuchen wir drei potenzielle niedermolekulare Inhibitoren - Anthrachinone oder Anthrachinon-ähnliche Moleküle mit ein bis drei Substituenten - in zwei Konzentrationen, um das Assay-Protokoll zu beschreiben. Anfangsgeschwindigkeiten werden verwendet, um die prozentuale Aktivität zu berechnen, die in Gegenwart jedes Moleküls beobachtet wird. Eine der drei untersuchten Verbindungen weist eine konzentrationsabhängige Hemmung der DNMT1-Aktivität auf, was darauf hindeutet, dass es sich um einen potenziellen Inhibitor von DNMT1 handelt.

Aktives DNMT1 ist Voraussetzung für diese Analyse. RFTS-fehlendes DNMT1 wurde in E. coli exprimiert und nach zuvor veröffentlichten Verfahren41 auf Homogenität gereinigt. Um sicherzustellen, dass das gereinigte Enzym aktiv war, wurde ein diskontinuierlicher Endonuklease-gekoppelter Assay verwendet, um die DNA-Methylierungsaktivität36 zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine 32-Basenpaar-Duplex-DNA mit einem einzelnen hemimethylierten CpG, das in einer Sau3A1...

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Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Ein robuster Plattenleser-Assay wie unserer ist sehr nützlich für das erste Screening potenzieller Methyltransferase-Inhibitoren. Die Möglichkeit, Daten in Echtzeit zu sammeln, ist ein großer Vorteil des kontinuierlichen Endonuklease-gekoppelten Assays. Beginnen Sie mit der Herstellung von 600 Mikrolitern der Assay-Bedingungen, die 20 mikromolare und 50 mikromolare Verbindungen enthalten, separat in den Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.Um dies zu tun, fügen Sie doppelt destilliertes Wasser und 5X Methylierungspuffer zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 1X Methylierungspuffer zu erreichen. Als nächstes fügen Sie 3,15 Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin oder BSA zu jeder Probe hinzu. Dann fügen Sie zwei Mikroliter 3,15 Mikromolare Haarnadel-DNA-Substrat und 1,33 Mikroliter 4,75 Mikromolar S-Adenosylmethionin oder SAM zu jeder Probe hinzu.Fügen Sie den entsprechenden Proben einen Inhibitor hinzu, um eine Endkonzentration von 21 Mikromolar oder 52,5 Mikromolar und eine äquivalente Menge Dimethylsulfoxid oder DMSO zu einer Kontrollprobe zu erreichen, bevor die Lösungen durch Wirbeln bei 3.000 Umdrehungen pro Minute für drei Sekunden gemischt werden. Dann drehen Sie die Proben für einige Sekunden in einer Tischtisch-Minizentrifuge bei 1, 200 mal G, um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird. Aliquot 95 Mikroliter jeder Assaylösung in sechs aufeinanderfolgende Vertiefungen in einer schwarzen Halbflächen-96-Well-Platte.75 Mikroliter Gla I oder DNMT1 plus Gla I Enzymlösung in den Mikrozentrifugenröhrchen wie zuvor beschrieben auf eine Endkonzentration von einmaligem Puffer vorbereiten. Als nächstes fügen Sie 1,2 Mikroliter von 10 Einheiten pro Mikroliter Gla I zu jeder Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,16 Einheiten pro Mikroliter zu erreichen. Fügen Sie der Lösung DNMT1 plus Gla I 0,6 Mikroliter von fünf mikromolaren RFTS-fehlenden DNMT1 hinzu, um eine Endkonzentration von 40 Nanomolaren zu erhalten.Nach dem vorsichtigen Mischen drehen Sie die Proben einige Sekunden lang in einer Tisch-Minizentrifuge bei 1.200 g, um sicherzustellen, dass die Lösung am Boden des Röhrchens gesammelt wird. Dann aliquot 12 Mikroliter jeder Enzymlösung in sechs Vertiefungen in einer konischen 96-Well-Platte. Für den Methylierungstest der DNA-Probe wird der Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorgeheizt.Legen Sie dann die schwarze Platte mit den Assaylösungen in das Plattenlesegerät ein. Nach dem Schütteln der Platte bei 425 CPM wird die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 528 Nanometern gemessen. Dann die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.Entfernen Sie die Assay-Platte aus dem Plattenleser und fügen Sie fünf Mikroliter der Enzymlösung in jede Vertiefung hinzu, gefolgt von einem Mischen der Lösung durch Pipettieren auf und ab. Führen Sie die Platte in das Plattenlesegerät ein und schütteln Sie die Platte, bevor Sie die Fluoreszenz alle 53 Sekunden für 30 Minuten aufzeichnen. Man erhält die durchschnittliche Fluoreszenz der dreifachen Gla I-Kontrollassays für jede Bedingung und subtrahiert die durchschnittlichen Gla I-haltigen Kontrollreaktionsschalen von den dreifachen Spuren, die in Gegenwart von RFTS-fehlendem DNMT1 erhalten wurden.Bestimmen Sie dann den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts für die korrigierten Replikate. Zeichnen Sie die durchschnittlich korrigierte Reaktionsspur und passen Sie den anfänglichen linearen Abschnitt an eine Linie an, um die Anfangsgeschwindigkeit zu bestimmen. Bestimmen Sie die prozentuale Aktivität, indem Sie die in Gegenwart einer Verbindung beobachtete Geschwindigkeit durch die Geschwindigkeit dividieren, die in der DMSO-haltigen Kontrollreaktion beobachtet wurde, und mit 100 multiplizieren.Die Ergebnisse eines diskontinuierlichen Endonuklease-gekoppelten Assays zeigten, dass vollständig methylierte Produkt-DNA vor Spaltung geschützt ist, was bestätigt, dass RFTS-fehlendes DNMT1 aktiv ist und in der Lage ist, die hemimethylierte Substrat-DNA zu methylieren. Im fluoreszenzbasierten Assay hatte die Zugabe von DNMT1 oder Puffer allein in Abwesenheit von Gla I keinen Einfluss auf die Hintergrundfluoreszenz. Die anschließende Zugabe von Gla I zu allen Assays führte zu einer Fluoreszenzerzeugung nur in Assays, die DNMT1 enthielten.Die gleichzeitige Zugabe von RFTS-fehlendem DNMT1 und Gla I zu drei Assays führte zu einer robusten Fluoreszenzerzeugung. Die Zugabe von Gla I allein erzeugte keine Fluoreszenz. Um nach potenziellen Inhibitoren zu suchen, wurde die DNA-Methylierungsaktivität von RFTS-fehlendem DNMT1 in Gegenwart von DMSO, Verbindung eins, Verbindung zwei oder Verbindung drei bei 20 und 50 Mikromolkonzentrationen untersucht.Die Verbindungen, die die Fluoreszenzerzeugung in diesem gekoppelten Assay reduzieren, müssen weiter validiert werden. Sicherzustellen, dass die Verbindungen das Kopplungsenzym nicht hemmen, ist ein wichtiger nächster Schritt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

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Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

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Ein Fluorogenic Peptid Spaltung Assay zum Bildschirm für die proteolytische Aktivität: Anwendungen für Coronavirus spike Protein-Aktivierung

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