Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

המחברים מודים לאוניברסיטת באקנל ולמחלקה לכימיה על תמיכתם בעבודה זו.

1. הכן פתרונות בדיקה למסך
הערה: ניתן להתאים את ריכוזי המצעים המשמשים בבדיקה זו. עבור DNMT1 חסר RFTS, ערכי Km שנקבעו בניסוי עבור מצע הדנ"א של סיכת השיער ו-SAM הם 1-2 ננומטר ו-2 מיקרומטר,בהתאמה 26,40.
<ol><li>הכן 600 μL מכל מצב בדיקה הנבדק בצינורות מ?...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disease-associated+germline+mutations+on+structure+function+relationship+of+DNA+methyltransferases.">Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases.</a> Genes. 10 (5), 369 (2019).</li><li>Foulks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+drug+discovery:+targeting+DNA+methyltransferases.">Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).</li><li>Goll, M. G., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+cytosine+methyltransferases.">Eukaryotic cytosine methyltransferases.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).</li><li>Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+human+DNA+Methyltransferase+(dnmt1)+gene.">Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene.</a> Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).</li><li>Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+3'-untranslated+element+mediates+growth+regulation+of+DNA+methyltransferase+1+and+inhibits+its+transforming+activity.">A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).</li><li>MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+methylation+by+the+Ras+signaling+pathway.">Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).</li><li>Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+is+a+downstream+effector+of+cellular+transformation+triggered+by+simian+virus+40+large+T+antigen.">DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).</li><li>Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genetic+suppression+of+polyp+formation+and+reduction+of+CpG-island+hypermethylation+in+Apc(Min/+)+Dnmt1-hypomorphic+mice.">Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice.</a> Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).</li><li>MacLeod, A. R., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+antisense+to+DNA+methyltransferase+mRNA+induces+DNA+demethylation+and+inhibits+tumorigenesis.">Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).</li><li>Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumorigenesis+by+a+cytosine-DNA,+methyltransferase,+antisense+oligodeoxynucleotide.">Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).</li><li>Ley, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).</li><li>Walter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+DNMT3A+mutations+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).</li><li>Russler-Germain, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R882H+DNMT3A+mutation+associated+with+AML+dominantly+inhibits+wild-type+DNMT3A+by+blocking+its+ability+to+form+active+tetramers.">The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers.</a> Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).</li><li>Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3b+overexpression+contributes+to+a+hypermethylator+phenotype+in+human+breast+cancer+cell+lines.">DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.</a> Molecular Cancer. 7, 15 (2008).</li><li>Nosho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3B+expression+might+contribute+to+CpG+island+methylator+phenotype+in+colorectal+cancer.">DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.</a> Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).</li><li>Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+methylation+with+small+molecules:+what's+next.">Targeting DNA methylation with small molecules: what's next.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).</li><li>Chuang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S110,+a+5-Aza-2'-deoxycytidine-containing+dinucleotide,+is+an+effective+DNA+methylation+inhibitor+in+vivo+and+can+reduce+tumor+growth.">S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).</li><li>Issa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+guadecitabine+(SGI-110)+in+patients+with+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukaemia:+a+multicentre,+randomised,+dose-escalation+phase+1+study.">Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study.</a> Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).</li><li>Datta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+quinoline-based+DNA+hypomethylating+agents+reactivates+tumor+suppressor+genes+by+blocking+DNA+methyltransferase+1+activity+and+inducing+its+degradation.">A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation.</a> Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).</li><li>Zambrano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+hydralazine+to+demethylate+and+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes.">A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes.</a> BMC Cancer. 5, 44 (2005).</li><li>Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procainamide+is+a+specific+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).</li><li>Asgatay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+analogues+of+N-phthaloyl-l-tryptophan+(RG108)+as+inhibitors+of+DNA+methyltransferase+1.">Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C5-DNA+methyltransferase+inhibitors:+from+screening+to+effects+on+zebrafish+embryo+development.">C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development.</a> Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).</li><li>Fagan, R. L., Wu, M., Ch&#233;din, F., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+high+throughput+screen+for+DNA+methyltransferase+1-targeted+molecular+probes.">An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes.</a> PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).</li><li>Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccaic+acid+A+is+a+direct,+DNA-competitive+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).</li><li>Eglen, R. M., Reisine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+compounds+that+modulate+epigenetic+regulation+of+the+transcriptome:+an+overview.">Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).</li><li>Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DNA+methyltransferase+(DNMT3A)+observed+in+acute+myeloid+leukemia+patients+disrupt+processive+methylation.">Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).</li><li>Norvil, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3b+methylates+DNA+by+a+noncooperative+mechanism,+and+its+activity+is+unaffected+by+manipulations+at+the+predicted+dimer+interface.">Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface.</a> Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).</li><li>Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+details+of+the+DNA+recognition+by+the+Dnmt1+DNA+methyltransferase.">Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase.</a> FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain.">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li><li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+(SRA)+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA.">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li><li>Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+threonine+1505+in+the+catalytic+domain+stabilizes+mouse+DNA+methyltransferase+1.">Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Dnmt1+for+methylation+of+hemimethylated+CpG+sites+resides+in+its+catalytic+domain.">Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain.</a> Chemistry &amp; Biology. 19 (5), 572-578 (2012).</li><li>Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+mutations+G589A+and+V590F+relieve+replication+focus+targeting+sequence-mediated+autoinhibition+of+DNA+methyltransferase+1.">Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1.</a> Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).</li><li>Kilgore, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNMT1+selective+antagonists+using+a+novel+scintillation+proximity+assay.">Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+inhibitors+of+DNA+methylation+by+screening+of+a+chemical+library.">Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).</li><li>Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+kinetic+assay+for+protein+and+DNA+methyltransferase+enzymatic+activities.">A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 8, 56 (2015).</li><li>Syeda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replication+focus+targeting+sequence+(RFTS)+domain+is+a+DNA-competitive+inhibitor+of+Dnmt1.">The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).</li><li>Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituted+anthraquinones+represent+a+potential+scaffold+for+DNA+methyltransferase+1-specific+inhibitors.">Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors.</a> PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).</li></ol>

כדי לזהות ולאפיין מעכבים של מתיל-טרנספראזות DNA, יש למדוד את פעילות האנזים. קיימות מספר שיטות לבדיקת פעילות הדנ"א מתיל-טרנספראז. הפעילות מנוטרת בדרך כלל באמצעות רדיואקטיביות; העברה של קבוצת המתיל המסומנת של SAM ניתנת לכימות 29,30,31,32,33,34<su...

מתילציה של דנ"א היא סימן אפיגנטי חשוב המווסת את ביטוי הגנים ואת מבנה הכרומטין. מתילציה מתרחשת בעיקר בדינוקלאוטידים של CpG — ציטוזין ואחריו גואנוזין; קבוצת המתיל מתווספת למיקום 5 של ציטוזין. יש צורך בתבניות מתילציה נכונות של DNA, ובכך בביטוי גנים תקין, להתפתחות ותפקוד מתאימים של התאים. מצבי מחלה רבים נקשרו לשינויים בתבנית המתילציה הרגילה 1,2,3. לדוגמה, קיים קשר בין התחלת סרטן והתקדמותו לבין שינויים בתבנית המתילציה של הדנ"א. בדרך כלל, תאים סרטניים מציגים רמות כלליות נמוכות יותר של מתילציטוזין, אשר תורם לחוסר יציבות הגנום. יחד עם זאת, המתילציטוזין שנמצא בגנום מרוכז באזורים המקדמים של גנים מדכאי גידול, מה שמוביל להשתקת גנים של חלבונים חשובים אלה. יש לציין כי שינויים אפיגנטיים הם דינמיים והפיכים, בניגוד למוטציות הדנ"א הקשורות לגידול. זה הפך את החלבונים המעורבים בוויסות גנים אפיגנטיים למטרות מעניינות של תרופות 2,4.
מתיל-טרנספראזות דנ"א (DNMTs) הם החלבונים האחראים על ייצור ושמירה על תבניות מתילציה של דנ"א. שלושה איזוזימים פעילים קטליטיים, DNMT1, DNMT3a ו-DNMT3b, קיימים בבני אדם. במהלך הפיתוח וההתמיינות קובעים המתיל-טרנספראזות של דה נובו, DNMT3a ו-DNMT3b, תבניות מתילציה. שני האנזימים יכולים לקשור את חלבון ה-DNMT3L שאינו פעיל באופן קטליטי ליצירת קומפלקסים המציגים פעילות מוגברת 1,5. לאחר חלוקת התא, תאי הבת מכילים דנ"א שעבר המימתילציה - דנ"א המכיל מתילציטוזין בגדיל אחד בלבד של הדופלקס - מאחר שהדנ"א המסונתז החדש נטול סימני מתילציה. תפקידו העיקרי של DNMT1 הוא לבצע מתילציה של דנ"א המימתילציה זה, ובכך לבסס מחדש את תבנית המתילציה המלאה 1,5.
הקשרים בין פעילות DNMT לסרטן מבוססים היטב. ביטוי יתר של DNMT1, בין אם על ידי מנגנוני שעתוק או לאחר תרגום, הוא תוצאה של מספר מסלולים אונקוגניים נפוצים 6,7,8,9. גישות גנטיות להפחתת פעילות DNMT1 באמצעות אללים היפומורפיים גורמות לירידה בהיווצרות הגידול בעכברי Apc(Min) 10. אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסים שמפילים DNMT1 מעכבים ניאופלזיה בתרבית תאים ובמודלים של גידולי עכברים11,12. לפיכך, עיכוב פעילות DNMT1 נראה כמו גישה מבטיחה לטיפול בסרטן. עם זאת, התפקידים שהאיזוזימים של DNMT3 ממלאים אינם כה פשוטים. מוטציות DNMT3a נמצאות בלוקמיה מיאלואידית חריפה13 ובתסמונת מיאלודיספלסטית14. לפחות אחת מהמוטציות שזוהו הוכחה כמפחיתה את פעילות המתילציה של הדנ"א של האנזים15. עם זאת, DNMT3b מתבטא יתר על המידה בסרטן השד16 ובסרטן המעי הגס17. כאשר איזוזימים שונים של DNMT ממלאים תפקידים שונים בסרטן, זיהוי מעכבים ספציפיים לאיזוזים יהיה קריטי. לא רק שתרכובות אלה יהיו שימושיות לפיתוח טיפולים, אלא שמעכבים ספציפיים לאיזוזים יהיו גם כלי רב ערך לנתח את התפקיד של כל איזוזימה DNMT באטיולוגיה של סרטן.
מספר מעכבי DNMT דווחו בספרות. מעכבי DNMT ידועים ניתן לחלק לשני סוגים: נוקלאוזיד ולא נוקלאוזיד. מעכבי נוקלאוזיד הם בדרך כלל אנלוגים של ציטידין. תרכובות אלה משולבות בדנ"א ולוכדות באופן קוולנטי DNMTs. 5-azacytidine ו-5-aza-2'-deoxycytidine אושרו לטיפול בתסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה 4,18. הרעילות הגבוהה, הזמינות הביולוגית הנמוכה וחוסר היציבות הכימית של תרכובות אלה מהווים בעיות. עבודה שוטפת בוחנת את היעילות של הדור הבא של מעכבי נוקלאוזידים; SGI-110, המופק מ-5-aza-2'-deoxycytidine, הוא דוגמה אחת19,20. מעכבי נוקלאוזידים אינם ספציפיים לאיזוזימים וישביתו כל איזוזימה DNMT שנתקלים בה. לכן, טיפול בחומר מתיל של נוקלאוזיד גורם לדלדול כל האיזוזימים של DNMT 4,18. מעכבים שאינם נוקלאוזידים אינם צריכים להיות משולבים בדנ"א כדי להפעיל את ההשפעות המעכבות שלהם. במקום זאת, מולקולות אלה נקשרות ישירות ל-DNMTs, מה שמציג את האפשרות לעיכוב ספציפי לאיזוזימים. מספר מעכבי נוקליאוזיד התגלו עד כה, כולל SGI-1027 21, הידרלזין 22, פרוקאינאמיד 23, RG108 ונגזרותיו24, ומוצרים טבעיים, (−)-אפיגלוקטכין 3-גלאט (EGCG)25 וחומצה לאקאית A 26,27. רוב המעכבים שאינם נוקלאוזידים שהתגלו עד כה אינם איזוזימים סלקטיביים או מציגים העדפות חלשות לאיזוזימה אחת של DNMT. בנוסף, יש לשפר את העוצמה של מולקולות אלה, במיוחד בתאים 4,18. לכן, יש צורך לגלות או לפתח מעכבי DNMT חזקים יותר, איזוזימים-סלקטיביים.
מכשול לגילוי מעכבי מולקולות קטנות חדשות של DNMTs הוא המבחנים המייגעים המשמשים באופן מסורתי לבחינת פעילות DNMT28. מבחנים הם בדרך כלל רציפים עם מספר שלבים. הפעילות האנזימטית של DNMTs עדיין נבדקת באופן שגרתי באמצעות S-אדנוזיל מתיונין רדיואקטיבי (SAM)29,30,31,32,33,34. כמו כן פותחו בדיקות לא רדיואקטיביות למתילציה של DNA. לדוגמה, בדיקות המשתמשות באנדונוקלאזות הגבלה רגישות למתיל ובאלקטרופורזה כדי להפריד בין תוצרי העיכול תוארו35,36. סוגים אלה של מבחנים רציפים, מרובי שלבים, אינם ניתנים בקלות לגילוי תרופות. מאז אמצע שנות ה-2000 פותחו מספר מבחני מתילציה של דנ"א עם תפוקה גבוהה יותר28. בדיקת קרבה של סינטילציה שימשה לבדיקת מעכבי DNMT137. בדיקה נוספת המשתמשת באנדונוקלאז הגבלה רגיש למתיל שימשה לבדיקת מעכבי DNMT3a25,38. בעוד ששני המבחנים אפשרו תפוקה גבוהה יותר מאשר מבחני מתילציה מסורתיים של DNA, הבדיקות דורשות שלבים מרובים ואינן מאפשרות תצפית על פעילות מתילציה בזמן אמת. לאחרונה תוארה בדיקת קינטיקה רציפה המשלבת את היווצרותו של S-אדנוזילהומוציסטאין (SAH), תוצר אחד של תגובת המתילציה, לשינוי הספקטרוסקופי ב-340 ננומטר הקשור לחמצון NADPH39. בדיקה זו משתמשת בשלושה אנזימי צימוד כדי ליצור אות ספקטרוסקופי.
פיתחנו בדיקת מתילציה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז המבוססת על פלואורסצנציה, המשתמשת באנזים צימוד יחיד הזמין מסחרית ויכולה להפיק נתונים בזמן אמת (איור 1). אוליגונוקלאוטיד סיכת שיער המכיל שלושה מתילציטוסינים משמש כמצע. דנ"א המצע מכיל פלואורופור בקצה 5' וקוונצ'ר בקצה 3'. מתילציה של אתר ה-CpG ההמימתילציה יוצרת את אתר המחשוף של האנדונוקלאז Gla I - GCGC שעבר מתילציה מלאה. מחשוף Gla I של המוצר אוליגונוקלאוטיד משחרר את הפלואורופור מהקוונצ'ר ומייצר פלואורסצנטיות בזמן אמת. ניתן להשתמש בבדיקה כדי לבחון את הפעילות של כל איזופורם של DNMT; עם זאת, פעילות גבוהה יותר נצפית עם DNMT1 מכיוון שאיזוזים אלה מעדיפים מתילטים של דנ"אהמימתילציה 1,5. פעילות חזקה עוד יותר נצפתה אם התחום רצף מיקוד מוקדי שכפול אוטומטי (RFTS) מוסר מ- DNMT1. תחום זה, שנמצא באזור הרגולטורי N-terminal, נקשר לאתר הקטליטי ומונע קשירת DNA. הסרת ~600 חומצות האמינו הראשונות גורמת לאנזים חתוך שפעיל יותר באופן משמעותי מהאנזים באורך מלא (עלייה של ~פי 640 ב-kcat/Km)40. צורה פעילה זו של האנזים, המכונה DNMT1 חסר RFTS (חומצות אמינו 621-1616), מאפשרת זיהוי קל יותר של מעכבים בשל הכוח הקטליטי המוגבר שלו. מאמר זה מציג פרוטוקול לשימוש ב-DNMT1 חסר RFTS במבחנים כדי לסנן מעכבי מולקולות קטנות פוטנציאליות. באמצעות הבדיקה הרציפה המצומדת לאנדונוקלאז, המהירות הראשונית נקבעת בנוכחות ובהיעדר כמה מולקולות קטנות. כל מעכב פוטנציאלי נבדק בשני ריכוזים כדי לחפש עיכוב DNMT1 תלוי ריכוז. אחוז הפעילות שנצפתה בנוכחות המולקולות הקטנות חושב בכל מקרה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> איור 1: בדיקת מתילציה של DNA. דנ"א של סיכות שיער המימתילציה עם פלואורופור בקצה 5' וקוונצ'ר בקצה 3' משמש כמצע. DNMT1 מזרז את העברת קבוצת המתיל מ-S-אדנוזיל-מתיונין לאתר CpG שאינו מתילציה, ויוצר S-אדנוזילהומוציסטאין ודנ"א שעבר מתילציה מלאה. מוצר הדנ"א מכיל את אתר הבקיעה של האנדונוקלאז Gla I, אשר מבקע אתרי GCGC שעברו מתילציה מלאה. ביקוע של דנ"א המוצר משחרר את הפלואורופור 5' מהקוונצ'ר 3', ויוצר פלואורסצנציה. קיצורים: Fl = פלואורופור; Q =quencher; DNMT1 = דנ"א מתיל-טרנספראז 1; SAM = S-אדנוזיל-מתיונין; SAH = S-אדנוזילהומוציסטאין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

מתילציה של דנ"א, סוג של ויסות גנים אפיגנטי, חשובה לתפקוד תקין של התאים. בתאים, חלבונים הנקראים דנ"א מתיל-טרנספראזות (DNMTs) קובעים ומתחזקים את תבנית המתילציה של הדנ"א. שינויים בתבנית המתילציה הרגילה של הדנ"א קשורים להתפתחות והתקדמות הסרטן, מה שהופך את ה-DNMTs למטרות פוטנציאליות של תרופות לסרטן. לפיכך, יש חשיבות רבה לזיהוי ואפיון מעכבי מולקולות קטנות חדשות של אנזימים אלה. מאמר זה מציג פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לסנן מעכבי DNA מתיל-טרנספראז. בדיקת הקינטיקה המצומדת הרציפה מאפשרת לקבוע מהירויות ראשוניות של מתילציה של דנ"א בנוכחות ובהיעדר מעכבי מולקולות קטנות פוטנציאליות. הבדיקה משתמשת באנדונוקלאז Gla I הרגיש למתיל כדי להצמיד מתילציה של מצע DNA המימתילציה ליצירת פלואורסצנציה.
בדיקה רציפה זו מאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת. ביצוע הבדיקה בכמויות קטנות בלוחות מיקרוטיטר מפחית את עלות הריאגנטים. באמצעות בדיקה זו, נערך בדיקה קטנה לדוגמה עבור מעכבי DNMT1, איזוזימה DNMT הנפוצה ביותר בבני אדם. המוצר הטבעי אנתרקווינון בעל תחליף גבוה, חומצה לקית A, הוא מעכב דנ"א חזק ותחרותי של DNMT1. כאן אנו בוחנים שלושה מעכבי מולקולות קטנות פוטנציאליות - אנתרקווינונים או מולקולות דמויות אנתרקווינון עם תחליפים אחד עד שלושה - בשני ריכוזים כדי לתאר את פרוטוקול הבדיקה. מהירויות ראשוניות משמשות לחישוב אחוז הפעילות שנצפתה בנוכחות כל מולקולה. אחת משלוש התרכובות שנבדקו מציגה עיכוב תלוי ריכוז של פעילות DNMT1, מה שמצביע על כך שהיא מעכבת פוטנציאלית של DNMT1.

DNMT1 פעיל הוא תנאי מוקדם לניתוח זה. DNMT1 חסר RFTS התבטא ב - E.coli וטוהר להומוגניות בעקבות נהלים שפורסמו בעבר41. כדי להבטיח שהאנזים המטוהר היה פעיל, נעשה שימוש בבדיקה רציפה מצומדת אנדונוקלאז כדי לבחון את פעילות המתילציה של הדנ"א36. בדיקה זו משתמשת בדנ"א דו-צדדי של זוג בס?...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

בדיקת קורא צלחות חזקה כמו שלנו שימושית מאוד לסינון ראשוני של מעכבי מתיל-טרנספראז פוטנציאליים. היכולת לאסוף נתונים בזמן אמת היא יתרון גדול של הבדיקה הרציפה של אנדונוקלאז. התחילו בהכנת 600 מיקרוליטרים של תנאי הבדיקה המכילים 20 מיקרומולרים ו-50 תרכובות מיקרומולריות בנפרד בצינורות המיקרוצנטריפוגה על הקרח.לשם כך, הוסיפו מים מזוקקים כפולים וחיץ מתילציה 5X לכל צינור כדי להשיג ריכוז סופי של חיץ מתילציה 1X. לאחר מכן, הוסף 3.15 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר אלבומין בסרום בקר, או BSA, לכל דגימה. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מצע DNA של 3.15 מיקרומולרים ו-1.33 מיקרוליטרים של 4.75 מיקרומולר S-אדנוזיל-מתיונין, או SAM, לכל דגימה.הוסף מעכב לדגימות המתאימות כדי להשיג ריכוז סופי של 21 מיקרומולאר או 52.5 מיקרומולאר וכמות שווה ערך של דימתיל סולפוקסיד, או DMSO, לדגימת בקרה לפני ערבוב התמיסות על ידי מערבולת ב -3, 000 סיבובים לדקה למשך שלוש שניות. לאחר מכן, סובבו את הדגימות למשך מספר שניות בשולחן מיני צנטריפוגה בגודל 1, 200 פעמים G כדי להבטיח שהפתרון ייאסף בתחתית הצינור. Aliquot 95 מיקרוליטר של כל תמיסת בדיקה לשש בארות רצופות בצלחת באר שחורה של חצי אזור 96.הכן 75 מיקרוליטרים של Gla I או DNMT1 בתוספת תמיסת אנזים Gla I בצינורות המיקרוצנטריפוגה כפי שתואר קודם לריכוז סופי של חיץ חד פעמי. לאחר מכן, הוסף 1.2 מיקרוליטר של 10 יחידות למיקרוליטר Gla I לכל תמיסה כדי להשיג ריכוז סופי של 0.16 יחידות למיקרוליטר. הוסף 0.6 מיקרוליטרים של חמישה DNMT1 חסרי RFTS מיקרומולרי לתמיסת DNMT1 בתוספת Gla I לקבלת ריכוז סופי של 40 ננו-מולר.לאחר ערבוב עדין, סובבו את הדגימות למשך מספר שניות בצנטריפוגה שולחנית בגודל 1, 200 גרם כדי לוודא שהתמיסה נאספת בתחתית הצינור. לאחר מכן, aliquot 12 microliters של כל תמיסת אנזים לתוך שש בארות בצלחת תחתית חרוטית 96 באר. לצורך בדיקת המתילציה של דגימת הדנ"א, מחממים מראש את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הכנס את הלוח השחור המכיל את תמיסות הבדיקה בקורא הלוחות. לאחר ניעור הצלחת ב-425 קמ"ש, יש למדוד את הפלואורסצנציה באורך גל עירור של 485 ננומטר ובאורך גל פליטה של 528 ננומטר. לאחר מכן, לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.הסר את צלחת הבדיקה מקורא הצלחות והוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת האנזים לכל באר, ולאחר מכן ערבב את התמיסה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הכנס את הצלחת לקורא הצלחות ונער את הצלחת לפני הקלטת הפלואורסצנטיות כל 53 שניות למשך 30 דקות. קבל את הפלואורסצנטיות הממוצעת של מבחני הבקרה המשולשים של Gla I עבור כל תנאי והפחת את ה- Gla I הממוצע המכיל מגשי תגובת בקרה מהעקבות המשולשים המתקבלים בנוכחות DNMT1 חסר RFTS.לאחר מכן, קבע את השגיאה הממוצעת והסטנדרטית של הממוצע עבור המשכפלים המתוקנים. התווה את עקבות התגובה המתוקנת הממוצעת והתאם את החלק הליניארי ההתחלתי לקו כדי לקבוע את המהירות ההתחלתית. קבע את אחוז הפעילות על ידי חלוקת המהירות שנצפתה בנוכחות תרכובת על ידי המהירות שנצפתה ב- DMSO המכילה תגובת בקרה והכפלה ב- 100.התוצאות של בדיקה מצומדת אנדונוקלאז בלתי פוסקת הראו כי דנ"א של מוצר שעבר מתילציה מלאה מוגן מפני ביקוע, ואישרו כי DNMT1 חסר RFTS פעיל ומסוגל לבצע מתילציה של דנ"א המצע ההמימתילציה. בבדיקה מבוססת פלואורסצנציה, בהיעדר Gla I, התוספת של DNMT1 או חיץ בלבד לא השפיעה על פלואורסצנציה ברקע. הוספה מאוחרת יותר של Gla I לכל המבחנים הביאה ליצירת פלואורסצנציה רק במבחנים שהכילו DNMT1.התוספת המקבילה של DNMT1 ו-Gla I חסרי RFTS לשלושה מבחנים הביאה ליצירת פלואורסצנציה חזקה. התוספת של Gla I לבדה לא יצרה פלואורסצנציה. כדי לסנן מעכבים פוטנציאליים, נבדקה פעילות המתילציה של DNMT1 חסר RFTS בנוכחות DMSO, תרכובת אחת, תרכובת שתיים או תרכובת שלוש בריכוזים של 20 ו-50 מיקרומולר.התרכובות המפחיתות את יצירת הפלואורסצנציה במבחן מצומד זה חייבות לקבל תוקף נוסף. ההבטחה שהתרכובות אינן מעכבות את אנזים הצימוד היא השלב הבא החשוב.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...