Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Forfatterne takker Bucknell University og Institutt for kjemi for deres støtte til dette arbeidet.

1. Forbered analyseløsninger for skjermen
MERK: Konsentrasjonene av substrater som brukes i denne analysen kan tilpasses. For RFTS-manglende DNMT1 er de eksperimentelt bestemte Km-verdiene for hårnåls-DNA-substratet og SAM henholdsvis 1–2 nM og 2 μM, henholdsvis26,40.
<ol><li>Forbered 600 μL av hver analysetilstand som testes i mikrosentrifugerør på is. MERK: Det totale volumet av analyseløsni...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disease-associated+germline+mutations+on+structure+function+relationship+of+DNA+methyltransferases.">Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases.</a> Genes. 10 (5), 369 (2019).</li><li>Foulks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+drug+discovery:+targeting+DNA+methyltransferases.">Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).</li><li>Goll, M. G., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+cytosine+methyltransferases.">Eukaryotic cytosine methyltransferases.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).</li><li>Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+human+DNA+Methyltransferase+(dnmt1)+gene.">Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene.</a> Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).</li><li>Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+3'-untranslated+element+mediates+growth+regulation+of+DNA+methyltransferase+1+and+inhibits+its+transforming+activity.">A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).</li><li>MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+methylation+by+the+Ras+signaling+pathway.">Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).</li><li>Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+is+a+downstream+effector+of+cellular+transformation+triggered+by+simian+virus+40+large+T+antigen.">DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).</li><li>Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genetic+suppression+of+polyp+formation+and+reduction+of+CpG-island+hypermethylation+in+Apc(Min/+)+Dnmt1-hypomorphic+mice.">Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice.</a> Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).</li><li>MacLeod, A. R., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+antisense+to+DNA+methyltransferase+mRNA+induces+DNA+demethylation+and+inhibits+tumorigenesis.">Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).</li><li>Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumorigenesis+by+a+cytosine-DNA,+methyltransferase,+antisense+oligodeoxynucleotide.">Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).</li><li>Ley, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).</li><li>Walter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+DNMT3A+mutations+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).</li><li>Russler-Germain, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R882H+DNMT3A+mutation+associated+with+AML+dominantly+inhibits+wild-type+DNMT3A+by+blocking+its+ability+to+form+active+tetramers.">The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers.</a> Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).</li><li>Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3b+overexpression+contributes+to+a+hypermethylator+phenotype+in+human+breast+cancer+cell+lines.">DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.</a> Molecular Cancer. 7, 15 (2008).</li><li>Nosho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3B+expression+might+contribute+to+CpG+island+methylator+phenotype+in+colorectal+cancer.">DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.</a> Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).</li><li>Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+methylation+with+small+molecules:+what's+next.">Targeting DNA methylation with small molecules: what's next.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).</li><li>Chuang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S110,+a+5-Aza-2'-deoxycytidine-containing+dinucleotide,+is+an+effective+DNA+methylation+inhibitor+in+vivo+and+can+reduce+tumor+growth.">S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).</li><li>Issa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+guadecitabine+(SGI-110)+in+patients+with+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukaemia:+a+multicentre,+randomised,+dose-escalation+phase+1+study.">Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study.</a> Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).</li><li>Datta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+quinoline-based+DNA+hypomethylating+agents+reactivates+tumor+suppressor+genes+by+blocking+DNA+methyltransferase+1+activity+and+inducing+its+degradation.">A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation.</a> Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).</li><li>Zambrano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+hydralazine+to+demethylate+and+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes.">A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes.</a> BMC Cancer. 5, 44 (2005).</li><li>Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procainamide+is+a+specific+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).</li><li>Asgatay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+analogues+of+N-phthaloyl-l-tryptophan+(RG108)+as+inhibitors+of+DNA+methyltransferase+1.">Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C5-DNA+methyltransferase+inhibitors:+from+screening+to+effects+on+zebrafish+embryo+development.">C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development.</a> Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).</li><li>Fagan, R. L., Wu, M., Ch&#233;din, F., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+high+throughput+screen+for+DNA+methyltransferase+1-targeted+molecular+probes.">An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes.</a> PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).</li><li>Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccaic+acid+A+is+a+direct,+DNA-competitive+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).</li><li>Eglen, R. M., Reisine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+compounds+that+modulate+epigenetic+regulation+of+the+transcriptome:+an+overview.">Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).</li><li>Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DNA+methyltransferase+(DNMT3A)+observed+in+acute+myeloid+leukemia+patients+disrupt+processive+methylation.">Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).</li><li>Norvil, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3b+methylates+DNA+by+a+noncooperative+mechanism,+and+its+activity+is+unaffected+by+manipulations+at+the+predicted+dimer+interface.">Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface.</a> Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).</li><li>Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+details+of+the+DNA+recognition+by+the+Dnmt1+DNA+methyltransferase.">Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase.</a> FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain.">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li><li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+(SRA)+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA.">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li><li>Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+threonine+1505+in+the+catalytic+domain+stabilizes+mouse+DNA+methyltransferase+1.">Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Dnmt1+for+methylation+of+hemimethylated+CpG+sites+resides+in+its+catalytic+domain.">Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain.</a> Chemistry &amp; Biology. 19 (5), 572-578 (2012).</li><li>Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+mutations+G589A+and+V590F+relieve+replication+focus+targeting+sequence-mediated+autoinhibition+of+DNA+methyltransferase+1.">Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1.</a> Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).</li><li>Kilgore, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNMT1+selective+antagonists+using+a+novel+scintillation+proximity+assay.">Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+inhibitors+of+DNA+methylation+by+screening+of+a+chemical+library.">Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).</li><li>Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+kinetic+assay+for+protein+and+DNA+methyltransferase+enzymatic+activities.">A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 8, 56 (2015).</li><li>Syeda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replication+focus+targeting+sequence+(RFTS)+domain+is+a+DNA-competitive+inhibitor+of+Dnmt1.">The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).</li><li>Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituted+anthraquinones+represent+a+potential+scaffold+for+DNA+methyltransferase+1-specific+inhibitors.">Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors.</a> PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).</li></ol>

For å identifisere og karakterisere inhibitorer av DNA-metyltransferaser, må enzymets aktivitet måles. Det finnes flere metoder for å undersøke DNA-metyltransferaseaktivitet. Aktivitet overvåkes vanligvis ved hjelp av radioaktivitet; overføring av den merkede metylgruppen av SAM kan kvantifiseres 29,30,31,32,33,34. Gel...

DNA-metylering er et viktig epigenetisk merke som regulerer genuttrykk og kromatinstruktur. Metylering forekommer hovedsakelig i CpG-dinukleotider - cytosin etterfulgt av guanosin; metylgruppen tilsettes til 5-posisjonen av cytosin. Korrekte DNA-metyleringsmønstre, og dermed riktig genuttrykk, er nødvendig for passende cellulær utvikling og funksjon. Mange sykdomstilstander har vært assosiert med endringer i det normale metyleringsmønsteret 1,2,3. For eksempel er det en sammenheng mellom kreftinitiering og progresjon og endringer i DNA-metyleringsmønsteret. Vanligvis viser kreftceller lavere generelle nivåer av metylcytosin, noe som bidrar til ustabilitet i genomet. Samtidig er metylcytosinet som er tilstede i genomet konsentrert i promotorområdene av tumorundertrykkende gener, noe som fører til geninaktivering av disse viktige proteinene. Spesielt er epigenetiske endringer dynamiske og reversible, i motsetning til DNA-mutasjonene forbundet med tumorigenese. Dette har gjort proteinene involvert i epigenetisk genregulering interessante legemiddelmål 2,4.
DNA-metyltransferaser (DNMT) er proteinene som er ansvarlige for å generere og opprettholde DNA-metyleringsmønstre. Tre katalytisk aktive isoenzymer, DNMT1, DNMT3a og DNMT3b, finnes hos mennesker. Under utvikling og differensiering etablerer de novo metyltransferaser, DNMT3a og DNMT3b, metyleringsmønstre. Begge enzymene kan binde det katalytisk inaktive DNMT3L-proteinet for å danne komplekser som viser økt aktivitet 1,5. Etter celledeling inneholder datterceller hemimetylert DNA - DNA som inneholder metylcytosin i bare en streng av dupleks - fordi det nylig syntetiserte DNA er blottet for metyleringsmerker. Hovedfunksjonen til DNMT1 er å metylere dette hemimetylerte DNA, og dermed gjenopprette det fulle metyleringsmønsteret 1,5.
Koblinger mellom DNMT aktivitet og kreft er godt etablert. Overekspresjon av DNMT1, enten ved transkripsjonelle eller posttranslasjonelle mekanismer, er en konsekvens av flere vanlige onkogene veier 6,7,8,9. Genetiske tilnærminger til lavere DNMT1-aktivitet ved bruk av hypomorfe alleler resulterer i redusert tumordannelse hos Apc(Min)mus10. Antisense oligonukleotider som knockdown DNMT1 hemmer neoplasi i cellekultur og musetumormodeller11,12. Dermed virker hemming av DNMT1-aktivitet som en lovende kreftbehandlingsmetode. Rollene DNMT3-isozymene spiller er imidlertid ikke så enkle. DNMT3a-mutasjoner finnes ved akutt myelogen leukemi13 og myelodysplastisk syndrom14. Minst en av de identifiserte mutasjonene har vist seg å redusere DNA-metyleringsaktiviteten til enzymet15. DNMT3b er imidlertid overuttrykt i brystkreft16 og kolorektal kreft17. Med de forskjellige DNMT-isoenzymene som spiller forskjellige roller i karsinogenese, vil identifisering av isozymespesifikke hemmere være kritisk. Ikke bare vil disse forbindelsene være nyttige for utvikling av terapeutiske midler, men isozyme-spesifikke hemmere vil også være et uvurderlig verktøy for å dissekere rollen til hver DNMT-isozyme i kreftetiologi.
Flere DNMT-hemmere er rapportert i litteraturen. Kjente DNMT-hemmere kan deles inn i to klasser: nukleosid og ikke-nukleosid. Nukleosidhemmere er vanligvis cytidinanaloger. Disse forbindelsene er inkorporert i DNA og kovalent felle DNMTs. 5-azacytidin og 5-aza-2'-deoksycytidin er godkjent for behandling av myelodysplastisk syndrom og akutt myelogen leukemi 4,18. Den høye toksisiteten, lav biotilgjengelighet og kjemisk ustabilitet av disse forbindelsene gir problemer. Pågående arbeid undersøker effekten av neste generasjon nukleosidhemmere; SGI-110, avledet fra 5-aza-2'-deoksycytidin, er et eksempel 19,20. Nukleosidhemmere er ikke isozymespesifikke og vil inaktivere ethvert dnmt-isoenzym som oppstår. Derfor resulterer behandling med et nukleosid-demetyleringsmiddel i uttømming av alle DNMT-isoenzymer 4,18. Ikke-nukleosidhemmere trenger ikke å bli innlemmet i DNA for å utøve sine hemmende effekter. I stedet binder disse molekylene seg direkte til DNMT, og introduserer muligheten for isozymespesifikk inhibering. Flere ikke-nukleosidhemmere har blitt oppdaget til dags dato, inkludert SGI-1027 21, hydralazin22, prokainamid 23, RG108 og derivater 24, og naturlige produkter, (−)-epigallocatechin 3-gallate (EGCG)25 og lakkasyre A26,27. De fleste av de ikke-nukleosidhemmere oppdaget til dags dato er ikke isozyme-selektive eller vise svake preferanser for en DNMT isozyme. I tillegg må styrken til disse molekylene forbedres, spesielt i celler 4,18. Dermed er det behov for å oppdage eller utvikle mer potente, isozymeselektive DNMT-hemmere.
Et hinder for å oppdage nye små molekylhemmere av DNMTs er de arbeidskrevende analysene som tradisjonelt brukes til å undersøke DNMT-aktivitet28. Analyser er vanligvis diskontinuerlige med flere trinn. Den enzymatiske aktiviteten til DNMTs er fortsatt rutinemessig analysert ved bruk av radioaktiv S-adenosylmetionin (SAM) 29,30,31,32,33,34. Ikke-radioaktive analyser for DNA-metylering er også utviklet. For eksempel er analyser som benytter metylfølsomme restriksjonsendonukleaser og elektroforese for å skille fordøyelsesproduktene beskrevet35,36. Denne typen diskontinuerlige, flertrinnsanalyser er ikke lett mottagelige for narkotikaforskning. Siden midten av 2000-tallet har flere DNA-metyleringsanalyser med høyere gjennomstrømning blitt utviklet28. En scintillasjonsnærhetsanalyse ble brukt til å screene for DNMT1-hemmere37. En annen analyse ved bruk av en metylfølsom restriksjonsendonuklease ble brukt til å screene for DNMT3a-hemmere25,38. Mens begge analysene tillot høyere gjennomstrømning enn tradisjonelle DNA-metyleringsanalyser, krever analysene flere trinn og tillater ikke observasjon av metyleringsaktivitet i sanntid. Mer nylig er det beskrevet en kontinuerlig kinetikkanalyse som parrer dannelsen av S-adenosylhomocystein (SAH), et produkt av metyleringsreaksjonen, til den spektroskopiske forandringen ved 340 nm assosiert med NADPH-oksidasjon39. Denne analysen bruker tre koblingsenzymer for å generere et spektroskopisk signal.
Vi utviklet en fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse som benytter et enkelt kommersielt tilgjengelig koblingsenzym og kan generere data i sanntid (figur 1). Et hårnålsoligonukleotid som inneholder tre metylcytosiner brukes som substrat. Substrat-DNA inneholder en fluorofor på 5'-enden og en slukker på 3'-enden. Metylering av det hemimetylerte CpG-området genererer spaltningsstedet for endonuklease Gla I - fullt metylert GCGC. Gla I-spaltning av produktet oligonukleotid frigjør fluoroforen fra slukkeren og genererer fluorescens i sanntid. Analysen kan brukes til å undersøke aktiviteten til en hvilken som helst isoform av DNMT; Imidlertid observeres høyere aktivitet med DNMT1, da dette isozymet fortrinnsvis metylerer hemimetylert DNA 1,5. Enda mer robust aktivitet observeres hvis domenet autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) fjernes fra DNMT1. Dette domenet, som finnes i N-terminalreguleringsområdet, binder seg til det katalytiske stedet og forhindrer DNA-binding. Fjerning av de første ~ 600 aminosyrene resulterer i et avkortet enzym som er betydelig mer aktivt enn enzymet i full lengde (~ 640 ganger økning i kcat / Km) 40. Denne aktiverte formen av enzymet, referert til som RFTS-manglende DNMT1 (aminosyrer 621-1616), muliggjør lettere identifisering av inhibitorer på grunn av sin økte katalytiske kraft. Dette papiret presenterer en protokoll for å bruke RFTS-manglende DNMT1 i analyser for å skjerme for potensielle små molekylhemmere. Ved bruk av endonukleasekoblet kontinuerlig analyse bestemmes starthastigheten i nærvær og fravær av noen få små molekyler. Hver potensiell hemmer undersøkes i to konsentrasjoner for å se etter konsentrasjonsavhengig DNMT1-hemming. Den prosentvise aktiviteten observert i nærvær av de små molekylene ble beregnet i hvert tilfelle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Figur 1: DNA-metyleringsanalyse. Et hemimetylert hårnåls-DNA med en fluorofor på 5'-enden og en slukker på 3'-enden brukes som substrat. DNMT1 katalyserer overføringen av metylgruppen fra S-adenosylmetionin til det ikke-metylerte CpG-stedet, genererer S-adenosylhomocystein og fullt metylert DNA. DNA-produktet inneholder spaltningsstedet for endonuklease Gla I, som klipper fullt metylerte GCGC-steder. Spaltning av produkt-DNA frigjør 5'-fluoroforen fra 3'-slukkeren, og genererer fluorescens. Forkortelser: Fl = fluorofor; Q = slukke; DNMT1 = DNA-metyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionine; SAH = S-adenosylhomocystein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

DNA-metylering, en form for epigenetisk genregulering, er viktig for normal cellulær funksjon. I celler etablerer og opprettholder proteiner kalt DNA-metyltransferaser (DNMT) DNA-metyleringsmønsteret. Endringer i det normale DNA-metyleringsmønsteret er knyttet til kreftutvikling og progresjon, noe som gjør DNMTs potensielle kreftmedisinmål. Dermed er identifisering og karakterisering av nye små molekylhemmere av disse enzymene av stor betydning. Dette papiret presenterer en protokoll som kan brukes til å skjerme for DNA-metyltransferasehemmere. Den kontinuerlige koblede kinetikkanalysen gjør det mulig å bestemme innledende hastigheter av DNA-metylering i nærvær og fravær av potensielle små molekylhemmere. Analysen bruker den metylfølsomme endonuklease Gla I til å koble metylering av et hemimetylert DNA-substrat til fluorescensgenerering.
Denne kontinuerlige analysen gjør det mulig å overvåke enzymaktiviteten i sanntid. Gjennomføring av analysen i små mengder i mikrotiterplater reduserer kostnadene for reagenser. Ved hjelp av denne analysen ble det utført en liten eksempelskjerm for hemmere av DNMT1, den mest omfattende DNMT-isozymen hos mennesker. Det svært substituerte naturproduktet antrakinon, lakkasyre A, er en potent, DNA-kompetitiv hemmer av DNMT1. Her undersøker vi tre potensielle små molekylhemmere - antrakinoner eller antrakinonlignende molekyler med en til tre substituenter - i to konsentrasjoner for å beskrive analyseprotokollen. Innledende hastigheter brukes til å beregne prosentaktiviteten observert i nærvær av hvert molekyl. En av tre undersøkte forbindelser utviser konsentrasjonsavhengig hemming av DNMT1-aktivitet, noe som indikerer at det er en potensiell hemmer av DNMT1.

Aktiv DNMT1 er en forutsetning for denne analysen. RFTS-manglende DNMT1 ble uttrykt i E.coli og renset til homogenitet etter tidligere publiserte prosedyrer41. For å sikre at det rensede enzymet var aktivt, ble en diskontinuerlig endonukleasekoblet analyse brukt til å undersøke DNA-metyleringsaktivitet36. Denne analysen benytter et 32 basepar dupleks DNA med en enkelt hemimetylert CpG plassert i et Sau3A1-spaltningssted. Sau3A1 kan spalte det hemimetylerte subst...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA-metyltransferaser er potensielle kreftmedisinmål. Her presenteres en protokoll for å vurdere små molekyler for DNA-metyltransferasehemming. Denne analysen benytter en endonuklease for å koble DNA-metylering til fluorescensgenerering og gjør det mulig å overvåke enzymaktivitet i sanntid.

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

En robust plateleseranalyse som vår er svært nyttig for den første screeningen av potensielle metyltransferasehemmere. Muligheten til å samle inn data i sanntid er en stor fordel med den kontinuerlige endonukleasekoblede analysen. Start med å fremstille 600 mikroliter av analysebetingelsene som inneholder 20 mikromolare og 50 mikromolare forbindelser separat i mikrosentrifugerørene på is.For å gjøre det, tilsett dobbelt destillert vann og 5X metyleringsbuffer til hvert rør for å oppnå en endelig konsentrasjon av 1X metyleringsbuffer. Deretter legger du til 3,15 mikroliter 20 milligram per milliliter bovint serumalbumen, eller BSA, til hver prøve. Deretter legger du til to mikroliter 3,15 mikromolar hårnåls-DNA-substrat og 1,33 mikroliter 4,75 mikromolar S-adenosylmetionin, eller SAM, til hver prøve.Tilsett inhibitor til de aktuelle prøvene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 21 mikromolar eller 52,5 mikromolar og en tilsvarende mengde dimetylsulfoksid, eller DMSO, til en kontrollprøve før oppløsningene blandes ved vortexing ved 3.000 rotasjoner per minutt i tre sekunder. Spinn deretter prøvene i noen sekunder i et bordbord mini sentrifuge ved 1, 200 ganger G for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret. Aliquot 95 mikroliter av hver analyseløsning i seks påfølgende brønner i en svart halvareal 96 brønnplate.Forbered 75 mikroliter Gla I eller DNMT1 pluss Gla I enzymoppløsning i mikrosentrifugerørene som beskrevet før til en endelig konsentrasjon av engangsbuffer. Deretter tilsettes 1,2 mikroliter 10 enheter per mikroliter Gla I til hver løsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,16 enheter per mikroliter. Tilsett 0,6 mikroliter fem mikromolære RFTS-manglende DNMT1 til DNMT1 pluss Gla I-løsningen for en endelig konsentrasjon på 40 nanomolar.Etter forsiktig blanding, spinn prøvene i noen sekunder i en bordplate mini sentrifuge ved 1.200 G for å sikre at løsningen samles i bunnen av røret. Deretter aliquot 12 mikroliter av hver enzymløsning i seks brønner i en koniskbunnet 96 brønnplate. For metyleringsanalysen av DNA-prøven, forvarm plateleseren til 37 grader Celsius.Sett deretter inn den svarte platen som inneholder analyseløsningene i plateleseren. Etter å ha ristet platen ved 425 CPM, måler du fluorescensen med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nanometer og en utslippsbølgelengde på 528 nanometer. Deretter inkuberer platen ved 37 grader Celsius i fem minutter.Fjern analyseplaten fra plateleseren og tilsett fem mikroliter av enzymoppløsningen til hver brønn, etterfulgt av blanding av løsningen ved pipettering opp og ned. Sett platen inn i plateleseren og rist platen før du registrerer fluorescensen hvert 53. sekund i 30 minutter. Oppnå gjennomsnittlig fluorescens av de tredoble Gla I-kontrollanalysene for hver tilstand og trekk de gjennomsnittlige Gla I-holdige kontrollreaksjonsbrettene fra de tredoble sporene oppnådd i nærvær av RFTS-manglende DNMT1.Deretter bestemmer du gjennomsnittet og standardfeilen for gjennomsnittet for de korrigerte replikasjonene. Plott det gjennomsnittlige korrigerte reaksjonssporet og tilpass den første lineære delen til en linje for å bestemme starthastigheten. Bestem prosentaktiviteten ved å dele hastigheten observert i nærvær av en forbindelse med hastigheten observert i DMSO som inneholder kontrollreaksjon og multipliserer med 100.Resultatene av en diskontinuerlig endonukleasekoblet analyse viste at fullt metylert produkt-DNA er beskyttet mot spaltning, noe som bekrefter at RFTS-manglende DNMT1 er aktiv og i stand til å metylere det hemimetylerte substrat-DNA. I den fluorescensbaserte analysen, i fravær av Gla I, påvirket ikke tilsetningen av DNMT1 eller buffer alene bakgrunnsfluorescensen. Senere tillegg av Gla I til alle analyser resulterte i fluorescensgenerering bare i analyser som inneholdt DNMT1.Den samtidige tilsetningen av RFTS-manglende DNMT1 og Gla I til tre analyser resulterte i robust fluorescensgenerering. Tilsetningen av Gla I alene ga ingen fluorescens. For å screene for potensielle hemmere ble DNA-metyleringsaktiviteten til RFTS-manglende DNMT1 undersøkt i nærvær av DMSO, forbindelse en, forbindelse to eller forbindelse tre ved 20 og 50 mikromolare konsentrasjoner.Forbindelsene som reduserer fluorescensgenerering i denne koblede analysen må valideres ytterligere. Å sikre at forbindelsene ikke hemmer koblingsenzymet er et viktig neste skritt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En fluorescens-baserte analysen av fosfolipid Scramblase aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering for å studere Transport av molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet analysen med nær-infrarøde fluorescerende merket DNA visualisert ved akrylamid Gel geleelektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

En Fluorogenic peptid Cleavage analysen til skjermen for proteolytiske: programmer for coronavirus pigge protein aktivisering

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA Sequence anerkjennelse av DNA Primase ved hjelp av høy gjennomstrømming Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enkeltmolekylavbildning av EWS-FLI1-kondensater som monteres på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glykosylaseanalyse ved matriseassistert laserdesorpsjon/ioniseringstid for massespektrometrianalyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spektroskopi for å studere DNA-proteininteraksjoner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Klar til bruk qPCR for påvisning av DNA fra Trypanosoma cruzi eller andre patogene organismer

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...