Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Os autores agradecem à Universidade de Bucknell e ao Departamento de Química por seu apoio a este trabalho.

1. Prepare soluções de ensaio para a tela
NOTA: As concentrações de substratos utilizadas neste ensaio podem ser adaptadas. Para DNMT1 sem RFTS, os valores de Km determinados experimentalmente para o substrato de DNA do hairpin e SAM são 1–2 nM e 2 μM, respectivamente26,40.
<ol><li>Preparar 600 μL de cada condição de ensaio que está sendo testada em tubos de microcentrífuga sobre gelo. NOTA...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. 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Para identificar e caracterizar inibidores de DNA metiltransferases, a atividade da enzima deve ser medida. Existem vários métodos para examinar a atividade da DNA metiltransferase. A atividade é comumente monitorada usando radioatividade; a transferência do grupo metilo marcado da SAM pode ser quantificada 29,30,31,32,33,34</s...

A metilação do DNA é uma importante marca epigenética que regula a expressão gênica e a estrutura da cromatina. A metilação ocorre predominantemente nos dinucleotídeos CpG — citosina seguida de guanosina; o grupo metilo é adicionado à posição 5 da citosina. Padrões corretos de metilação do DNA e, portanto, a expressão gênica adequada, são necessários para o desenvolvimento e a função celular apropriados. Muitos estados patológicos têm sido associados a alterações no padrão normal de metilação 1,2,3. Por exemplo, existe uma ligação entre o início e a progressão do câncer e alterações no padrão de metilação do DNA. Normalmente, as células cancerosas exibem níveis gerais mais baixos de metilcitosina, o que contribui para a instabilidade do genoma. Ao mesmo tempo, a metilcitosina que está presente no genoma está concentrada nas regiões promotoras dos genes supressores de tumor, o que leva ao silenciamento genético dessas proteínas importantes. Notavelmente, as alterações epigenéticas são dinâmicas e reversíveis, ao contrário das mutações no DNA associadas à tumorigênese. Isso tornou as proteínas envolvidas na regulação epigenética gênica alvos de drogas interessantes 2,4.
As metiltransferases de DNA (DNMTs) são as proteínas responsáveis por gerar e manter os padrões de metilação do DNA. Três isozimas cataliticamente ativas, DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, existem em humanos. Durante o desenvolvimento e diferenciação, as metiltransferases de novo, DNMT3a e DNMT3b, estabelecem padrões de metilação. Ambas as enzimas podem se ligar à proteína DNMT3L cataliticamente inativa para formar complexos que exibem atividade aumentada 1,5. Após a divisão celular, as células filhas contêm DNA hemimetilado - DNA contendo metilcitosina em apenas uma fita do duplex - porque o DNA recém-sintetizado é desprovido de marcas de metilação. A principal função do DNMT1 é metilar esse DNA hemimetilado, restabelecendo assim o padrão completo de metilação 1,5.
As ligações entre a atividade da DNMT e o câncer estão bem estabelecidas. A superexpressão de DNMT1, seja por mecanismos transcricionais ou pós-traducionais, é consequência de várias vias oncogênicas comuns 6,7,8,9. Abordagens genéticas para menor atividade da DNMT1 usando alelos hipomórficos resultam em diminuição da formação tumoral em camundongos Apc(Min)10. Os oligonucleotídeos antisense que derrubam a DNMT1 inibem a neoplasia em modelos de cultura celular e tumores de camundongos11,12. Assim, inibir a atividade da DNMT1 parece ser uma abordagem promissora de terapia contra o câncer. No entanto, os papéis que as isozimas DNMT3 desempenham não são tão simples. As mutações DNMT3a são encontradas na leucemia mieloide aguda13 e na síndrome mielodisplásica14. Pelo menos uma das mutações identificadas demonstrou diminuir a atividade de metilação do DNA da enzima15. No entanto, o DNMT3b é superexpresso no câncer de mama16 e no câncer colorretal17. Com as várias isozimas DNMT desempenhando papéis diferentes na carcinogênese, a identificação de inibidores específicos de isoenzimas será crítica. Não só esses compostos serão úteis para o desenvolvimento de terapias, mas os inibidores específicos da isoenzima também seriam uma ferramenta inestimável para dissecar o papel de cada isoenzima DNMT na etiologia do câncer.
Vários inibidores de DNMT têm sido relatados na literatura. Os inibidores conhecidos da DNMT podem ser divididos em duas classes: nucleosídeo e não nucleosídeo. Os inibidores de nucleosídeos são tipicamente análogos da citidina. Esses compostos são incorporados ao DNA e retêm covalentemente DNMTs. 5-azacitidina e 5-aza-2'-desoxicitidina foram aprovados para o tratamento da síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda 4,18. A alta toxicidade, a baixa biodisponibilidade e a instabilidade química desses compostos apresentam problemas. O trabalho em andamento está examinando a eficácia da próxima geração de inibidores de nucleosídeos; SGI-110, derivado de 5-aza-2'-desoxicitidina, é um exemplo19,20. Os inibidores de nucleosídeos não são específicos da isoenzima e inativarão qualquer isoenzima DNMT encontrada. Portanto, o tratamento com um agente nucleosídeo-desmetilante resulta na depleção de todas as isozimas DNMT 4,18. Os inibidores não nucleosídeos não precisam ser incorporados ao DNA para exercer seus efeitos inibitórios. Em vez disso, essas moléculas se ligam diretamente aos DNMTs, introduzindo a possibilidade de inibição específica da isozima. Vários inibidores não nucleosídeos foram descobertos até o momento, incluindo SGI-102721, hidralazina 22, procainamida 23, RG108 e derivados 24, e produtos naturais, (−)-epigalocatequina 3-galato (EGCG)25 e ácido lacáico A 26,27. A maioria dos inibidores não-nucleosídeos descobertos até o momento não são seletivos de isoenzima ou exibem preferências fracas para uma isoenzima DNMT. Além disso, a potência dessas moléculas precisa ser melhorada, principalmente nas células 4,18. Assim, há uma necessidade de descobrir ou desenvolver inibidores de DNMT mais potentes e seletivos de isozima.
Um obstáculo para a descoberta de novos inibidores de pequenas moléculas de DNMTs são os ensaios laboriosos tradicionalmente usados para examinar a atividade da DNMT28. Os ensaios geralmente são descontínuos com várias etapas. A atividade enzimática dos DNMTs ainda é rotineiramente ensaiada utilizando S-adenosilmetionina radioativa (SAM)29,30,31,32,33,34. Ensaios não radioativos para metilação do DNA também foram desenvolvidos. Por exemplo, ensaios utilizando endonucleases de restrição sensíveis à metila e eletroforese para separar os produtos da digestão têm sido descritos35,36. Esses tipos de ensaios descontínuos e em várias etapas não são facilmente passíveis de descoberta de medicamentos. Desde meados dos anos 2000, vários ensaios de metilação de DNA com maior rendimento foram desenvolvidos28. Um ensaio de proximidade de cintilação foi utilizado para triagem de inibidores de DNMT137. Outro ensaio utilizando endonuclease de restrição sensível à metila foi utilizado para rastrear inibidores de DNMT3a25,38. Embora ambos os ensaios tenham permitido um rendimento mais elevado do que os ensaios tradicionais de metilação do ADN, os ensaios requerem várias etapas e não permitem a observação da atividade de metilação em tempo real. Mais recentemente, um ensaio de cinética contínua tem sido descrito que acopla a formação de S-adenosilhomocisteína (HAS), um produto da reação de metilação, à alteração espectroscópica a 340 nm associada à oxidação do NADPH39. Este ensaio utiliza três enzimas de acoplamento para gerar um sinal espectroscópico.
Desenvolvemos um ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease baseado em fluorescência que utiliza uma única enzima de acoplamento comercialmente disponível e pode gerar dados em tempo real (Figura 1). Um oligonucleotídeo hairpin contendo três metilcitosinas é usado como substrato. O DNA do substrato contém um fluoróforo na extremidade 5' e um quencher na extremidade 3'. A metilação do sítio CpG hemimetilado gera o sítio de clivagem para a endonuclease Gla I — GCGC totalmente metilado. A clivagem Gla I do oligonucleotídeo do produto libera o fluoróforo do quencher e gera fluorescência em tempo real. O ensaio pode ser usado para examinar a atividade de qualquer isoforma de DNMT; no entanto, observa-se maior atividade com DNMT1, pois esta isoenzima preferencialmente metila o DNA hemimetilado 1,5. Atividade ainda mais robusta é observada se o domínio RFTS (Replication Foci Targeting Sequence) autoinibitório for removido da DNMT1. Este domínio, encontrado na região reguladora N-terminal, liga-se ao sítio catalítico e impede a ligação do DNA. A remoção dos primeiros ~600 aminoácidos resulta em uma enzima truncada que é significativamente mais ativa do que a enzima de comprimento total (~640 vezes maior em kcat/Km)40. Esta forma ativada da enzima, referida como DNMT1 sem RFTS (aminoácidos 621-1616), permite a identificação mais fácil de inibidores devido ao seu aumento do poder catalítico. Este artigo apresenta um protocolo para utilizar DNMT1 sem RFTS em ensaios para triagem de potenciais inibidores de moléculas pequenas. Usando o ensaio contínuo acoplado à endonuclease, a velocidade inicial é determinada na presença e ausência de algumas moléculas pequenas. Cada inibidor potencial é examinado em duas concentrações para procurar inibição DNMT1 dependente da concentração. A porcentagem de atividade observada na presença das pequenas moléculas foi calculada em cada caso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Figura 1: Ensaio de metilação do DNA. Um DNA de grampo de cabelo hemimetilado com um fluoróforo na extremidade 5' e um quencher na extremidade 3' é usado como substrato. DNMT1 catalisa a transferência do grupo metilo da S-adenosilmetionina para o sítio CpG não metilado, gerando S-adenosilhomocisteína e DNA totalmente metilado. O produto de DNA contém o local de clivagem para a endonuclease Gla I, que cliva os sítios GCGC totalmente metilados. A clivagem do DNA do produto libera o fluoróforo de 5' do quencher de 3', gerando fluorescência. Abreviaturas: Fl = fluoróforo; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferase 1; SAM = S-adenosilmetionina; HAS = S-adenosilhomocisteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

A metilação do DNA, uma forma de regulação genética epigenética, é importante para a função celular normal. Nas células, as proteínas chamadas DNA metiltransferases (DNMTs) estabelecem e mantêm o padrão de metilação do DNA. Mudanças no padrão normal de metilação do DNA estão ligadas ao desenvolvimento e progressão do câncer, tornando os DNMTs potenciais alvos de medicamentos contra o câncer. Assim, identificar e caracterizar novos inibidores de pequenas moléculas dessas enzimas é de grande importância. Este trabalho apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o rastreamento de inibidores da DNA metiltransferase. O ensaio de cinética acoplada contínua permite que as velocidades iniciais de metilação do DNA sejam determinadas na presença e ausência de potenciais inibidores de moléculas pequenas. O ensaio usa a endonuclease sensível à metila Gla I para acoplar a metilação de um substrato de DNA hemimetilado à geração de fluorescência.
Este ensaio contínuo permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real. A realização do ensaio em pequenos volumes em placas de microtitulação reduz o custo dos reagentes. Usando este ensaio, uma pequena tela de exemplo foi conduzida para inibidores de DNMT1, a isoenzima DNMT mais abundante em humanos. O produto natural de antraquinona altamente substituído, o ácido lacáico A, é um potente inibidor competitivo de DNA da DNMT1. Aqui, examinamos três potenciais inibidores de moléculas pequenas - antraquinonas ou moléculas semelhantes à antraquinona com um a três substituintes - em duas concentrações para descrever o protocolo de ensaio. As velocidades iniciais são usadas para calcular a porcentagem de atividade observada na presença de cada molécula. Um dos três compostos examinados exibe inibição dependente da concentração da atividade DNMT1, indicando que é um inibidor potencial da DNMT1.

DNMT1 ativo é um pré-requisito para esta análise. A DNMT1 sem RFTS foi expressa em E.coli e purificada até a homogeneidade seguindo procedimentos previamente publicados41. Para garantir que a enzima purificada estivesse ativa, um ensaio descontínuo acoplado à endonuclease foi usado para examinar a atividade de metilação do DNA36. Este ensaio utiliza um DNA duplex de 32 pares de bases com um único CpG hemimetilado posicionado em um local de clivagem Sau3A1....

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Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Um ensaio robusto de leitor de placas como o nosso é muito útil para a triagem inicial de potenciais inibidores da metiltransferase. A capacidade de coletar dados em tempo real é uma grande vantagem do ensaio contínuo acoplado à endonuclease. Comece preparando 600 microlitros das condições do ensaio contendo 20 compostos micromolares e 50 micromolares separadamente nos tubos de microcentrífuga no gelo.Para fazer isso, adicione água destilada dupla e tampão de metilação 5X a cada tubo para atingir uma concentração final de tampão de metilação 1X. Em seguida, adicione 3,15 microlitros de 20 miligramas por mililitro de albumina sérica bovina, ou BSA, a cada amostra. Em seguida, adicione dois microlitros de 3,15 substrato micromolar de DNA hairpin e 1,33 microlitros de 4,75 micromolares S-adenosilmetionina, ou SAM, a cada amostra.Adicionar inibidor às amostras adequadas para atingir uma concentração final de 21 micromolares ou 52,5 micromolares e uma quantidade equivalente de sulfóxido de dimetilo, ou DMSO, a uma amostra de controlo antes de misturar as soluções por vórtice a 3 000 rotações por minuto durante três segundos. Em seguida, gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa a 1, 200 vezes G para garantir que a solução seja coletada na parte inferior do tubo. Aliquot 95 microlitros de cada solução de ensaio em seis poços consecutivos em uma placa preta de 96 poços de meia área.Preparar 75 microlitros de solução enzimática Gla I ou DNMT1 mais Gla I nos tubos de microcentrífuga, conforme descrito anteriormente, até uma concentração final de tampão único. Em seguida, adicione 1,2 microlitros de 10 unidades por microlitro Gla I a cada solução para atingir uma concentração final de 0,16 unidades por microlitro. Adicionar 0,6 microlitros de cinco micromolares com DNMT1 sem RFTS à solução DNMT1 mais Gla I para uma concentração final de 40 nanomolares.Após uma mistura suave, gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa a 1.200 G para garantir que a solução seja coletada na parte inferior do tubo. Em seguida, alíquota de 12 microlitros de cada solução enzimática em seis poços em uma placa de 96 poços de fundo cônico. Para o ensaio de metilação da amostra de DNA, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius.Em seguida, insira a placa preta que contém as soluções de ensaio no leitor de placas. Depois de agitar a placa a 425 CPM, meça a fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 528 nanômetros. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos.Remova a placa de ensaio do leitor de placas e adicione cinco microlitros da solução enzimática a cada poço, seguido de misturar a solução por pipetagem para cima e para baixo. Insira a placa no leitor de placas e agite a placa antes de registrar a fluorescência a cada 53 segundos por 30 minutos. Obter a fluorescência média dos ensaios de controle de Gla I triplicado para cada condição e subtrair a média de Gla I contendo bandejas de reação de controle dos traços triplicados obtidos na presença de DNMT1 sem RFTS.Em seguida, determine o erro médio e padrão da média para as replicações corrigidas. Plote o traço médio de reação corrigida e ajuste a porção linear inicial a uma linha para determinar a velocidade inicial. Determine a porcentagem de atividade dividindo a velocidade observada na presença de um composto pela velocidade observada no DMSO contendo reação de controle e multiplicando por 100.Os resultados de um ensaio descontínuo acoplado à endonuclease mostraram que o DNA do produto totalmente metilado é protegido da clivagem, confirmando que o DNMT1 sem RFTS é ativo e capaz de metilar o DNA do substrato hemimetilado. No ensaio baseado em fluorescência, na ausência de Gla I, a adição de DNMT1 ou tampão isoladamente não afetou a fluorescência de fundo. A adição subsequente de Gla I a todos os ensaios resultou na geração de fluorescência apenas em ensaios que continham DNMT1.A adição simultânea de DNMT1 e Gla I sem RFTS a três ensaios resultou em geração de fluorescência robusta. A adição de Gla I sozinha não produziu fluorescência. Para rastrear potenciais inibidores, a atividade de metilação do DNA do DNMT1 sem RFTS foi examinada na presença de DMSO, composto um, composto dois ou composto três em concentrações de 20 e 50 micromolares.Os compostos que reduzem a geração de fluorescência neste ensaio acoplado devem ser validados ainda mais. Garantir que os compostos não estejam inibindo a enzima de acoplamento é um próximo passo importante.

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