Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Авторы благодарят Университет Бакнелла и химический факультет за поддержку этой работы.

1. Подготовьте пробирные решения для экрана
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации субстратов, используемых в этом анализе, могут быть адаптированы. Для RFTS-отсутствующего DNMT1 экспериментальноопределенные значения K m для субстрата ДНК шпильки и SAM составляют 1–2 нМ и 2 мкМ ...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disease-associated+germline+mutations+on+structure+function+relationship+of+DNA+methyltransferases.">Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases.</a> Genes. 10 (5), 369 (2019).</li><li>Foulks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+drug+discovery:+targeting+DNA+methyltransferases.">Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).</li><li>Goll, M. G., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+cytosine+methyltransferases.">Eukaryotic cytosine methyltransferases.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).</li><li>Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+human+DNA+Methyltransferase+(dnmt1)+gene.">Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene.</a> Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).</li><li>Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+3'-untranslated+element+mediates+growth+regulation+of+DNA+methyltransferase+1+and+inhibits+its+transforming+activity.">A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).</li><li>MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+methylation+by+the+Ras+signaling+pathway.">Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).</li><li>Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+is+a+downstream+effector+of+cellular+transformation+triggered+by+simian+virus+40+large+T+antigen.">DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).</li><li>Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genetic+suppression+of+polyp+formation+and+reduction+of+CpG-island+hypermethylation+in+Apc(Min/+)+Dnmt1-hypomorphic+mice.">Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice.</a> Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).</li><li>MacLeod, A. R., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+antisense+to+DNA+methyltransferase+mRNA+induces+DNA+demethylation+and+inhibits+tumorigenesis.">Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).</li><li>Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumorigenesis+by+a+cytosine-DNA,+methyltransferase,+antisense+oligodeoxynucleotide.">Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).</li><li>Ley, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).</li><li>Walter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+DNMT3A+mutations+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).</li><li>Russler-Germain, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R882H+DNMT3A+mutation+associated+with+AML+dominantly+inhibits+wild-type+DNMT3A+by+blocking+its+ability+to+form+active+tetramers.">The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers.</a> Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).</li><li>Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3b+overexpression+contributes+to+a+hypermethylator+phenotype+in+human+breast+cancer+cell+lines.">DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.</a> Molecular Cancer. 7, 15 (2008).</li><li>Nosho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3B+expression+might+contribute+to+CpG+island+methylator+phenotype+in+colorectal+cancer.">DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.</a> Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).</li><li>Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+methylation+with+small+molecules:+what's+next.">Targeting DNA methylation with small molecules: what's next.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).</li><li>Chuang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S110,+a+5-Aza-2'-deoxycytidine-containing+dinucleotide,+is+an+effective+DNA+methylation+inhibitor+in+vivo+and+can+reduce+tumor+growth.">S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).</li><li>Issa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+guadecitabine+(SGI-110)+in+patients+with+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukaemia:+a+multicentre,+randomised,+dose-escalation+phase+1+study.">Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study.</a> Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).</li><li>Datta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+quinoline-based+DNA+hypomethylating+agents+reactivates+tumor+suppressor+genes+by+blocking+DNA+methyltransferase+1+activity+and+inducing+its+degradation.">A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation.</a> Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).</li><li>Zambrano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+hydralazine+to+demethylate+and+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes.">A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes.</a> BMC Cancer. 5, 44 (2005).</li><li>Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procainamide+is+a+specific+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).</li><li>Asgatay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+analogues+of+N-phthaloyl-l-tryptophan+(RG108)+as+inhibitors+of+DNA+methyltransferase+1.">Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C5-DNA+methyltransferase+inhibitors:+from+screening+to+effects+on+zebrafish+embryo+development.">C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development.</a> Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).</li><li>Fagan, R. L., Wu, M., Ch&#233;din, F., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+high+throughput+screen+for+DNA+methyltransferase+1-targeted+molecular+probes.">An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes.</a> PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).</li><li>Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccaic+acid+A+is+a+direct,+DNA-competitive+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).</li><li>Eglen, R. M., Reisine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+compounds+that+modulate+epigenetic+regulation+of+the+transcriptome:+an+overview.">Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).</li><li>Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DNA+methyltransferase+(DNMT3A)+observed+in+acute+myeloid+leukemia+patients+disrupt+processive+methylation.">Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).</li><li>Norvil, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3b+methylates+DNA+by+a+noncooperative+mechanism,+and+its+activity+is+unaffected+by+manipulations+at+the+predicted+dimer+interface.">Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface.</a> Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).</li><li>Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+details+of+the+DNA+recognition+by+the+Dnmt1+DNA+methyltransferase.">Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase.</a> FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain.">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li><li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+(SRA)+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA.">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li><li>Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+threonine+1505+in+the+catalytic+domain+stabilizes+mouse+DNA+methyltransferase+1.">Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Dnmt1+for+methylation+of+hemimethylated+CpG+sites+resides+in+its+catalytic+domain.">Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain.</a> Chemistry &amp; Biology. 19 (5), 572-578 (2012).</li><li>Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+mutations+G589A+and+V590F+relieve+replication+focus+targeting+sequence-mediated+autoinhibition+of+DNA+methyltransferase+1.">Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1.</a> Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).</li><li>Kilgore, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNMT1+selective+antagonists+using+a+novel+scintillation+proximity+assay.">Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+inhibitors+of+DNA+methylation+by+screening+of+a+chemical+library.">Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).</li><li>Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+kinetic+assay+for+protein+and+DNA+methyltransferase+enzymatic+activities.">A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 8, 56 (2015).</li><li>Syeda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replication+focus+targeting+sequence+(RFTS)+domain+is+a+DNA-competitive+inhibitor+of+Dnmt1.">The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).</li><li>Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituted+anthraquinones+represent+a+potential+scaffold+for+DNA+methyltransferase+1-specific+inhibitors.">Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors.</a> PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).</li></ol>

Для выявления и характеристики ингибиторов ДНК-метилтрансфераз необходимо измерить активность фермента. Существует несколько методов изучения активности ДНК-метилтрансферазы. Активность обычно контролируется с помощью радиоактивности; перенос меченой метильной группы SAM может быт...

Метилирование ДНК является важным эпигенетическим маркером, который регулирует экспрессию генов и структуру хроматина. Метилирование происходит преимущественно в cpG динуклеотидах — цитозине, за которым следует гуанозин; метильную группу добавляют к 5-позиции цитозина. Правильные паттерны метилирования ДНК и, следовательно, правильная экспрессия генов необходимы для соответствующего клеточного развития и функционирования. Многие болезненные состояния были связаны с изменениями нормальной картины метилирования 1,2,3. Например, существует связь между инициацией и прогрессированием рака и изменениями в паттерне метилирования ДНК. Как правило, раковые клетки демонстрируют более низкие общие уровни метилцитозина, что способствует нестабильности генома. При этом метилцитозин, присутствующий в геноме, концентрируется в промоторных областях генов-супрессоров опухолей, что приводит к глушению генов этих важных белков. Примечательно, что эпигенетические изменения являются динамичными и обратимыми, в отличие от мутаций ДНК, связанных с опухолевым генезом. Это сделало белки, участвующие в эпигенетической регуляции генов, интересными лекарственными мишенями 2,4.
ДНК-метилтрансферазы (DDNMT) являются белками, ответственными за генерацию и поддержание паттернов метилирования ДНК. Три каталитически активных изофермента, DNMT1, DNMT3a и DNMT3b, существуют у людей. Во время разработки и дифференцировки de novo метилтрансферазы, DNMT3a и DNMT3b, устанавливают паттерны метилирования. Оба фермента могут связывать каталитически неактивный белок DNMT3L с образованием комплексов, которые проявляют повышенную активность 1,5. После деления клеток дочерние клетки содержат гемиметилированную ДНК — ДНК, содержащую метилцитозин только в одной нити дуплекса — потому что вновь синтезированная ДНК лишена меток метилирования. Основная функция DNMT1 заключается в метилировании этой гемиметилированной ДНК, тем самым восстанавливая полную картину метилирования 1,5.
Связи между активностью DNMT и раком хорошо известны. Сверхэкспрессия DNMT1, либо транскрипционными, либо посттрансляционными механизмами, является следствием нескольких общих онкогенных путей 6,7,8,9. Генетические подходы к снижению активности DNMT1 с использованием гипоморфных аллелей приводят к уменьшению образования опухоли у мышей Apc(Min)10. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые нокдают DNMT1, ингибируют неоплазию в клеточной культуре и моделях опухолей мышей 11,12. Таким образом, ингибирование активности DNMT1 кажется многообещающим подходом к терапии рака. Однако роли, которые играют изоферменты DNMT3, не так просты. Мутации DNMT3a обнаруживаются при остром миелоидном лейкозе13 и миелодиспластическом синдроме14. Было показано, что по меньшей мере одна из идентифицированных мутаций снижает активность метилирования ДНК фермента15. Тем не менее, DNMT3b чрезмерно экспрессируется при раке молочной железы16 и колоректальном раке17. Поскольку различные изоферменты DNMT играют различную роль в канцерогенезе, идентификация изофермент-специфических ингибиторов будет иметь решающее значение. Мало того, что эти соединения будут полезны для разработки терапевтических средств, но изофермент-специфические ингибиторы также будут бесценным инструментом для анализа роли каждого изофермента DNMT в этиологии рака.
В литературе сообщалось о нескольких ингибиторах DNMT. Известные ингибиторы DNMT можно разделить на два класса: нуклеозидные и ненуклеозидные. Нуклеозидные ингибиторы обычно являются аналогами цитидина. Эти соединения включены в ДНК и ковалентно улавливают DNMTs. 5-азацитидин и 5-аза-2'-дезоксицитидин были одобрены для лечения миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза 4,18. Высокая токсичность, низкая биодоступность и химическая нестабильность этих соединений представляют проблемы. Текущая работа изучает эффективность следующего поколения нуклеозидных ингибиторов; SGI-110, полученный из 5-аза-2'-дезоксицитидина, является одним из примеров19,20. Нуклеозидные ингибиторы не являются изофермент-специфическими и инактивируют любой встречающийся изофермент DNMT. Таким образом, обработка нуклеозид-деметилирующим агентом приводит к истощению всех изоферментов DNMT 4,18. Ненуклеозидные ингибиторы не нужно включать в ДНК, чтобы оказывать их ингибирующее действие. Вместо этого эти молекулы связываются непосредственно с DDNMT, вводя возможность для изофермент-специфического ингибирования. На сегодняшний день было обнаружено несколько ненуклеозидных ингибиторов, включая SGI-102721, гидралазин22, прокаинамид23, RG108 и производные24, а также натуральные продукты, (-)-эпигаллокатехин 3-галлат (EGCG)25 и лаккаевую кислоту A26,27. Большинство ненуклеозидных ингибиторов, обнаруженных на сегодняшний день, не являются изофермент-селективными или демонстрируют слабые предпочтения для одного изофермента DNMT. Кроме того, необходимо улучшить эффективность этих молекул, особенно в клетках 4,18. Таким образом, существует необходимость в открытии или разработке более мощных, изофермент-селективных ингибиторов DNMT.
Препятствием для открытия новых низкомолекулярных ингибиторов DNMT являются трудоемкие анализы, традиционно используемые для изучения активности DNMT28. Анализы обычно прерывистые с несколькими шагами. Ферментативная активность DNMT по-прежнему регулярно анализируется с использованием радиоактивного S-аденозилметионина (SAM)29,30,31,32,33,34. Также были разработаны нерадиоактивные анализы метилирования ДНК. Например, описаны анализы с использованием метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции и электрофореза для разделения продуктов пищеварения35,36. Эти типы прерывистых, многоступенчатых анализов не поддаются открытию лекарств. С середины 2000-х годов было разработано несколько анализов метилирования ДНК с более высокой пропускной способностью28. Сцинтилляционный бесконтактный анализ использовался для скрининга ингибиторов DNMT137. Другой анализ с использованием метил-чувствительной рестрикционной эндонуклеазы был использован для скрининга ингибиторов DNMT3a25,38. Хотя оба анализа позволили получить более высокую пропускную способность, чем традиционные анализы метилирования ДНК, анализы требуют нескольких этапов и не позволяют наблюдать активность метилирования в режиме реального времени. Совсем недавно был описан непрерывный кинетический анализ, который связывает образование S-аденозилгомоцистеина (SAH), одного из продуктов реакции метилирования, со спектроскопическим изменением при 340 нм, связанным с окислением NADPH39. Этот анализ использует три фермента связи для генерации спектроскопического сигнала.
Мы разработали анализ метилирования ДНК на основе флуоресценции, связанный с эндонуклеазой, который использует один коммерчески доступный фермент связи и может генерировать данные в режиме реального времени (рисунок 1). В качестве субстрата используется олигонуклеотид шпильки, содержащий три метилцитозина. СУБСТРАТНАЯ ДНК содержит флуорофор на 5' конце и гаситель на 3' конце. Метилирование гемиметилированного сайта CpG генерирует участок расщепления для эндонуклеазы Gla I — полностью метилированного GCGC. Расщепление продукта олигонуклеотид gla I высвобождает флуорофор из гасителя и генерирует флуоресценцию в режиме реального времени. Анализ может быть использован для изучения активности любой изоформы DNMT; однако более высокая активность наблюдается при DNMT1, так как этот изофермент преимущественно метилирует гемиметилированную ДНК 1,5. Еще более устойчивая активность наблюдается, если домен автоингибаторной последовательности таргетирования фокусов репликации (RFTS) удаляется из DNMT1. Этот домен, обнаруженный в N-концевой регуляторной области, связывается с каталитическим сайтом и предотвращает связывание ДНК. Удаление первых ~ 600 аминокислот приводит к усеченному ферменту, который значительно более активен, чем фермент полной длины (~ 640-кратное увеличение kcat/Km)40. Эта активированная форма фермента, называемая RFTS-отсутствующим DNMT1 (аминокислоты 621–1616), позволяет легче идентифицировать ингибиторы из-за его повышенной каталитической мощности. В этой статье представлен протокол для использования RFTS-отсутствующего DNMT1 в анализах для скрининга потенциальных ингибиторов малых молекул. С помощью непрерывного анализа, связанного с эндонуклеазой, начальную скорость определяют в присутствии и отсутствии нескольких малых молекул. Каждый потенциальный ингибитор исследуется в двух концентрациях для поиска концентрационно-зависимого ингибирования DNMT1. Процент активности, наблюдаемый в присутствии малых молекул, был рассчитан в каждом случае.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Рисунок 1: Анализ метилирования ДНК. В качестве субстрата используется гемиметилированная шпилька ДНК с флуорофором на 5' конце и гасителем на 3' конце. DNMT1 катализирует перенос метильной группы из S-аденозилметионина в неметилированный сайт CpG, генерируя S-аденозилгомоцистеин и полностью метилированную ДНК. Продукт ДНК содержит участок расщепления эндонуклеазы Gla I, которая расщепляет полностью метилированные участки GCGC. Расщепление ДНК продукта высвобождает 5' флуорофор из 3' гасителя, генерируя флуоресценцию. Сокращения: Fl = флуорофор; Q = quencher; DNMT1 = ДНК-метилтрансфераза 1; SAM = S-аденозилметионин; SAH = S-аденозилгомоцистеин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

Метилирование ДНК, форма эпигенетической регуляции генов, важно для нормальной клеточной функции. В клетках белки, называемые ДНК-метилтрансферазами (DDNMT), устанавливают и поддерживают паттерн метилирования ДНК. Изменения в нормальном паттерне метилирования ДНК связаны с развитием и прогрессированием рака, что делает DDNMT потенциальными мишенями для лекарств от рака. Таким образом, выявление и характеристика новых низкомолекулярных ингибиторов этих ферментов имеет большое значение. В этой статье представлен протокол, который может быть использован для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы. Непрерывный связанный кинетический анализ позволяет определить начальные скорости метилирования ДНК в присутствии и отсутствии потенциальных ингибиторов малых молекул. Анализ использует метил-чувствительную эндонуклеазу Gla I для соединения метилирования гемиметилированного субстрата ДНК с генерацией флуоресценции.
Этот непрерывный анализ позволяет контролировать активность ферментов в режиме реального времени. Проведение анализа в небольших объемах в микротитрных пластинах снижает стоимость реагентов. Используя этот анализ, был проведен небольшой пример скрининга для ингибиторов DNMT1, наиболее распространенного изофермента DNMT у людей. Высокозамещенный натуральный продукт антрахинона, лаккаевая кислота А, является мощным, конкурентоспособным по ДНК ингибитором DNMT1. Здесь мы исследуем три потенциальных ингибитора малых молекул — антрахиноны или антрахиноподобные молекулы с одним-тремя заместителями — в двух концентрациях, чтобы описать протокол анализа. Начальные скорости используются для расчета процентной активности, наблюдаемой в присутствии каждой молекулы. Одно из трех исследованных соединений демонстрирует концентрационно-зависимое ингибирование активности DNMT1, что указывает на то, что оно является потенциальным ингибитором DNMT1.

Активный DNMT1 является обязательным условием для этого анализа. RFTS-отсутствующий DNMT1 экспрессировался в E.coli и очищался до однородности в соответствии с ранее опубликованными процедурами41. Чтобы убедиться, что очищенный фермент был активным, для изучения активности ме?...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

ДНК-метилтрансферазы являются потенциальными мишенями лекарств от рака. Здесь представлен протокол для оценки малых молекул ингибирования ДНК-метилтрансферазы. Этот анализ использует эндонуклеазу для соединения метилирования ДНК с генерацией флуоресценции и позволяет контролировать активность ферментов в режиме реального времени.

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Надежный анализ считывателя пластин, подобный нашему, очень полезен для первоначального скрининга потенциальных ингибиторов метилтрансферазы. Возможность сбора данных в режиме реального времени является большим преимуществом непрерывного эндонуклеазно-связанного анализа. Начните с подготовки 600 микролитров условий анализа, содержащих 20 микромолярных и 50 микромолярных соединений, отдельно в микроцентрифужных трубках на льду.Для этого добавьте двойную дистиллированную воду и 5-кратный буфер метилирования в каждую трубку для достижения конечной концентрации 1X буфера метилирования. Затем добавьте 3,15 микролитра по 20 миллиграммов на миллилитр бычьего сывороточного белка, или BSA, к каждому образцу. Затем добавьте два микролитра 3,15 микромолярного субстрата ДНК шпильки и 1,33 микролитра 4,75 микромолярного S-аденозилметионина, или SAM, к каждому образцу.Добавьте ингибитор к соответствующим образцам для достижения конечной концентрации 21 микромолярного или 52,5 микромолярного и эквивалентного количества диметилсульфоксида или ДМСО в контрольный образец перед смешиванием растворов путем вихря со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение трех секунд. Затем вращайте образцы в течение нескольких секунд в столовой мини-центрифуге в 1, 200 раз G, чтобы убедиться, что раствор собран в нижней части трубки. Aliquot 95 микролитров каждого пробирного раствора в шесть последовательных скважин в черной половине площади 96 луночной пластины.Приготовьте 75 микролитров раствора фермента Gla I или DNMT1 плюс Gla I в микроцентрифужных трубках, как описано ранее, до конечной концентрации одноразового буфера. Затем добавьте 1,2 микролитра по 10 единиц на микролитр Gla I к каждому раствору для достижения конечной концентрации 0,16 единицы на микролитр. Добавьте 0,6 микролитра пяти микромоляров DNMT1 без RFTS в раствор DNMT1 плюс Gla I для окончательной концентрации 40 наномоляров.После тщательного перемешивания вращайте образцы в течение нескольких секунд в настольной мини-центрифуге при 1 200 г, чтобы убедиться, что раствор собран в нижней части трубки. Затем аликвотирование 12 микролитров каждого раствора фермента в шесть лунок в коническом дне 96 лунок. Для анализа метилирования образца ДНК предварительно разогрейте считыватель пластин до 37 градусов по Цельсию.Затем вставьте черную пластину, содержащую растворы для анализа, в считыватель пластин. После встряхивания пластины при 425 CPM измерьте флуоресценцию с длиной волны возбуждения 485 нанометров и длиной волны излучения 528 нанометров. Затем высиживают пластину при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.Снимите пробирную пластину со считывателя пластин и добавьте пять микролитров раствора фермента в каждую лунку, после чего перемешайте раствор путем пипетки вверх и вниз. Вставьте пластину в считыватель пластин и встряхните пластину перед записью флуоресценции каждые 53 секунды в течение 30 минут. Получите среднюю флуоресценцию тройных контрольных анализов Gla I для каждого состояния и вычтите средний Gla I, содержащий контрольные реакционные лотки, из тройных следов, полученных в присутствии RFTS-отсутствующего DNMT1.Затем определите среднюю и стандартную погрешность среднего значения для исправленных реплик. Постройте среднюю скорректированную след реакции и поднесите начальную линейную часть к линии, чтобы определить начальную скорость. Определить процент активности, разделив скорость, наблюдаемую в присутствии соединения, на скорость, наблюдаемую в ДМСО, содержащем управляющую реакцию, и умножив на 100.Результаты прерывистого эндонуклеазно-связанного анализа показали, что ДНК полностью метилированного продукта защищена от расщепления, подтверждая, что RFTS-отсутствующий DNMT1 активен и способен метилировать ДНК гемиметилированного субстрата. В флуоресцентном анализе, в отсутствие Gla I, добавление DNMT1 или буфера само по себе не влияло на фоновую флуоресценцию. Последующее добавление Gla I ко всем анализам привело к генерации флуоресценции только в анализах, которые содержали DNMT1.Одновременное добавление RFTS-отсутствующих DNMT1 и Gla I к трем анализам привело к надежной генерации флуоресценции. Добавление Gla I само по себе не произвело флуоресценции. Для скрининга потенциальных ингибиторов активность метилирования ДНК RFTS-отсутствующего DNMT1 исследовали в присутствии DMSO, соединения один, соединения два или соединения три при 20 и 50 микромолярных концентрациях.Соединения, которые уменьшают генерацию флуоресценции в этом связанном анализе, должны быть дополнительно проверены. Обеспечение того, чтобы соединения не ингибировали фермент связи, является важным следующим шагом.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Простая, прочная и высокая пропускная способность одной молекулы потока растяжения Assay осуществления для изучения транспорт молекул вдоль ДНК

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Fluorogenic пептид расщепления Assay экран для протеолитической активности: приложения для коронавирус Спайк активации белка

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Одномолекулярная визуализация конденсатов EWS-FLI1, собранных на ДНК

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Анализ урацил-ДНК-гликозилазы с помощью матрицы лазерной десорбции/ионизации Масс-спектрометрии времени пролета

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-спектроскопия для изучения взаимодействий ДНК и белка

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...