Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Los autores agradecen a la Universidad de Bucknell y al Departamento de Química por su apoyo a este trabajo.

1. Prepare soluciones de ensayo para la pantalla
NOTA: Las concentraciones de sustratos utilizados en este ensayo pueden ser adaptadas. Para DNMT1 que carece de RFTS, los valores de Km determinados experimentalmente para el sustrato de ADN de horquilla y SAM son 1–2 nM y 2 μM, respectivamente26,40.
<ol><li>Preparar 600 μL de cada condición de ensayo que se esté probando en tubos de microcentrífuga s...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. 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Para identificar y caracterizar los inhibidores de las metiltransferasas del ADN, se debe medir la actividad de la enzima. Existen varios métodos para examinar la actividad de la metiltransferasa del ADN. La actividad se controla comúnmente mediante radiactividad; La transferencia del grupo metilo marcado de SAM se puede cuantificar 29,30,31,32,33,34</s...

La metilación del ADN es una marca epigenética importante que regula la expresión génica y la estructura de la cromatina. La metilación ocurre predominantemente en los dinucleótidos CpG: citosina seguida de guanosina; El grupo metilo se añade a la posición 5 de la citosina. Los patrones correctos de metilación del ADN y, por lo tanto, la expresión génica adecuada, son necesarios para el desarrollo y la función celular apropiados. Muchos estados de enfermedad se han asociado con cambios en el patrón normal de metilación 1,2,3. Por ejemplo, existe un vínculo entre el inicio y la progresión del cáncer y las alteraciones en el patrón de metilación del ADN. Por lo general, las células cancerosas exhiben niveles generales más bajos de metilcitosina, lo que contribuye a la inestabilidad del genoma. Al mismo tiempo, la metilcitosina que está presente en el genoma se concentra en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores, lo que conduce al silenciamiento génico de estas proteínas importantes. En particular, los cambios epigenéticos son dinámicos y reversibles, a diferencia de las mutaciones del ADN asociadas con la tumorigénesis. Esto ha hecho que las proteínas implicadas en la regulación génica epigenética sean interesantes dianas farmacológicas 2,4.
Las metiltransferasas de ADN (DNMT) son las proteínas responsables de generar y mantener los patrones de metilación del ADN. Tres isoenzimas catalíticamente activas, DNMT1, DNMT3a y DNMT3b, existen en humanos. Durante el desarrollo y la diferenciación, las metiltransferasas de novo, DNMT3a y DNMT3b, establecen patrones de metilación. Ambas enzimas pueden unirse a la proteína DNMT3L catalíticamente inactiva para formar complejos que exhiben una mayor actividad 1,5. Después de la división celular, las células hijas contienen ADN hemimetilado (ADN que contiene metilcitosina en una sola hebra del dúplex) porque el ADN recién sintetizado carece de marcas de metilación. La función principal de DNMT1 es metilar este ADN hemimetilado, restableciendo así el patrón de metilación completo 1,5.
Los vínculos entre la actividad de DNMT y el cáncer están bien establecidos. La sobreexpresión de DNMT1, ya sea por mecanismos transcripcionales o postraduccionales, es una consecuencia de varias vías oncogénicas comunes 6,7,8,9. Los enfoques genéticos para disminuir la actividad de DNMT1 utilizando alelos hipomórficos dan como resultado una disminución de la formación de tumores en ratones Apc(Min)10. Los oligonucleótidos antisentido que derriban DNMT1 inhiben la neoplasia en cultivos celulares y modelos tumorales de ratón11,12. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de DNMT1 parece un enfoque prometedor de la terapia contra el cáncer. Sin embargo, los roles que desempeñan las isoenzimas DNMT3 no son tan sencillos. Las mutaciones DNMT3a se encuentran en la leucemia mieloide aguda13 y en el síndrome mielodisplásico14. Se ha demostrado que al menos una de las mutaciones identificadas disminuye la actividad de metilación del ADN de la enzima15. Sin embargo, DNMT3b se sobreexpresa en el cáncer de mama16 y el cáncer colorrectal17. Dado que las diversas isoenzimas DNMT desempeñan diferentes funciones en la carcinogénesis, la identificación de inhibidores específicos de isoenzimas será fundamental. Estos compuestos no solo serán útiles para el desarrollo de terapias, sino que los inhibidores específicos de isoenzimas también serían una herramienta invaluable para diseccionar el papel de cada isoenzima DNMT en la etiología del cáncer.
Varios inhibidores de DNMT han sido reportados en la literatura. Los inhibidores conocidos de DNMT se pueden dividir en dos clases: nucleósidos y no nucleósidos. Los inhibidores de nucleósidos son típicamente análogos de la citidina. Estos compuestos se incorporan al ADN y atrapan covalentemente las DNMT. La 5-azacitidina y la 5-aza-2'-desoxicitidina han sido aprobadas para el tratamiento del síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda 4,18. La alta toxicidad, la baja biodisponibilidad y la inestabilidad química de estos compuestos presentan problemas. El trabajo en curso está examinando la eficacia de la próxima generación de inhibidores de nucleósidos; SGI-110, derivado de 5-aza-2'-desoxicitidina, es un ejemplo 19,20. Los inhibidores de nucleósidos no son isozimas específicos e inactivarán cualquier isoenzima DNMT encontrada. Por lo tanto, el tratamiento con un agente desmetilante de nucleósidos resulta en el agotamiento de todas las isoenzimas DNMT 4,18. Los inhibidores no nucleósidos no necesitan ser incorporados al ADN para ejercer sus efectos inhibitorios. En cambio, estas moléculas se unen directamente a los DNMT, introduciendo la posibilidad de inhibición específica de isoenzimas. Hasta la fecha se han descubierto varios inhibidores no nucleósidos, incluyendo SGI-102721, hidralazina 22, procainamida 23, RG108 y derivados 24, y productos naturales, (-)-epigalocatequina 3-galato (EGCG)25 y ácido laccaico A 26,27. La mayoría de los inhibidores no nucleósidos descubiertos hasta la fecha no son isozimo-selectivos o muestran preferencias débiles por una isoenzima DNMT. Además, la potencia de estas moléculas necesita ser mejorada, especialmente en las células 4,18. Por lo tanto, existe la necesidad de descubrir o desarrollar inhibidores de DNMT más potentes y selectivos de isoenzimas.
Un obstáculo para descubrir nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de DNMTs son los laboriosos ensayos tradicionalmente utilizados para examinar la actividad de DNMT28. Los ensayos suelen ser discontinuos con múltiples pasos. La actividad enzimática de las DNMT todavía se ensaya rutinariamente utilizando S-adenosil metionina radiactiva (SAM)29,30,31,32,33,34. También se han desarrollado ensayos no radiactivos para la metilación del ADN. Por ejemplo, se han descrito ensayos que utilizan endonucleasas de restricción sensibles al metilo y electroforesis para separar los productos de digestión35,36. Estos tipos de ensayos discontinuos de varios pasos no son fácilmente susceptibles de descubrimiento de fármacos. Desde mediados de la década de 2000, se han desarrollado varios ensayos de metilación del ADN con un mayor rendimiento28. Se utilizó un ensayo de proximidad de centelleo para detectar inhibidores de DNMT137. Otro ensayo que utilizó una endonucleasa de restricción sensible al metilo se utilizó para detectar inhibidores de DNMT3a25,38. Si bien ambos ensayos permitieron un mayor rendimiento que los ensayos tradicionales de metilación del ADN, los ensayos requieren múltiples pasos y no permiten la observación de la actividad de metilación en tiempo real. Más recientemente, se ha descrito un ensayo cinético continuo que acopla la formación de S-adenosilhomocisteína (SAH), un producto de la reacción de metilación, al cambio espectroscópico a 340 nm asociado con la oxidación de NADPH39. Este ensayo utiliza tres enzimas de acoplamiento para generar una señal espectroscópica.
Desarrollamos un ensayo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia que utiliza una sola enzima de acoplamiento disponible comercialmente y puede generar datos en tiempo real (Figura 1). Un oligonucleótido de horquilla que contiene tres metilcitosinas se utiliza como sustrato. El ADN del sustrato contiene un fluoróforo en el extremo 5' y un quencher en el extremo 3'. La metilación del sitio CpG hemimetilado genera el sitio de escisión para la endonucleasa Gla I - GCGC completamente metilado. La escisión Gla I del oligonucleótido producto libera el fluoróforo del exprimidor y genera fluorescencia en tiempo real. El ensayo se puede utilizar para examinar la actividad de cualquier isoforma de DNMT; sin embargo, se observa una mayor actividad con DNMT1 ya que esta isoenzima metila preferentemente el ADN hemimetilado 1,5. Se observa una actividad aún más robusta si el dominio autoinhibitorio Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) se elimina de DNMT1. Este dominio, que se encuentra en la región reguladora N-terminal, se une al sitio catalítico y evita la unión del ADN. La eliminación de los primeros ~600 aminoácidos da como resultado una enzima truncada que es significativamente más activa que la enzima de longitud completa (aumento de ~640 veces en kcat / Km)40. Esta forma activada de la enzima, conocida como DNMT1 que carece de RFTS (aminoácidos 621-1616), permite la identificación más fácil de los inhibidores debido a su mayor poder catalítico. Este documento presenta un protocolo para utilizar DNMT1 que carece de RFTS en ensayos para detectar posibles inhibidores de moléculas pequeñas. Usando el ensayo continuo acoplado a endonucleasa, la velocidad inicial se determina en presencia y ausencia de unas pocas moléculas pequeñas. Cada inhibidor potencial se examina en dos concentraciones para buscar la inhibición de DNMT1 dependiente de la concentración. El porcentaje de actividad observado en presencia de las moléculas pequeñas se calculó en cada caso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Figura 1: Ensayo de metilación del ADN. Se utiliza como sustrato un ADN de horquilla hemimetilada con un fluoróforo en el extremo 5' y un quencher en el extremo 3'. DNMT1 cataliza la transferencia del grupo metilo de S-adenosilmetionina al sitio CpG no metilado, generando S-adenosilhomocisteína y ADN completamente metilado. El producto de ADN contiene el sitio de escisión de la endonucleasa Gla I, que escinde los sitios GCGC completamente metilados. La escisión del ADN del producto libera el fluoróforo 5' del enfriador 3', generando fluorescencia. Abreviaturas: Fl = fluoróforo; Q = enfriador; DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; SAM = S-adenosilmetionina; HSA = S-adenosilhomocisteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

La metilación del ADN, una forma de regulación genética epigenética, es importante para la función celular normal. En las células, las proteínas llamadas metiltransferasas de ADN (DNMT) establecen y mantienen el patrón de metilación del ADN. Los cambios en el patrón normal de metilación del ADN están relacionados con el desarrollo y la progresión del cáncer, lo que hace que los DNMT sean posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Por lo tanto, la identificación y caracterización de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de estas enzimas es de gran importancia. Este documento presenta un protocolo que se puede utilizar para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN. El ensayo cinético de acoplamiento continuo permite determinar las velocidades iniciales de metilación del ADN en presencia y ausencia de posibles inhibidores de moléculas pequeñas. El ensayo utiliza la endonucleasa sensible al metilo Gla I para acoplar la metilación de un sustrato de ADN hemimetilado a la generación de fluorescencia.
Este ensayo continuo permite monitorizar la actividad enzimática en tiempo real. La realización del ensayo en pequeños volúmenes en placas de microtitulación reduce el costo de los reactivos. Usando este ensayo, se realizó una pequeña pantalla de ejemplo para inhibidores de DNMT1, la isoenzima DNMT más abundante en humanos. El producto natural de antraquinona altamente sustituido, ácido laccaico A, es un potente inhibidor competitivo del ADN de DNMT1. Aquí, examinamos tres posibles inhibidores de moléculas pequeñas: antraquinonas o moléculas similares a la antraquinona con uno a tres sustituyentes, en dos concentraciones para describir el protocolo de ensayo. Las velocidades iniciales se utilizan para calcular el porcentaje de actividad observado en presencia de cada molécula. Uno de los tres compuestos examinados exhibe inhibición dependiente de la concentración de la actividad de DNMT1, lo que indica que es un inhibidor potencial de DNMT1.

DNMT1 activo es un requisito previo para este análisis. La DNMT1 que carece de RFTS se expresó en E. coli y se purificó a homogeneidad siguiendo procedimientos previamente publicados41. Para asegurar que la enzima purificada estaba activa, se utilizó un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasa para examinar la actividad de metilación del ADN36. Este ensayo utiliza un ADN dúplex de 32 pares de bases con una sola CpG hemimetilada posicionada en un sitio de es...

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Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Un ensayo robusto de lector de placas como el nuestro es muy útil para la detección inicial de posibles inhibidores de la metiltransferasa. La capacidad de recopilar datos en tiempo real es una gran ventaja del ensayo continuo acoplado a endonucleasas. Comience preparando 600 microlitros de las condiciones de ensayo que contienen 20 compuestos micromolares y 50 micromolares por separado en los tubos de microcentrífuga sobre hielo.Para hacerlo, agregue agua destilada doble y tampón de metilación 5X a cada tubo para lograr una concentración final de tampón de metilación 1X. A continuación, agregue 3.15 microlitros de 20 miligramos por mililitro de albúmina de suero bovino, o BSA, a cada muestra. Luego, agregue dos microlitros de sustrato de ADN de horquilla micromolar de 3.15 y 1.33 microlitros de S-adenosilmetionina micromolar de 4.75 micromolares, o SAM, a cada muestra.Agregue un inhibidor a las muestras apropiadas para lograr una concentración final de 21 micromolares o 52.5 micromolares y una cantidad equivalente de dimetilsulfóxido, o DMSO, a una muestra de control antes de mezclar las soluciones mediante vórtice a 3, 000 rotaciones por minuto durante tres segundos. Luego, gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa a 1, 200 veces G para asegurarse de que la solución se recolecte en el fondo del tubo. Alícuota 95 microlitros de cada solución de ensayo en seis pocillos consecutivos en una placa negra de 96 pocillos.Prepare 75 microlitros de solución enzimática Gla I o DNMT1 más Gla I en los tubos de microcentrífuga como se describió anteriormente a una concentración final de tampón de una sola vez. A continuación, agregue 1.2 microlitros de 10 unidades por microlitro Gla I a cada solución para lograr una concentración final de 0.16 unidades por microlitro. Agregue 0,6 microlitros de cinco micromolares que carecen de DNMT1 a la solución DNMT1 más Gla I para una concentración final de 40 nanomolares.Después de una mezcla suave, gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa a 1, 200 G para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo. Luego, alícuota 12 microlitros de cada solución enzimática en seis pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo cónico. Para el ensayo de metilación de la muestra de ADN, precaliente el lector de placas a 37 grados centígrados.A continuación, inserte la placa negra que contiene las soluciones de ensayo en el lector de placas. Después de agitar la placa a 425 CPM, mida la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 528 nanómetros. Luego, incubar el plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos.Retire la placa de ensayo del lector de placas y agregue cinco microlitros de la solución enzimática a cada pocillo, seguido de mezclar la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Inserte la placa en el lector de placas y agite la placa antes de registrar la fluorescencia cada 53 segundos durante 30 minutos. Obtenga la fluorescencia promedio de los ensayos de control de Gla I triplicados para cada condición y reste las bandejas de reacción de control promedio que contienen Gla I de las trazas triplicadas obtenidas en presencia de DNMT1 que carece de RFTS.Luego, determine el error promedio y estándar de la media para las réplicas corregidas. Trazar la traza de reacción corregida promedio y ajustar la porción lineal inicial a una línea para determinar la velocidad inicial. Determine el porcentaje de actividad dividiendo la velocidad observada en presencia de un compuesto por la velocidad observada en el DMSO que contiene la reacción de control y multiplicando por 100.Los resultados de un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasas mostraron que el ADN del producto completamente metilado está protegido de la escisión, lo que confirma que DNMT1 que carece de RFTS es activo y capaz de metilar el ADN del sustrato hemimetilado. En el ensayo basado en fluorescencia, en ausencia de Gla I, la adición de DNMT1 o tampón solo no afectó la fluorescencia de fondo. La adición posterior de Gla I a todos los ensayos dio como resultado la generación de fluorescencia solo en ensayos que contenían DNMT1.La adición simultánea de DNMT1 y Gla I que carecen de RFTS a tres ensayos dio como resultado una generación de fluorescencia robusta. La adición de Gla I sola no produjo fluorescencia. Para detectar posibles inhibidores, se examinó la actividad de metilación del ADN de DNMT1 que carece de RFTS en presencia de DMSO, compuesto uno, compuesto dos o compuesto tres a concentraciones micromolares de 20 y 50.Los compuestos que reducen la generación de fluorescencia en este ensayo acoplado deben validarse aún más. Asegurarse de que los compuestos no inhiben la enzima de acoplamiento es un siguiente paso importante.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Investigación

Bioquímica

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Un ensayo de escote de péptido fluorógenos para detectar actividad proteolítica: aplicaciones para coronavirus punto de activación de la proteína

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