Name: continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Yazarlar, bu çalışmaya verdikleri destek için Bucknell Üniversitesi ve Kimya Bölümü'ne teşekkür eder.

1. Ekran için tahlil çözümleri hazırlayın
NOT: Bu tahlilde kullanılan substratların konsantrasyonları uyarlanabilir. RFTS'siz DNMT1 için, saç tokası DNA substratı ve SAM için deneysel olarak belirlenen Km değerleri sırasıyla 1-2 nM ve 2 μM, 26,40'tır.
<ol><li>Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde test edilen her tahlil koşulunun 600 μL'sini hazırlayın. NOT: Gerekli tahlil ç...

<ol>
	<li>Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+mammalian+DNA+methyltransferases.">Structure and function of mammalian DNA methyltransferases.</a> Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).</li><li>Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+of+DNA+methylation+machinery+in+human+diseases.">Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases.</a> Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).</li><li>Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disease-associated+germline+mutations+on+structure+function+relationship+of+DNA+methyltransferases.">Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases.</a> Genes. 10 (5), 369 (2019).</li><li>Foulks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+drug+discovery:+targeting+DNA+methyltransferases.">Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).</li><li>Goll, M. G., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+cytosine+methyltransferases.">Eukaryotic cytosine methyltransferases.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).</li><li>Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+human+DNA+Methyltransferase+(dnmt1)+gene.">Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene.</a> Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).</li><li>Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+3'-untranslated+element+mediates+growth+regulation+of+DNA+methyltransferase+1+and+inhibits+its+transforming+activity.">A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).</li><li>MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+methylation+by+the+Ras+signaling+pathway.">Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).</li><li>Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+is+a+downstream+effector+of+cellular+transformation+triggered+by+simian+virus+40+large+T+antigen.">DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).</li><li>Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genetic+suppression+of+polyp+formation+and+reduction+of+CpG-island+hypermethylation+in+Apc(Min/+)+Dnmt1-hypomorphic+mice.">Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice.</a> Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).</li><li>MacLeod, A. R., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+antisense+to+DNA+methyltransferase+mRNA+induces+DNA+demethylation+and+inhibits+tumorigenesis.">Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).</li><li>Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumorigenesis+by+a+cytosine-DNA,+methyltransferase,+antisense+oligodeoxynucleotide.">Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).</li><li>Ley, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3A+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).</li><li>Walter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+DNMT3A+mutations+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).</li><li>Russler-Germain, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R882H+DNMT3A+mutation+associated+with+AML+dominantly+inhibits+wild-type+DNMT3A+by+blocking+its+ability+to+form+active+tetramers.">The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers.</a> Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).</li><li>Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3b+overexpression+contributes+to+a+hypermethylator+phenotype+in+human+breast+cancer+cell+lines.">DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.</a> Molecular Cancer. 7, 15 (2008).</li><li>Nosho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT3B+expression+might+contribute+to+CpG+island+methylator+phenotype+in+colorectal+cancer.">DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.</a> Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).</li><li>Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+methylation+with+small+molecules:+what's+next.">Targeting DNA methylation with small molecules: what's next.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).</li><li>Chuang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S110,+a+5-Aza-2'-deoxycytidine-containing+dinucleotide,+is+an+effective+DNA+methylation+inhibitor+in+vivo+and+can+reduce+tumor+growth.">S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).</li><li>Issa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+guadecitabine+(SGI-110)+in+patients+with+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukaemia:+a+multicentre,+randomised,+dose-escalation+phase+1+study.">Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study.</a> Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).</li><li>Datta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+quinoline-based+DNA+hypomethylating+agents+reactivates+tumor+suppressor+genes+by+blocking+DNA+methyltransferase+1+activity+and+inducing+its+degradation.">A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation.</a> Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).</li><li>Zambrano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+hydralazine+to+demethylate+and+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes.">A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes.</a> BMC Cancer. 5, 44 (2005).</li><li>Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procainamide+is+a+specific+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).</li><li>Asgatay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+analogues+of+N-phthaloyl-l-tryptophan+(RG108)+as+inhibitors+of+DNA+methyltransferase+1.">Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C5-DNA+methyltransferase+inhibitors:+from+screening+to+effects+on+zebrafish+embryo+development.">C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development.</a> Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).</li><li>Fagan, R. L., Wu, M., Ch&#233;din, F., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+high+throughput+screen+for+DNA+methyltransferase+1-targeted+molecular+probes.">An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes.</a> PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).</li><li>Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccaic+acid+A+is+a+direct,+DNA-competitive+inhibitor+of+DNA+methyltransferase+1.">Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).</li><li>Eglen, R. M., Reisine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+compounds+that+modulate+epigenetic+regulation+of+the+transcriptome:+an+overview.">Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).</li><li>Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DNA+methyltransferase+(DNMT3A)+observed+in+acute+myeloid+leukemia+patients+disrupt+processive+methylation.">Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).</li><li>Norvil, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3b+methylates+DNA+by+a+noncooperative+mechanism,+and+its+activity+is+unaffected+by+manipulations+at+the+predicted+dimer+interface.">Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface.</a> Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).</li><li>Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+details+of+the+DNA+recognition+by+the+Dnmt1+DNA+methyltransferase.">Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase.</a> FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain.">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li><li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+(SRA)+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA.">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li><li>Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+threonine+1505+in+the+catalytic+domain+stabilizes+mouse+DNA+methyltransferase+1.">Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1.</a> Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).</li><li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Dnmt1+for+methylation+of+hemimethylated+CpG+sites+resides+in+its+catalytic+domain.">Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain.</a> Chemistry &amp; Biology. 19 (5), 572-578 (2012).</li><li>Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+mutations+G589A+and+V590F+relieve+replication+focus+targeting+sequence-mediated+autoinhibition+of+DNA+methyltransferase+1.">Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1.</a> Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).</li><li>Kilgore, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNMT1+selective+antagonists+using+a+novel+scintillation+proximity+assay.">Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).</li><li>Ceccaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+inhibitors+of+DNA+methylation+by+screening+of+a+chemical+library.">Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).</li><li>Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+kinetic+assay+for+protein+and+DNA+methyltransferase+enzymatic+activities.">A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 8, 56 (2015).</li><li>Syeda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replication+focus+targeting+sequence+(RFTS)+domain+is+a+DNA-competitive+inhibitor+of+Dnmt1.">The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).</li><li>Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituted+anthraquinones+represent+a+potential+scaffold+for+DNA+methyltransferase+1-specific+inhibitors.">Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors.</a> PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).</li></ol>

DNA metiltransferazların inhibitörlerini tanımlamak ve karakterize etmek için, enzimin aktivitesi ölçülmelidir. DNA metiltransferaz aktivitesini incelemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Aktivite genellikle radyoaktivite kullanılarak izlenir; SAM'ın etiketli metil grubunun transferi 29,30,31,32,33,34 olarak ölçülebilir.<sup class="...

DNA metilasyonu, gen ekspresyonunu ve kromatin yapısını düzenleyen önemli bir epigenetik işarettir. Metilasyon ağırlıklı olarak CpG dinükleotidlerinde meydana gelir - sitozin ve ardından guanosin; metil grubu, sitozinin 5 pozisyonuna eklenir. Uygun hücresel gelişim ve fonksiyon için doğru DNA metilasyon paternleri ve dolayısıyla uygun gen ekspresyonu gereklidir. Birçok hastalık durumu, normal metilasyon paterni 1,2,3'teki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Örneğin, kanser başlangıcı ile ilerlemesi ve DNA metilasyon paternindeki değişiklikler arasında bir bağlantı vardır. Tipik olarak, kanser hücreleri, genom instabilitesine katkıda bulunan daha düşük genel metilsitozin seviyeleri sergiler. Aynı zamanda, genomda bulunan metilsitozin, tümör baskılayıcı genlerin promotör bölgelerinde yoğunlaşır ve bu da bu önemli proteinlerin gen susturulmasına yol açar. Özellikle, epigenetik değişiklikler, tümörigenez ile ilişkili DNA mutasyonlarının aksine, dinamik ve geri dönüşümlüdür. Bu, epigenetik gen regülasyonunda yer alan proteinleri ilginç ilaç hedefleri 2,4 haline getirmiştir.
DNA metiltransferazlar (DNMT'ler), DNA metilasyon paternlerinin üretilmesinden ve korunmasından sorumlu proteinlerdir. Katalitik olarak aktif üç izozim, DNMT1, DNMT3a ve DNMT3b, insanlarda bulunur. Gelişim ve farklılaşma sırasında, de novo metiltransferazlar, DNMT3a ve DNMT3b, metilasyon paternleri oluşturur. Her iki enzim de katalitik olarak inaktif DNMT3L proteinini, artan aktivite 1,5 sergileyen kompleksler oluşturmak için bağlayabilir. Hücre bölünmesini takiben, yavru hücreler hemimetillenmiş DNA içerir - dubleksin sadece bir ipliğinde metilsitozin içeren DNA - çünkü yeni sentezlenen DNA metilasyon izlerinden yoksundur. DNMT1'in ana işlevi, bu hemimetillenmiş DNA'yı metillemek ve böylece tam metilasyon paterni 1,5'i yeniden oluşturmaktır.
DNMT aktivitesi ve kanser arasındaki bağlantılar iyi kurulmuştur. DNMT1'in transkripsiyonel veya post-translasyonel mekanizmalarla aşırı ekspresyonu, birkaç yaygın onkojenik yolunbir sonucudur 6,7,8,9. Hipomorfik aleller kullanarak DNMT1 aktivitesini düşürmeye yönelik genetik yaklaşımlar, Apc (Min) farelerde tümör oluşumunun azalmasına neden olur10. DNMT1'i deviren antisens oligonükleotidler hücre kültüründe neoplaziyi inhibe eder ve fare tümörü modelleri11,12. Bu nedenle, DNMT1 aktivitesini inhibe etmek umut verici bir kanser tedavisi yaklaşımı gibi görünmektedir. Bununla birlikte, DNMT3 izozimlerinin oynadığı roller o kadar basit değildir. DNMT3a mutasyonları akut miyeloid lösemi13 ve miyelodisplastik sendrom14'te bulunur. Tanımlanan mutasyonlardan en az birinin,enzim 15'in DNA metilasyon aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, DNMT3b meme kanseri16 ve kolorektal kanser17'de aşırı eksprese edilir. Çeşitli DNMT izozimleri karsinogenezde farklı roller oynarken, izozime özgü inhibitörlerin tanımlanması kritik öneme sahip olacaktır. Bu bileşikler sadece terapötiklerin gelişimi için yararlı olmakla kalmayacak, aynı zamanda izozime özgü inhibitörler de her DNMT izoziminin kanser etiyolojisindeki rolünü incelemek için paha biçilmez bir araç olacaktır.
Literatürde çeşitli DNMT inhibitörleri bildirilmiştir. Bilinen DNMT inhibitörleri iki sınıfa ayrılabilir: nükleozid ve nükleozid olmayan. Nükleozid inhibitörleri tipik olarak sitidin analoglarıdır. 5-azasitidin ve 5-aza-2'-deoksisitidin miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid lösemi 4,18'in tedavisi için onaylanmıştır. Bu bileşiklerin yüksek toksisitesi, düşük biyoyararlanımı ve kimyasal instabilitesi sorun yaratmaktadır. Devam eden çalışmalar, yeni nesil nükleozid inhibitörlerinin etkinliğini incelemektedir; 5-aza-2'-deoksisitidinden türetilen SGI-110, bir örnek 19,20'dir. Nükleozid inhibitörleri izozime özgü değildir ve karşılaşılan herhangi bir DNMT izozimini inaktive eder. Bu nedenle, bir nükleozid demetilasyon ajanı ile tedavi, tüm DNMT izozimlerinin 4,18 tükenmesine neden olur. Nükleozid olmayan inhibitörlerin, inhibitör etkilerini göstermek için DNA'ya dahil edilmeleri gerekmez. Bunun yerine, bu moleküller doğrudan DNMT'lere bağlanır ve izozime özgü inhibisyon olasılığını ortaya çıkarır. SGI-1027 21, hidralazin 22, prokainamid23, RG108 ve türevleri 24 ve doğal ürünler, (-)-epigallocatechin 3-gallate (EGCG)25 ve lakkaik asit A26,27 dahil olmak üzere bugüne kadar çeşitli nükleozid olmayan inhibitörler keşfedilmiştir. Bugüne kadar keşfedilen nükleozid olmayan inhibitörlerin çoğu izozim seçici değildir veya bir DNMT izozimi için zayıf tercihler göstermektedir. Ek olarak, bu moleküllerin gücünün, özellikle 4,18 hücrelerinde iyileştirilmesi gerekir. Bu nedenle, daha güçlü, izoenzim seçici DNMT inhibitörlerini keşfetmeye veya geliştirmeye ihtiyaç vardır.
DNMT'lerin yeni küçük molekül inhibitörlerini keşfetmenin önündeki bir engel, DNMT aktivitesini incelemek için geleneksel olarak kullanılan zahmetli tahlillerdir28. Tahliller genellikle birden fazla adımda süreksizdir. DNMT'lerin enzimatik aktivitesi hala radyoaktif S-adenosil metiyonin (SAM) 29,30,31,32,33,34 kullanılarak rutin olarak test edilmektedir. DNA metilasyonu için radyoaktif olmayan testler de geliştirilmiştir. Örneğin, sindirim ürünlerini ayırmak için metile duyarlı kısıtlama endonükleazları ve elektroforez kullanan tahliller35,36 tanımlanmıştır. Bu tür süreksiz, çok adımlı analizler ilaç keşfine kolayca uygun değildir. 2000'li yılların ortalarından bu yana, daha yüksek verime sahip birkaç DNA metilasyon testi geliştirilmiştir28. DNMT1 inhibitörlerini taramak için bir sintilasyon yakınlık testi kullanıldı37. DNMT3a inhibitörleri 25,38'i taramak için metile duyarlı bir kısıtlama endonükleazı kullanan başka bir tahlil kullanıldı. Her iki tahlil de geleneksel DNA metilasyon tahlillerinden daha yüksek verime izin verirken, tahliller birden fazla adım gerektirir ve metilasyon aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin vermez. Daha yakın zamanlarda, metilasyon reaksiyonunun bir ürünü olan S-adenosilhomosistein (SAH) oluşumunu, NADPH oksidasyonu39 ile ilişkili 340 nm'deki spektroskopik değişimle eşleştiren sürekli bir kinetik tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil, spektroskopik bir sinyal üretmek için üç bağlantı enzimi kullanır.
Ticari olarak temin edilebilen tek bir kuplaj enzimi kullanan ve gerçek zamanlı olarak veri üretebilen floresan bazlı endonükleaz kuplajlı DNA metilasyon testi geliştirdik (Şekil 1). Substrat olarak üç metilsitozin içeren bir saç tokası oligonükleotid kullanılır. Substrat DNA'sı 5' ucunda bir florofor ve 3' ucunda bir söndürücü içerir. Hemimetile CpG bölgesinin metilasyonu, endonükleaz Gla I - tamamen metillenmiş GCGC için bölünme bölgesini oluşturur. Gla I ürün oligonükleotidinin bölünmesi, floroforu söndürücüden serbest bırakır ve gerçek zamanlı olarak floresan üretir. Tahlil, DNMT'nin herhangi bir izoformunun aktivitesini incelemek için kullanılabilir; Bununla birlikte, DNMT1 ile daha yüksek aktivite gözlenir, çünkü bu izoenzim tercihen hemimetillenmiş DNA 1,5'i metilleştirir. Otoinhibitör Replikasyon Odakları Hedefleme Dizisi (RFTS) etki alanı DNMT1'den kaldırılırsa daha da sağlam etkinlik gözlenir. N-terminal düzenleyici bölgede bulunan bu alan, katalitik bölgeye bağlanır ve DNA bağlanmasını önler. İlk ~ 600 amino asidin uzaklaştırılması, tam uzunluktaki enzimden önemli ölçüde daha aktif olan kesilmiş bir enzimle sonuçlanır (kcat / Km'de ~ 640 kat artış)40. RFTS'den yoksun DNMT1 (amino asitler 621-1616) olarak adlandırılan enzimin bu aktif formu, artan katalitik gücü nedeniyle inhibitörlerin daha kolay tanımlanmasını sağlar. Bu makale, potansiyel küçük molekül inhibitörlerini taramak için RFTS'den yoksun DNMT1'i testlerde kullanmak için bir protokol sunmaktadır. Endonükleaz ile eşleşmiş sürekli tahlil kullanılarak, başlangıç hızı birkaç küçük molekülün varlığında ve yokluğunda belirlenir. Her potansiyel inhibitör, konsantrasyona bağımlı DNMT1 inhibisyonunu aramak için iki konsantrasyonda incelenir. Küçük moleküllerin varlığında gözlenen yüzde aktivitesi her durumda hesaplandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg"> Şekil 1: DNA metilasyon testi. Substrat olarak 5' ucunda bir florofor ve 3' ucunda bir söndürücü bulunan hemimetillenmiş bir saç tokası DNA'sı kullanılır. DNMT1, metil grubunun S-adenosilmetioninden metillenmemiş CpG bölgesine transferini katalize ederek S-adenosilhomosistein ve tamamen metillenmiş DNA üretir. DNA ürünü, tamamen metillenmiş GCGC bölgelerini parçalayan endonükleaz Gla I için bölünme bölgesini içerir. Ürün DNA'sının bölünmesi, 3' söndürücüden 5' floroforu serbest bırakarak floresan üretir. Kısaltmalar: Fl = florofor; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; SAM = S-adenosilmetiyonin; SAH = S-adenosilhomosistein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3694</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates</td>
			<td style="width:100px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 1</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5812086</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 2</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>6722175</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">compound 3</td>
			<td style="width:100px;">ChemBridge</td>
			<td>5249376</td>
			<td>screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gla I</td>
			<td style="width:100px;">SibEnzyme</td>
			<td style="width:119px;">E494</td>
			<td>methyl-sensitive endonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycerol</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">G22025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Oligonucleotide (5&#39;-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3&#39;-Iowa Black Quencher)</td>
			<td style="width:100px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom synthesized</td>
			<td>internally quenched hairpin DNA (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium Glutamate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">S-adenosylmethionine</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4377</td>
			<td>methyl-donating co-factor (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tris Base</td>
			<td style="width:100px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous fluorescence-based endonuclease-coupled dna methylation assay to screen for dna methyltransferase inhibitors

Epigenetik gen regülasyonunun bir formu olan DNA metilasyonu, normal hücresel fonksiyon için önemlidir. Hücrelerde, DNA metiltransferazlar (DNMT'ler) adı verilen proteinler, DNA metilasyon paternini oluşturur ve korur. Normal DNA metilasyon paternindeki değişiklikler, kanser gelişimi ve ilerlemesi ile bağlantılıdır ve DNMT'leri potansiyel kanser ilacı hedefleri haline getirir. Bu nedenle, bu enzimlerin yeni küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu yazıda DNA metiltransferaz inhibitörlerinin taranmasında kullanılabilecek bir protokol sunulmaktadır. Sürekli eşleşmiş kinetik tahlil, potansiyel küçük molekül inhibitörlerinin varlığında ve yokluğunda DNA metilasyonunun başlangıç hızlarının belirlenmesini sağlar. Tahlil, bir hemimetillenmiş DNA substratının metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için metile duyarlı endonükleaz Gla I'i kullanır.
Bu sürekli tahlil, enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Tahlilin mikrotitre plakalarında küçük hacimlerde yapılması, reaktiflerin maliyetini azaltır. Bu tahlil kullanılarak, insanlarda en bol DNMT izozimi olan DNMT1 inhibitörleri için küçük bir örnek tarama yapıldı. Yüksek oranda ikame edilmiş antrakinon doğal ürünü olan lakkaik asit A, DNMT1'in güçlü, DNA ile rekabet edebilecek bir inhibitörüdür. Burada, tahlil protokolünü tanımlamak için üç potansiyel küçük molekül inhibitörünü - antrakinonlar veya bir ila üç ikame maddeli antrakinon benzeri moleküller - iki konsantrasyonda inceliyoruz. Başlangıç hızları, her molekülün varlığında gözlenen yüzde aktivitesini hesaplamak için kullanılır. İncelenen üç bileşikten biri, DNMT1 aktivitesinin konsantrasyona bağlı inhibisyonunu sergiler ve bu da DNMT1'in potansiyel bir inhibitörü olduğunu gösterir.

Etkin DNMT1 bu analiz için bir önkoşuldur. RFTS'den yoksun DNMT1, E.coli'de eksprese edildi ve daha önce yayınlanmış prosedürleri takiben homojenliğe saflaştırıldı41. Saflaştırılmış enzimin aktif olduğundan emin olmak için, DNA metilasyon aktivitesini incelemek için süreksiz bir endonükleaz kuplajlı tahlil kullanıldı36. Bu tahlil, bir Sau3A1 bölünme bölgesine yerleştirilmiş tek bir hemimetillenmiş CpG ile 32 baz çifti dubleks DNA ku...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Bizimki gibi sağlam bir plaka okuyucu testi, potansiyel metiltransferaz inhibitörlerinin ilk taraması için çok yararlıdır. Gerçek zamanlı olarak veri toplama yeteneği, sürekli endonükleaz bağlantılı tahlilin büyük bir avantajıdır. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde ayrı ayrı 20 mikromolar ve 50 mikromolar bileşik içeren tahlil koşullarının 600 mikrolitresini hazırlayarak başlayın.Bunu yapmak için, son 1X metilasyon tamponu konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe çift damıtılmış su ve 5X metilasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, her numuneye mililitre sığır serum albümini veya BSA başına 3.15 mikrolitre 20 miligram ekleyin. Daha sonra, her numuneye iki mikrolitre 3.15 mikromolar saç tokası DNA substratı ve 1.33 mikrolitre 4.75 mikromolar S-adenosilmetiyonin veya SAM ekleyin.21 mikromolar veya 52.5 mikromolar nihai konsantrasyon ve eşdeğer miktarda dimetil sülfoksit veya DMSO elde etmek için uygun numunelere inhibitör ekleyin ve çözeltileri üç saniye boyunca dakikada 3.000 rotasyonda vorteksleme ile karıştırmadan önce bir kontrol numunesine ekleyin. Ardından, çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri bir masa masası mini santrifüjünde 1.200 kat G'de birkaç saniye döndürün. Aliquot Her tahlil çözeltisinin 95 mikrolitresi, siyah bir yarım alan 96 kuyu plakasında altı ardışık kuyuya dönüşür.Mikrosantrifüj tüplerinde 75 mikrolitre Gla I veya DNMT1 artı Gla I enzim çözeltisini, daha önce açıklandığı gibi bir kerelik tamponun son konsantrasyonuna hazırlayın. Daha sonra, mikrolitre başına 0.16 birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her çözeltiye mikrolitre Gla I başına 1.2 mikrolitre 10 birim ekleyin. 40 nanomolar'lık son konsantrasyon için DNMT1 artı Gla I çözeltisine DNMT1'den yoksun beş mikromolar RFTS'den 0.6 mikrolitre ekleyin.Nazik karıştırmadan sonra, çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri 1.200 G'de bir masa üstü mini santrifüjde birkaç saniye döndürün. Daha sonra, her enzim çözeltisinin 12 mikrolitresini, konik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada altı kuyucuk içine aliquot. DNA örneğinin metilasyon testi için, plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.Ardından, tahlil çözeltilerini içeren siyah plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı 425 CPM'de salladıktan sonra, floresanı 485 nanometre uyarma dalga boyu ve 528 nanometre emisyon dalga boyu ile ölçün. Ardından, plakayı beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Tahlil plakasını plaka okuyucusundan çıkarın ve her bir oyuğa beş mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin, ardından çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve floresanı 30 dakika boyunca her 53 saniyede bir kaydetmeden önce plakayı sallayın. Her koşul için üçlü Gla I kontrol tahlillerinin ortalama floresansını elde edin ve RFTS eksikliği olan DNMT1 varlığında elde edilen üçlü izlerden kontrol reaksiyonu tepsileri içeren ortalama Gla I değerini çıkarın.Ardından, düzeltilen çoğaltmalar için ortalamanın ortalama ve standart hatasını belirleyin. Ortalama düzeltilmiş reaksiyon izini çizin ve başlangıç hızını belirlemek için ilk doğrusal kısmı bir çizgiye sığdırın. Bir bileşiğin varlığında gözlenen hızı, kontrol reaksiyonunu içeren DMSO'da gözlenen hıza bölerek ve 100 ile çarparak yüzde aktivitesini belirleyin.Süreksiz bir endonükleaz kuplajlı tahlilin sonuçları, tamamen metillenmiş ürün DNA'sının bölünmeden korunduğunu ve RFTS'den yoksun DNMT1'in aktif olduğunu ve hemimetillenmiş substrat DNA'sını metilleştirebildiğini doğruladı. Floresan bazlı tahlilde, Gla I'in yokluğunda, DNMT1 veya tamponun eklenmesi tek başına arka plan floresansını etkilemedi. Gla I'in tüm tahlillere daha sonra eklenmesi, yalnızca DNMT1 içeren tahlillerde floresan üretimi ile sonuçlandı.RFTS eksikliği olan DNMT1 ve Gla I'in üç tahlil için eşzamanlı olarak eklenmesi, sağlam floresan üretimi ile sonuçlandı. Gla I'in eklenmesi tek başına floresan üretmedi. Potansiyel inhibitörleri taramak için, RFTS'den yoksun DNMT1'in DNA metilasyon aktivitesi, 20 ve 50 mikromolar konsantrasyonlarda DMSO, bileşik bir, bileşik iki veya bileşik üç varlığında incelenmiştir.Bu birleştirilmiş tahlilde floresan üretimini azaltan bileşikler daha da doğrulanmalıdır. Bileşiklerin bağlantı enzimini inhibe etmediğinden emin olmak önemli bir sonraki adımdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...