Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

تم ابتكار تقنية متغير ubiquitin في مختبر الدكتور ساشديف سيدهو (جامعة تورنتو). WZ حاليا باحث CIFAR Azrieli العالمية في البشر وبرنامج الميكروبيوم. تم تمويل هذا البحث من قبل NSERC ديسكفري المنح الممنوحة لWZ (RGPIN-2019-05721).

1. إعداد الكاشف
<ol><li>PBS (الفوسفات العازلة المالحة): مزيج 50 مل من محلول PBS 10x مع 450 مل من H2O فائقة الشراء. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة (~ 20-25 درجة مئوية).</li>
	<li>10٪ BSA (ألبوم مصل البقر): أضف ببطء 1 غرام من BSA إلى 7 مل من H2O فائقة الشراء واخلطها حتى تذوب بال...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

كما ذكر في الخطوة 2.1 (إعداد البروتين)، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتقييم تركيز البروتين، وسيكون لكل منها فوائد وعيوب فريدة من نوعها على أساس البروتين المستهدف المحدد المستخدم لعرض الفواج. وقد تم توفير مصدر للأوصاف التفصيلية والبروتوكولات للطرق الشعبية سابقا11.
<p clas...

إن فهم التفاصيل الجزيئية للتفاعلات بين البروتين والبروتين أمر بالغ الأهمية لتحديد آليات نقل الإشارات للعمليات البيولوجية، وخاصة تلك التي تساهم في الأمراض المهمة سريريا. في السنوات الأخيرة، تم استخدام عرض phage كطريقة عملية ويمكن الوصول إليها لعزل البروتينات / الببتيدات مع ربط محسنة كثيرا إلى البروتين المستهدف المطلوب1،2،3،4، والتي بدورها يمكن استخدامها كمسبارات داخل الخلايا من التفاعلات البروتين البروتين.
في كل مكان هو سلسلة من الأنشطة الأنزيمية (E1 تنشيط إنزيم → E2 اقتران انزيم → ليغاز E3) التي تترافق بشكل متناقض في كل مكان (Ub) إلى ركائز البروتين لاستهدافهم للتدهور أو للتوسط في التغيرات إشارات الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، deubiquitinases تحفيز إزالة كل مكان من البروتينات. لذلك ، في الخلايا ، هناك الآلاف من التفاعلات البروتينية البروتينية المعتمدة على Ub ، والغالبية العظمى منها تعترف بسطح مشترك مع تقارب منخفض ولكن خصوصية عالية للسماح بالتفاعلات الضعيفة من خلال الأسطح الكبيرة والمتنوعة.
أدخل إرنست وآخرون طفرات في المناطق الملزمة المعروفة في Ub من أجل معرفة ما إذا كان بإمكانهم تعزيز التقارب الملزم لبروتين ذي أهمية مع الحفاظ على الانتقائية العالية5. تم تطوير مكتبة مشتركة تضم أكثر من 10 مليارات (7.5 × 1010) من متغيرات Ub (UbVs) مع طفرات في مواقع عبر سطح Ub تتوسط في التفاعلات المعروفة بين البروتينUb. تألفت هذه المكتبة من phagemids التي تعبر عن بروتين معطف M13 bacteriophage pIII المنصهر في UbVs المتنوعة. لذلك ، يمكن عرض UbVs الفردية على سطح phage عبر بروتين المعطف عند التعبير. خلال عملية الاختيار ، سيتم الاحتفاظ بالphage التي تعرض UbVs مع تفاعلات ملزمة كبيرة مع البروتين المستهدف وإثراؤها في الجولات اللاحقة من عرض phage ، في حين يتم غسل phage عرض UbVs التي ترتبط بشكل سيئ بالبروتين المستهدف وإزالتها من بركة phage. تحتوي جزيئات ال phage المحتفظ بها على الفاغميد المقابل ل UbV المعروض ، مما يسمح بتسلسلها وتميزها مرة أخرى بمجرد عزلها.
باستخدام هذه الاستراتيجية الهندسية البروتين، تم تطوير مثبطات UbV ل deubiquitinases5 الإنسان وبروتيازيس6 الفيروسية. الأهم من ذلك ، لقد قمنا بتوليد UbVs المثبطة لE3 ligases HECT الأسرة البشرية من خلال اختطاف موقع E2 ملزمة وتفعيل UbVs التي تحتل exosite Ub ملزمة على domain7 HECT. يمكننا أيضا أن تمنع monomeric RING-الأسرة E3s من خلال استهداف موقع الربط E2 وحمل UbV dimerization لتنشيط هوموديمريك RING E3s8. بالنسبة إلى وحدات RING E3 متعددة الوحدات، يمكن أن تحقق UbVs تثبيطا من خلال استهداف الوحدة الفرعية RING (على سبيل المثال، بالنسبة إلى APC/C complex9) أو تعطيل التكوين المعقد (على سبيل المثال، ل SCF E3s10). بشكل جماعي ، يمكن الاستفادة من UbVs لاستجواب التفاعلات بين البروتين والبروتين بشكل منهجي في نظام Ub-proteasome (UPS) حتى نتمكن من فك الآليات الكيميائية الحيوية لإنزيمات UPS بشكل أفضل وتحديد المواقع الوظيفية للتدخل العلاجي والتحقق من صحتها.
يصف البروتوكول التالي كيفية استخدام مكتبة UbV المعروضة التي تم إنشاؤها مسبقا لاستهداف بروتين ذي أهمية وكيفية إثراء ملفات UbV التي تتفاعل مع البروتين المستهدف من خلال جولات متتالية من عرض phage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

يوبيكيتين هو بروتين صغير 8.6 كدا الذي هو عنصر أساسي في نظام ubiquitin-proteasome. وبالتالي، فإنه يمكن ربط لمجموعة متنوعة من البروتينات مع خصوصية عالية ولكن تقارب منخفض. من خلال عرض phage ، يمكن هندسة متغيرات Ubiquitin (UbVs) بحيث تظهر تقاربا محسنا على النمط البري في كل مكان وتحافظ على خصوصية ملزمة لاستهداف البروتينات. تستخدم شاشة Phage مكتبة phagemid ، حيث يتم دمج بروتين معطف pIII من البكتيريا M13 الخيطية (التي تم اختيارها لأنه يتم عرضها خارجيا على سطح phage) مع UbVs. المخلفات المحددة من النمط البري البشري في كل مكان لينة وعشوائية (أي، هناك تحيز نحو تسلسل النمط البري الأصلي) لتوليد UbVs بحيث يتم تجنب التغييرات الضارة في تشكيل البروتين مع إدخال التنوع اللازم لتعزيز التفاعلات الجديدة مع البروتين المستهدف. خلال عملية عرض phage ، يتم التعبير عن هذه UbVs وعرضها على بروتينات معطف phage ويتم تحريكها مقابل بروتين مهم. يتم الاحتفاظ UbVs التي تظهر التفاعلات ملزمة مواتية مع البروتين المستهدف، في حين يتم غسلها المجلدات الفقراء بعيدا وإزالتها من بركة المكتبة. يتم إعادة تركيب المركبات المحتفظ بها ، والتي ترتبط بجسيمات الفياج التي تحتوي على الفاجم المقابل ل UbV ، وتضخيمها وتركيزها بحيث يمكن تحريكها ضد نفس البروتين المستهدف في جولة أخرى من عرض phage. عادة، يتم تنفيذ ما يصل إلى خمس جولات من عرض phage، خلالها يتم فرض ضغط اختيار قوي ضد UbVs التي تربط ضعيفة و / أو مشوش بحيث يتم تركيز أولئك الذين لديهم تقارب أعلى وإثراء. في نهاية المطاف، يتم عزل UbVs التي تثبت خصوصية أعلى و / أو تقارب للبروتين المستهدف من نظرائهم من النوع البري ويمكن وصفها من خلال مزيد من التجارب.

يمكن التحقق من الموثقات المنتجة من عرض phage وتحليلها بطرق عديدة. فمن المستحسن أن المضي قدما أولا مع تسلسل phage مع التمهيديات التي تحيط إدراج متنوعة في مكتبة phagemid. سوف تظهر تجربة عرض phage المثالية تحيزا واضحا نحو عدة تسلسلات (الشكل 1). تسلسل أخرى ستكون موجودة أيضا ولكن مع عدد أقل، ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

إن التكوير في كل مكان هو تعديل حاسم للبروتين بعد الترجمه ، وقد تورط خلل التنظيم في العديد من الأمراض البشرية. هذا البروتوكول تفاصيل كيف يمكن استخدام عرض phage لعزل المتغيرات في كل مكان الرواية التي يمكن ربط وتعديل نشاط ليجار E3 التي تتحكم في خصوصية وكفاءة وأنماط في كل مكان.

استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

عرض Phage لا يساعدنا فقط على التحقيق في الخصائص الملزمة للإنزيمات المهمة سريريا ، ولكن أيضا تطوير المغيرات لتلك الإنزيمات والأمراض المقابلة لها. يمكن استخدام شاشة Phage لتطوير ملفات جديدة لمجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة ، كما أنه أسهل في الأداء من طرق العرض التقليدية الأخرى. هذا الإجراء ينطوي على الكثير من العمل المتكرر، وبالتالي فإن المفتاح هو عدم الطيار الآلي والبقاء مركزة في جميع أنحاء.ابدأ بتطعيم 30 ملليلتر من مرق التتراسيكلين 2YT مع 200 ميكرولتر من ثقافة البذور. احتضانه لمدة ثلاث ساعات تقريبا في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل. تجاهل حل الطلاء من لوحة في بالوعة.جففه برفق مع المناشف الورقية. ثم إضافة 200 ميكرولتر من PB العازلة لكل المغلفة جيدا. تجاهل العازلة PB من لوحة وتجفيفه على المناشف الورقية.إضافة 200 ميكرولتر آخر من العازلة PB إلى كل بئر المغلفة من لوحة. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة. إذابة مكتبة phage على الجليد ، ثم تمييعها إلى 100X تنوع المكتبة في PBS.أضف محلول كلوريد الصوديوم البولي إيثيلين غليكول في خمس حجم المكتبة المخفف واحتضان المحلول على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، طرد مركزي الحل في 11، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant والطرد المركزي لمدة دقيقتين أخريين لسحب أسفل supernatant المتبقية وتركيز بيليه phage.إعادة إنفاق بلطف بيليه phage في ملليلتر واحد من PBT العازلة لكل بروتين الهدف ليتم تحليلها، وعادة ما تكون أربعة في المجموع. إضافة 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل المغلفة جيدا في لوحة التحكم. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.تجاهل المخزن المؤقت PB من لوحة الهدف في الحوض وتجفيف لوحة على المناشف الورقية. نقل جميع ميكرولتر 100 من مكتبة phage في لوحة التحكم إلى كل بئر المغلفة من لوحة الهدف. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.بعد ذلك، قم بإزالة مكتبة phage من اللوحة واغسل الآبار المغلفة أربع مرات مع مخزن PT المؤقت. عكس لوحة والاستفادة على منشفة ورقية لإزالة قطرات الماضي من العازلة. إضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المولر 0.1 إلى كل المغلفة جيدا لe elute phage.احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، تحييد الحموضة بإضافة 12.5 ميكرولتر من الحموضة 11 واحد الضرس تريس هيدروكلوريد إلى كل بئر المغلفة. نقل phage eluted من جميع الآبار الثمانية في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي.ماصة صعودا وهبوطا أثناء النقل لجعل الحلول متجانسة و أسبيرات جميع السوائل من الآبار. إضافة 10٪ BSA إلى phage eluted لجعل التركيز النهائي 1٪ تخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق في أربع درجات مئوية. هذا هو الناتج الجولة الأولى.إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار عن طريق تلقيح خمسة ملليلترات من ثقافة بذور التتراسيكلين 2YT مع مستعمرة E.coli معزولة من لوحة أجار. احتضانه بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. تمييع البروتين المستهدف في الجولتين الثانية وثلاثة أنبوب مع كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني.خذ نصف محتويات الجولتين الثانية وثلاثة أنابيب ومعطف أربعة آبار لكل بروتين مستهدف في لوحة ملزمة 96 جيدا للجولة القادمة. بعد ذلك، استخدم نصف إخراج الجولة الأولى لتطعيم ثلاثة ملليلترات من خلايا مرحلة منتصف السجل. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.إضافة M13KO7 المساعد phage إلى تركيز النهائي من 10 مليار PFU لكل ملليلتر. احتضان مرة أخرى في 37 درجة مئوية لمدة ساعة مع 200 RPM اهتزاز المداري. بعد ساعة، نقل كامل ثلاثة ملليلتر من الثقافة إلى 30 ملليلتر من محلول الكاناميسين كاربينسيلين 2YT.تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. تظهر النتائج التمثيلية لاختيار متغير ubiquitin مقابل UBE4B هنا. تم طلب UBVs من أعلى إلى أدنى تردد.تمثل التسلسلات منطقة كل مكان متنوعة في UBV مع جميع المخلفات العشوائية. يتم قياس التقارب النسبي الملزم للموثقات بالبروتين المستهدف من النوع البري ، البروتين المستهدف المتحول ، وكذلك البروتينات غير المستهدفة من خلال فحوصات مناعية مرتبطة بالإنزيم أو ELISA. تم تطبيع جميع امتصاصات ELISA مقابل 96 متوسط درجات BSA ELISA و 96 متوسط درجات GST ELISA.يمثل اللون الأخضر الداكن الربط النسبي الأقوى. تم تضمين GST كعنصر تحكم للربط غير المحدد لأن البروتين المستهدف هو علامة GST. يتم عرض نتائج ELISA بيانيا هنا.يمثل المحور س UBVs ويمثل المحور ص امتصاص تسويتها المقابلة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ألا تتخلص من المحلول الموجود في اللوحة بعد إضافة حمض الهيدروكلوريك. يتم تعليق phages الآن في الحل وتريد الاحتفاظ بها حتى تتمكن من إجراء التحليلات النهائية اللاحقة للتخصيب أو كليهما.بعد هذا الإجراء، يجب إجراء التسلسل لتحديد ترددات UBV. يمكن إجراء اختبارات ELISAs و IC50 لتحديد الفعالية الملزمة والفعالية المثبطة على التوالي وكذلك للمساعدة في تحديد UBVs التي يجب توصيفها بشكل أكبر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

توصيف وظيفي لحلقه من نوع E3 اوبيكويتين الاربطه في المختبر وفي بلانتa

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...