Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

De ubiquitine variant technologie werd bedacht in het laboratorium van Dr. Sachdev Sidhu (Universiteit van Toronto). WZ is momenteel een CIFAR Azrieli Global Scholar in het Humans & The Microbiome Program. Dit onderzoek werd gefinancierd door NSERC Discovery Grants toegekend aan WZ (RGPIN-2019-05721).

1. Reagensvoorbereiding
<ol><li>PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing): Meng 50 ml 10x PBS-oplossing met 450 ml ultrapuur H2O. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C of kamertemperatuur (~ 20-25 °C).</li>
	<li>10% BSA (runderserumalbumine): Voeg langzaam 1 g BSA toe aan 7 ml ultrapuur H2O en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur H2O totdat het uiteindelijke volume 10 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>PB-buffer (PB...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

Zoals vermeld in stap 2.1 (eiwitpreparaat), kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de eiwitconcentratie te beoordelen, en elk zal unieke voor- en nadelen hebben op basis van het specifieke doeleiwit dat wordt gebruikt voor faagweergave. Een bron van gedetailleerde beschrijvingen en protocollen voor populaire methoden is eerder verstrekt11.
Het gebruik van de faag die door een vorige faagronde wordt vastgehouden als input voor een volgende ronde verrijkt de goe...

Het begrijpen van de moleculaire details van eiwit-eiwitinteracties is van cruciaal belang voor het afbakenen van de signaaltransductiemechanismen van biologische processen, met name die welke bijdragen aan klinisch belangrijke ziekten. In de afgelopen jaren is faagweergave gebruikt als een praktische en toegankelijke methode om eiwitten / peptiden te isoleren met een sterk verbeterde binding aan een gewenst doeleiwit1,2,3,4, dat op zijn beurt kan worden gebruikt als intracellulaire sondes van eiwit-eiwitinteracties.
Ubiquitinatie is een cascade van enzymatische activiteiten (E1 activerend enzym → E2-conjugaterend enzym → E3-ligases) die ubiquitine (Ub) covalent conjugeren aan eiwitsubstraten om ze te richten op afbraak of om celsignaleringsveranderingen te bemiddelen. Bovendien katalyseren deubiquitinasen de verwijdering van ubiquitine uit eiwitten. Daarom zijn er in cellen duizenden Ub-afhankelijke eiwit-eiwitinteracties, waarvan de overgrote meerderheid een gemeenschappelijk oppervlak herkent met een lage affiniteit maar hoge specificiteit om zwakke interacties door grote en diverse oppervlakken mogelijk te maken.
Ernst et al. introduceerden mutaties in bekende bindingsgebieden van Ub om te zien of ze de bindingsaffiniteit voor een interessant eiwit konden verbeteren met behoud van een hoge selectiviteit5. Een combinatorische bibliotheek van meer dan 10 miljard (7,5 x 1010) Ub-varianten (UbV's) met mutaties op posities over het Ub-oppervlak die de bekende Ub-eiwitinteracties bemiddelen, werd ontwikkeld. Deze bibliotheek bestond uit faagmiden die het M13 bacteriofaag pIII-vachteiwit tot expressie brengen, gefuseerd met gediversifieerde UbV's. Daarom kunnen individuele UbV's bij expressie via het vachteiwit op het faagoppervlak worden weergegeven. Tijdens het selectieproces worden fagen met UbV's met aanzienlijke bindingsinteracties met het doeleiwit behouden en verrijkt in volgende faagrondes, terwijl faag met UbV's die slecht binden aan het doeleiwit worden weggespoeld en uit de faagpool worden verwijderd. De vastgehouden faagdeeltjes bevatten het faagmide dat overeenkomt met hun weergegeven UbV, waardoor ze kunnen worden gesequenced en verder kunnen worden gekarakteriseerd zodra ze zijn geïsoleerd.
Met behulp van deze eiwittechnologiestrategie werden UbV-remmers ontwikkeld voor menselijke deubiquitinasen5 en virale proteasen6. Belangrijk is dat we remmende UbV's hebben gegenereerd voor menselijke HECT-familie E3-ligases door de E2-bindingsplaats te kapen en UbV's te activeren die een Ub-bindende exosiet op het HECT-domein bezetten7. We kunnen ook monomere RING-familie E3's remmen door ons te richten op de E2-bindingsplaats en UbV-dimerisatie induceren om homodimere RING E3s8 te activeren. Voor ring-E3's met meerdere subeenheden kunnen UbV's remming bereiken door zich te richten op de RING-subeenheid (bijvoorbeeld voor APC / C-complex9) of complexe vorming te verstoren (bijvoorbeeld voor SCF E3s10). Gezamenlijk kunnen UbV's worden gebruikt om systematisch eiwit-eiwitinteracties in het Ub-proteasoomsysteem (UPS) te ondervragen, zodat we biochemische mechanismen van UPS-enzymen beter kunnen ontcijferen en functionele locaties voor therapeutische interventie kunnen identificeren en valideren.
Het volgende protocol beschrijft hoe een eerder gegenereerde faag weergegeven UbV-bibliotheek kan worden gebruikt om een eiwit van belang te targeten en hoe de UbV-bindmiddelen die interageren met het doeleiwit kunnen worden verrijkt door middel van opeenvolgende faagweergaverondes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

Ubiquitine is een klein 8,6 kDa-eiwit dat een kerncomponent is van het ubiquitine-proteasoomsysteem. Bijgevolg kan het binden aan een breed scala aan eiwitten met een hoge specificiteit maar een lage affiniteit. Door middel van faagweergave kunnen ubiquitinevarianten (UbV's) zo worden ontworpen dat ze een verbeterde affiniteit vertonen ten opzichte van wildtype ubiquitine en bindingsspecificiteit behouden voor doeleiwitten. Faagweergave maakt gebruik van een faagmid-bibliotheek, waarbij het pIII-coatingeiwit van een filamenteuze M13-bacteriofaag (gekozen omdat het extern op het faagoppervlak wordt weergegeven) wordt gefuseerd met UbV's. Specifieke residuen van menselijk wildtype ubiquitine zijn zacht en gerandomiseerd (d.w.z. er is een voorkeur voor inheemse wildtypesequentie) om UbV's te genereren, zodat schadelijke veranderingen in eiwitconformatie worden vermeden en tegelijkertijd de diversiteit wordt geïntroduceerd die nodig is voor het bevorderen van nieuwe interacties met het doeleiwit. Tijdens het faagweergaveproces worden deze UbV's tot expressie gebracht en weergegeven op faaglaageiwitten en gepaneerd tegen een eiwit van belang. UUBV's die gunstige bindingsinteracties met het doeleiwit vertonen, worden behouden, terwijl slechte bindmiddelen worden weggespoeld en uit de bibliotheekpool worden verwijderd. De bewaarde UbV's, die zijn bevestigd aan het faagdeeltje dat de overeenkomstige faagmide van de UbV bevat, worden geëlueerd, versterkt en geconcentreerd, zodat ze in een andere faagronde tegen hetzelfde doeleiwit kunnen worden gepaneerd. Doorgaans worden maximaal vijf faagrondes uitgevoerd, waarbij een sterke selectiedruk wordt opgelegd aan UbV's die zwak en/of promiscue binden, zodat degenen met hogere affiniteiten geconcentreerd en verrijkt zijn. Uiteindelijk worden UbV's die een hogere specificiteit en /of affiniteit voor het doeleiwit aantonen dan hun wildtype-tegenhangers geïsoleerd en kunnen ze worden gekarakteriseerd door verdere experimenten.

Bindmiddelen geproduceerd uit faagweergave kunnen op vele manieren worden geverifieerd en geanalyseerd. Het wordt aanbevolen om eerst over te gaan tot het sequencen van de faag met primers die de gediversifieerde insert in de faagmidbibliotheek flankeren. Een ideaal faagweergave-experiment zal een duidelijke voorkeur voor verschillende sequenties laten zien (figuur 1). Andere sequenties zullen ook aanwezig zijn, maar met een lagere telling, die meer als achtergrondgeluid verschijnen. In het ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubiquitinatie is een kritisch eiwit posttranslationele modificatie, waarvan ontregeling is betrokken bij tal van menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft hoe faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe ubiquitinevarianten te isoleren die de activiteit van E3-ligases kunnen binden en moduleren die de specificiteit, efficiëntie en patronen van ubiquitinatie regelen.

Faagdisplay gebruiken om ubiquitinevariatoren voor E3-ligases te ontwikkelen

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Faagweergave helpt ons niet alleen de bindingskenmerken van klinisch belangrijke enzymen te onderzoeken, maar ontwikkelt ook modulatoren voor die enzymen en de bijbehorende ziekten. Faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe bindmiddelen te ontwikkelen voor een breed scala aan doeleiwitten en is ook gemakkelijker uit te voeren dan andere conventionele weergavemethoden. Deze procedure omvatte veel repetitieve actie, dus de sleutel is om niet automatisch te werken en gedurende de hele tijd gefocust te blijven.Begin met het inenten van 30 milliliter 2YT tetracycline bouillon met 200 microliter van de zaadcultuur. Incubeer het gedurende ongeveer drie uur bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden totdat de bacteriën zich in de middenlogfase bevinden. Gooi de coatingoplossing van de plaat weg in een gootsteen.Droog het voorzichtig af met keukenpapier. Voeg vervolgens 200 microliter PB-buffer toe aan elke gecoate put. Gooi de PB-buffer van het bord en droog deze op keukenpapier.Voeg nog eens 200 microliter PB-buffer toe aan elke gecoate put van de plaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden. Ontdooi de faagbibliotheek op ijs en verdun deze vervolgens tot 100X de bibliotheekdiversiteit in PBS.Voeg de polyethyleenglycolnatriumchlorideoplossing toe aan een vijfde van het verdunde bibliotheekvolume en incubeer de oplossing gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de oplossing op 11.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en centrifugeer het nog twee minuten om het resterende supernatant naar beneden te trekken en de faagkorrel te concentreren.Resuspend de faagkorrel voorzichtig in één milliliter PBT-buffer per te analyseren doeleiwit, meestal vier in totaal. Voeg 100 microliter faagbibliotheek toe aan elke gecoate put in de controleplaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden.Gooi de PB-buffer van de doelplaat in de gootsteen en droog de plaat op keukenpapier. Breng alle 100 microliter van de faagbibliotheek in de controleplaat over naar elke gecoate put van de doelplaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden.Verwijder vervolgens de faagbibliotheek van de plaat en was de gecoate putten vier keer met PT-buffer. Keer de plaat om en tik op een papieren handdoek om de laatste druppels buffer te verwijderen. Voeg 100 microliter 0,1 molair zoutzuur toe aan elke gecoate put om de faag te elueren.Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met 300 RPM orbitaal schudden. Neutraliseer daarna de pH door 12,5 microliter pH 11 één molaire tris hydrochloride toe te voegen aan elke gecoate put. Breng de geëlueerde faag uit alle acht putten over in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Pipetteer op en neer tijdens de overdracht om oplossingen homogeen te maken en alle vloeistof uit de putten op te zuigen. Voeg 10% BSA toe aan de geëlueerde faag om de uiteindelijke concentratie 1% te maken Bewaar de microcentrifugebuis bij vier graden Celsius. Dit is de ronde één uitgang.Bereid een zaadcultuur voor voor het kweken van de faaginvoer voor de volgende selectieronde door vijf milliliter 2YT tetracycline-zaadkweek te enten met een geïsoleerde E.coli-kolonie uit een agarplaat. Incubeer het 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden. Verdun het doeleiwit in de rondes twee en drie buis met een geschikte hoeveelheid PBS.Neem de helft van de inhoud van ronde twee en drie buis en dek vier putjes per doeleiwit in een 96-well bindingsplaat voor de volgende ronde. Gebruik vervolgens de helft van de round one-uitgang om drie milliliter mid-log fasecellen te enten. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 200 RPM orbitaal schudden.Voeg M13KO7 helperfaag toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 miljard PFU per milliliter. Incubeer het opnieuw bij 37 graden Celsius gedurende een uur met 200 RPM orbitaal schudden. Breng na een uur de volledige drie milliliter cultuur over op 30 milliliter 2YT carbenicilline kanamycine-oplossing.Groei 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden. De representatieve resultaten voor een selectie van ubiquitinevarianten tegen UBE4B worden hier weergegeven. UIV's werden besteld van de hoogste naar de laagste frequentie.Sequenties vertegenwoordigen het gediversifieerde ubiquitinegebied in de UBV met alle gerandomiseerde residuen. De relatieve bindingsaffiniteit van de bindmiddelen aan het wildtype doeleiwit, gemuteerd doeleiwit en off-target eiwitten wordt gemeten door enzymgebonden immunosorbent assays of ELISA. Alle ELISA-absorpties werden genormaliseerd tegen 96 gemiddelde BSA ELISA-scores en 96 gemiddelde GST ELISA-scores.Donkerder groen vertegenwoordigt de sterkere relatieve binding. GST werd opgenomen als een controle voor niet-specifieke binding omdat het doeleiwit GST-gelabeld is. De ELISA-resultaten worden hier grafisch weergegeven.De x-as vertegenwoordigt de UBL's en de y-as vertegenwoordigt de overeenkomstige genormaliseerde absorptie. Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk dat u de oplossing niet in de plaat weggooit nadat u het zoutzuur hebt toegevoegd. De fagen hangen nu in oplossing en deze wilt u behouden zodat u latere verrijkingsanalyses of beide kunt uitvoeren.Volgens deze procedure moet sequencing worden uitgevoerd om UBV-frequenties te bepalen. ELISA's en IC50-assays kunnen worden uitgevoerd om respectievelijk bindende werkzaamheid en remmende werkzaamheid te bepalen en ook om te helpen bepalen welke UIV's verder moeten worden gekarakteriseerd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...