Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
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Die Ubiquitin-Varianten-Technologie wurde im Labor von Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto) entwickelt. WZ ist derzeit CIFAR Azrieli Global Scholar im Humans & The Microbiome Program. Diese Forschung wurde durch NSERC Discovery Grants finanziert, die dem WZ verliehen wurden (RGPIN-2019-05721).

1. Vorbereitung des Reagenzes
<ol><li>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung): Mischen Sie 50 ml 10x PBS-Lösung mit 450 ml hochreinem H2O. Sterilisieren Sie durch Filtration und lagern Sie es bei 4 ° C oder Raumtemperatur (~ 20-25 ° C).</li>
	<li>10% BSA (Rinderserumalbumin): Langsam 1 g BSA zu 7 ml ultrareinem H2O hinzufügen und mischen, bis es vollständig gelöst ist (keine Klumpen). Mit hochreinem H2O auffüllen, bis das Endvolumen 10 ml beträgt. Sterilisieren durch Filtration...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

Wie in Schritt 2.1 (Proteinpräparation) erwähnt, kann eine Vielzahl von Methoden verwendet werden, um die Proteinkonzentration zu bewerten, und jede hat einzigartige Vor- und Nachteile, basierend auf dem spezifischen Zielprotein, das für die Phagenanzeige verwendet wird. Eine Quelle detaillierter Beschreibungen und Protokolle für gängige Methoden wurde bereits bereitgestellt11.
Die Verwendung des Phagen, der von einer vorherigen Phagenrunde zurückgehalten wird, al...

Das Verständnis der molekularen Details von Protein-Protein-Interaktionen ist entscheidend für die Abgrenzung der Signaltransduktionsmechanismen biologischer Prozesse, insbesondere solcher, die zu klinisch wichtigen Krankheiten beitragen. In den letzten Jahren wurde die Phagenanzeige als praktische und zugängliche Methode zur Isolierung von Proteinen/Peptiden mit deutlich verbesserter Bindung an ein gewünschtes Zielprotein1,2,3,4 eingesetzt, das wiederum als intrazelluläre Sonden für Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden kann.
Die Ubiquitinierung ist eine Kaskade enzymatischer Aktivitäten (E1-aktivierendes Enzym → E2-konjugierendes Enzym → E3-Ligasen), die Ubiquitin (Ub) kovalent an Proteinsubstrate konjugieren, um sie für den Abbau oder die Vermittlung von Zellsignaländerungen anzusprechen. Darüber hinaus katalysieren Deubiquitinasen die Entfernung von Ubiquitin aus Proteinen. Daher gibt es in Zellen Tausende von Ub-abhängigen Protein-Protein-Interaktionen, von denen die überwiegende Mehrheit eine gemeinsame Oberfläche mit geringer Affinität, aber hoher Spezifität erkennt, um schwache Wechselwirkungen durch große und vielfältige Oberflächen zu ermöglichen.
Ernst et al. führten Mutationen in bekannte Bindungsregionen von Ub ein, um zu sehen, ob sie die Bindungsaffinität für ein Protein von Interesse verbessern und gleichzeitig eine hohe Selektivität beibehalten könnten5. Es wurde eine kombinatorische Bibliothek von über 10 Milliarden (7,5 x 1010) Ub-Varianten (UbVs) mit Mutationen an Positionen über die Ub-Oberfläche entwickelt, die die bekannten Ub-Protein-Interaktionen vermitteln. Diese Bibliothek bestand aus Phagenmiden, die das M13-Bakteriophagen-pIII-Mantelprotein exprimieren, das zu diversifizierten UbVs fusioniert wurde. Daher können einzelne UbVs über das Mantelprotein bei der Expression auf der Phagenoberfläche dargestellt werden. Während des Auswahlprozesses werden Phagen, die UbVs mit erheblichen Bindungsinteraktionen mit dem Zielprotein aufweisen, in nachfolgenden Runden der Phagenanzeige zurückgehalten und angereichert, während Phagen mit UbVs, die schlecht an das Zielprotein binden, weggewaschen und aus dem Phagenpool entfernt werden. Die zurückgehaltenen Phagenpartikel enthalten das Phagemid, das ihrem angezeigten UbV entspricht, so dass sie nach der Isolierung sequenziert und weiter charakterisiert werden können.
Mit dieser Protein-Engineering-Strategie wurden UbV-Inhibitoren für humane Deubiquitinasen5 und virale Proteasen6 entwickelt. Wichtig ist, dass wir hemmende UbVs für menschliche E3-Ligasen der HECT-Familie erzeugt haben, indem wir die E2-Bindungsstelle entführt und UbVs aktiviert haben, die einen Ub-bindenden Exositen auf der HECT-Domäne besetzen7. Wir können auch monomere E3 der RING-Familie hemmen, indem wir auf die E2-Bindungsstelle abzielen und eine UbV-Dimerisierung induzieren, um den homodimeren RING E3s8 zu aktivieren. Bei Ring E3s mit mehreren Untereinheiten können UbVs eine Hemmung erreichen, indem sie auf die RING-Untereinheit abzielen (z. B. für APC/C-Komplex9) oder die Komplexbildung stören (z. B. für SCF E3s10). Insgesamt können UbVs genutzt werden, um Protein-Protein-Interaktionen im Ub-Proteasom-System (UPS) systematisch zu untersuchen, so dass wir biochemische Mechanismen von USV-Enzymen besser entschlüsseln und funktionelle Stellen für therapeutische Interventionen identifizieren und validieren können.
Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine zuvor generierte Phagen-displayte UbV-Bibliothek verwendet wird, um auf ein Protein von Interesse abzuzielen, und wie die UbV-Bindemittel, die mit dem Zielprotein interagieren, durch aufeinanderfolgende Runden der Phagenanzeige angereichert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

Ubiquitin ist ein kleines 8,6 kDa-Protein, das ein Kernbestandteil des Ubiquitin-Proteasom-Systems ist. Folglich kann es an eine Vielzahl von Proteinen mit hoher Spezifität, aber geringer Affinität binden. Durch phagenanzeige können Ubiquitinvarianten (UbVs) so konstruiert werden, dass sie eine verbesserte Affinität gegenüber Wildtyp-Ubiquitin aufweisen und die Bindungsspezifität an Zielproteine beibehalten. Die Phagenanzeige verwendet eine Phagemidenbibliothek, wobei das pIII-Mantelprotein eines filamentösen M13-Bakteriophagen (ausgewählt, weil es äußerlich auf der Phagenoberfläche angezeigt wird) mit UbVs verschmolzen wird. Spezifische Reste von menschlichem Wildtyp-Ubiquitin sind weich und randomisiert (d.h. es gibt eine Verzerrung hin zur nativen Wildtypsequenz), um UbVs zu erzeugen, so dass schädliche Veränderungen in der Proteinkonformation vermieden werden und gleichzeitig die Vielfalt eingeführt wird, die für die Förderung neuartiger Interaktionen mit dem Zielprotein erforderlich ist. Während des Phagenanzeigeprozesses werden diese UbVs exprimiert und auf Phagenmantelproteinen angezeigt und gegen ein Protein von Interesse geschwenkt. UbVs, die günstige Bindungswechselwirkungen mit dem Zielprotein aufweisen, bleiben erhalten, während schlechte Bindemittel weggespült und aus dem Bibliothekspool entfernt werden. Die zurückgehaltenen UbVs, die an das Phagenpartikel gebunden sind, das das entsprechende Phagemid des UbV enthält, werden eluiert, amplifiziert und konzentriert, so dass sie in einer weiteren Runde der Phagenanzeige gegen dasselbe Zielprotein geschwenkt werden können. Typischerweise werden bis zu fünf Runden Phagendarstellung durchgeführt, in denen ein starker Selektionsdruck gegen UbVs ausgeübt wird, die schwach und / oder promiskuitiv binden, so dass diejenigen mit höheren Affinitäten konzentriert und angereichert werden. Letztendlich werden UbVs, die eine höhere Spezifität und/oder Affinität für das Zielprotein aufweisen als ihre Wildtyp-Pendants, isoliert und können durch weitere Experimente charakterisiert werden.

Bindemittel, die aus der Phagenanzeige hergestellt werden, können auf vielfältige Weise verifiziert und analysiert werden. Es wird empfohlen, zuerst mit der Sequenzierung des Phagen mit Primern fortzufahren, die das diversifizierte Insert in der Phagemidenbibliothek flankieren. Ein ideales Phagen-Display-Experiment zeigt eine klare Verzerrung zu mehreren Sequenzen (Abbildung 1). Andere Sequenzen werden ebenfalls vorhanden sein, jedoch mit einer niedrigeren Anzahl, die eher als Hintergrundg...

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Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.

Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Die Phagenanzeige hilft uns nicht nur, die Bindungseigenschaften klinisch wichtiger Enzyme zu untersuchen, sondern auch Modulatoren für diese Enzyme und die entsprechenden Erkrankungen zu entwickeln. Die Phagenanzeige kann verwendet werden, um neuartige Bindemittel für eine Vielzahl von Zielproteinen zu entwickeln, und ist auch einfacher durchzuführen als andere herkömmliche Anzeigemethoden. Diese Prozedur beinhaltete eine Menge sich wiederholender Aktionen, so dass der Schlüssel darin besteht, keinen Autopiloten zu erhalten und durchgehend konzentriert zu bleiben.Beginnen Sie mit der Impfung von 30 Millilitern 2YT Tetracyclinbrühe mit 200 Mikrolitern der Samenkultur. Inkubieren Sie es für ungefähr drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln, bis sich die Bakterien in der mittleren Log-Phase befinden. Entsorgen Sie die Beschichtungslösung von der Platte in eine Spüle.Trocknen Sie es vorsichtig mit Papiertüchern ab. Dann fügen Sie 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu. Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Platte und trocknen Sie ihn auf Papiertüchern.Fügen Sie weitere 200 Mikroliter PB-Puffer zu jeder beschichteten Vertiefung der Platte hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln. Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf und verdünnen Sie sie dann auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS.Fügen Sie die Polyethylenglykol-Natriumchloridlösung bei einem Fünftel des verdünnten Bibliotheksvolumens hinzu und inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang auf Eis. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 11.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn für weitere zwei Minuten, um den verbleibenden Überstand herunterzuziehen und das Phagenpellet zu konzentrieren.Resuspendieren Sie das Phagenpellet vorsichtig in einem Milliliter PBT-Puffer pro zu analysierendem Zielprotein, typischerweise insgesamt vier. Fügen Sie 100 Mikroliter Phagenbibliothek zu jeder beschichteten Vertiefung in der Kontrollplatte hinzu. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln.Entsorgen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte in die Spüle und trocknen Sie die Platte auf Papiertüchern. Übertragen Sie alle 100 Mikroliter der Phagenbibliothek in der Steuerplatte in jede beschichtete Vertiefung der Zielplatte. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde mit 300 U / min Orbitalschütteln.Als nächstes entfernen Sie die Phagenbibliothek von der Platte und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Puffertropfen zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter 0,1 molare Salzsäure zu jeder beschichteten Vertiefung hinzu, um den Phagen zu eluieren.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für fünf Minuten mit 300 U / min Orbitalschütteln. Danach neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 12,5 Mikroliter pH 11 ein molares Trishydrochlorid zu jeder beschichteten Vertiefung hinzufügen. Übertragen Sie den eluierten Phagen aus allen acht Vertiefungen in ein einziges 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Während des Transfers auf und ab pipettieren, um die Lösungen homogen zu machen und die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen abzusaugen. Dem eluierten Phagen 10% BSA zuführen, um die Endkonzentration auf 1% zu erhöhen Lagern Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius. Dies ist die runde eins Ausgabe.Bereiten Sie eine Samenkultur für die Kultivierung des Phageneintrags für die nächste Auswahlrunde vor, indem Sie fünf Milliliter 2YT Tetracyclin-Samenkultur mit einer isolierten E. coli-Kolonie aus einer Agarplatte impfen. Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln. Verdünnen Sie das Zielprotein in den Runden zwei und drei Röhrchen mit einer geeigneten Menge PBS.Nehmen Sie die Hälfte des Inhalts der Runden zwei und drei Röhrchen und beschichten Sie vier Vertiefungen pro Zielprotein in einer 96-Well-Bindungsplatte für die nächste Runde. Als nächstes verwenden Sie die Hälfte des round one-Ausgangs, um drei Milliliter Mid-Log-Phasenzellen zu impfen. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 200 U / min Orbitalschütteln.M13KO7-Helferphagen in eine Endkonzentration von 10 Milliarden PFU pro Milliliter geben. Inkubieren Sie es erneut bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit 200 U / min Orbitalschütteln. Nach einer Stunde die gesamten drei Milliliter Kultur auf 30 Milliliter 2YT Carbenicillin-Kanamycin-Lösung übertragen.Wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U / min Orbitalschütteln. Die repräsentativen Ergebnisse für eine Ubiquitin-Variantenselektion gegen UBE4B sind hier dargestellt. UBVs wurden von der höchsten bis zur niedrigsten Frequenz bestellt.Sequenzen stellen die diversifizierte Ubiquitinregion im UBV mit allen randomisierten Resten dar. Die relative Bindungsaffinität der Bindemittel zum Wildtyp-Zielprotein, zum mutierten Zielprotein sowie zu Off-Target-Proteinen wird mittels enzymgebundener Immunosorbent-Assays oder ELISA gemessen. Alle ELISA-Absorptionen wurden gegen 96 gemittelte BSA-ELISA-Scores und 96 gemittelte GST-ELISA-Scores normalisiert.Dunkleres Grün stellt die stärkere relative Bindung dar. GST wurde als Kontrolle für unspezifische Bindung aufgenommen, da das Zielprotein GST-markiert ist. Die ELISA-Ergebnisse werden hier grafisch dargestellt.Die x-Achse stellt die UBVs und die y-Achse die entsprechende normalisierte Absorption dar. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, dass Sie die Lösung nicht in der Platte entsorgen, nachdem Sie die Salzsäure hinzugefügt haben. Die Phagen sind nun in Lösung suspendiert und Sie möchten diese behalten, damit Sie nachträgliche Anreicherungs-Endanalysen oder beides durchführen können.Nach diesem Verfahren sollte eine Sequenzierung durchgeführt werden, um die UBV-Frequenzen zu bestimmen. ELISAs und IC50-Assays können durchgeführt werden, um Bindungswirksamkeiten bzw. hemmende Wirksamkeiten zu bestimmen und auch um zu bestimmen, welche UBVs weiter charakterisiert werden sollen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

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Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

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In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

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Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

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