Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

טכנולוגיית וריאנט אוביקוויטין הומצאה במעבדה של ד"ר סצ'דב סידו (אוניברסיטת טורונטו). WZ הוא כיום חוקרת גלובלית של CIFAR עזריאלי בתוכנית בני האדם והמיקרוביום. מחקר זה מומן על ידי מענקי דיסקברי NSERC שהוענקו ל- WZ (RGPIN-2019-05721).

1. הכנת ריאגנט
<ol><li>PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט): יש לערבב 50 מ"ל של תמיסת PBS 10x עם 450 מ"ל של H2O אולטרה-סבר. מחטאים לפי סינון ומאחסנים בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או בטמפרטורת החדר (~20-25 °C (20°F).</li>
	<li>10% BSA (אלבומין בסרום בקר): הוסיפו לאט לאט 1 גרם של BSA ל-7 מ"ל של H2O אולטרה-תיבול וערבבו עד להמסה מלאה (ללא...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

כפי שצוין בשלב 2.1 (הכנת חלבון), ניתן להשתמש במגוון שיטות להערכת ריכוז החלבון, ולכל אחת מהן יהיו יתרונות וחסרונות ייחודיים המבוססים על חלבון היעד הספציפי המשמש לתצוגת פאג'. בעבר סופק מקור לתיאורים ופרוטוקולים מפורטים עבור שיטות פופולריות.
השימוש בפאג' שנשמר על יד...

הבנת הפרטים המולקולריים של אינטראקציות חלבון-חלבון היא קריטית לתיווג מנגנוני התמרת האות של תהליכים ביולוגיים, במיוחד אלה התורמים למחלות חשובות מבחינה קלינית. בשנים האחרונות, תצוגת פאג' נוצלה כשיטה מעשית ונגישה לבידוד חלבונים/פפטידים עם קשירה משופרת בהרבה לחלבון היעד הרצוי1,2,3,4, אשר בתורו יכול לשמש כגשושיות תאיות של אינטראקציות חלבון-חלבון.
בכל מקום הוא מפל של פעילויות אנזימטיות (E1 הפעלת אנזים → E2 ההטיה אנזים → E3 ליגות) כי covalenting ubiquitin (Ub) כדי למקד אותם עבור השפלה או לתווך שינויים איתות התא. בנוסף, deubiquitinases לזרז את הסרת אוביקיטין חלבונים. לכן, בתאים, יש אלפי אינטראקציות חלבון תלויות Ub, שרובן המכריע מזהות משטח משותף עם זיקה נמוכה אך ספציפיות גבוהה כדי לאפשר אינטראקציות חלשות דרך משטחים גדולים ומגוונים.
ארנסט ואח ' הציג מוטציות לתוך אזורים מחייבים ידועים של Ub על מנת לראות אם הם יכולים לשפר את הזיקה מחייבת עבור חלבון של עניין תוך שמירה על סלקטיביות גבוהה5. פותחה ספרייה קומבינטורית של יותר מ-10 מיליארד (7.5 x 1010) גרסאות Ub (UbVs) עם מוטציות בעמדות על פני השטח של Ub המתווכות את האינטראקציות הידועות של חלבון Ub. ספרייה זו כללה פאגמידים המבטאים את חלבון מעיל ה-M13 pIII הותוך ל-UbVs מגוונים. לכן, UbVs בודדים ניתן להציג על משטח phage באמצעות חלבון המעיל על הביטוי. במהלך תהליך הבחירה, פאג' המציג UbVs עם אינטראקציות מחייבות ניכרות עם חלבון היעד יישמר ויועשר בסבבים הבאים של תצוגת פאג', בעוד ש-UbVs המציגים UbVs שנקשרים בצורה גרועה לחלבון היעד נשטפים ומוסרים ממאגר הפאג'. חלקיקי הפאג' השמורים מכילים את הפאגמיד המתאים ל-UbV המוצג שלהם, ומאפשרים להם להיות רצפים ומאופיין עוד יותר לאחר בידודם.
באמצעות אסטרטגיה זו הנדסת חלבונים, מעכבי UbV פותחו עבור deubiquitinases אנושי5 ופרוטאזים ויראליים6. חשוב לציין, יצרנו UbVs מעכב עבור 3 רצועות E3 משפחתי HECT אנושי באמצעות חטיפת אתר כריכת E2 והפעלת UbVs שתופסים אקסוסיט מחייב Ub בתחום HECT7. אנחנו יכולים גם לעכב E3s מונומרי RING-המשפחה על ידי מיקוד אתר כריכת E2 ולעורר דימרציה UbV להפעיל הומודימרי RING E3s8. עבור RING E3s מרובת תת-יחידות, UbVs יכולים להשיג עיכוב על-ידי מיקוד של subunit RING (לדוגמה, עבור קומפלקס APC/C9) או שיבוש היווצרות מורכבת (לדוגמה, עבור SCF E3s10). באופן קולקטיבי, ניתן למנף UbVs כדי לחקור באופן שיטתי אינטראקציות חלבון-חלבון במערכת Ub-proteasome (UPS) כדי שנוכל לפענח טוב יותר מנגנונים ביוכימיים של אנזימי UPS ולזהות ולאמת אתרים פונקציונליים להתערבות טיפולית.
הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להשתמש בספריית UbV שהוצגה בעבר כדי למקד חלבון מעניין וכיצד להעשיר את קלסרי UbV שמתקשרים עם חלבון היעד באמצעות סיבובים רצופים של תצוגת פאג '.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

אוביקיטין הוא חלבון קטן 8.6 kDa המהווה מרכיב הליבה של מערכת ubiquitin-proteasome. כתוצאה מכך, זה יכול להיקשר למגוון רחב של חלבונים עם ספציפיות גבוהה אבל זיקה נמוכה. באמצעות תצוגת פאג', ניתן להנדס גרסאות אוביקוויטין (UbVs) כך שהן מציגות זיקה משופרת לכלוביקוויטין של סוג בר ושומרות על ייחודיות מחייבת לחלבונים ממוקדים. תצוגת Phage משתמשת בספריית phagemid, לפיה חלבון מעיל pIII של בקטריופאג M13 חוטי (נבחר מכיוון שהוא מוצג חיצונית על פני הפאג ') מותך עם UbVs. שאריות ספציפיות של אוביקוויטין wildtype אנושי הם רכים ואקראיים (כלומר, יש הטיה כלפי רצף wildtype מקומי) כדי ליצור UbVs, כך שינויים מזיקים קונפורמציה חלבון נמנעים תוך הצגת המגוון הדרוש לקידום אינטראקציות חדשניות עם חלבון היעד. במהלך תהליך תצוגת הפאג', UbVs אלה באים לידי ביטוי ומוצגים על חלבוני מעיל פאג' ומוצמדים לחלבון בעל עניין. UbVs המציגים אינטראקציות מחייבות חיוביות עם חלבון היעד נשמרים, ואילו קלסרים עניים נשטפים ומוסרים ממאגר הספרייה. ה-UbVs השמורים, המחוברים לחלקיק הפאג' המכיל את הפאגמיד המקביל של ה-UbV, הם מנוטרלים, מוגברים ומרוכזים, כך שניתן יהיה להצמיד אותם לחלבון היעד בסבב נוסף של תצוגת פאג'. בדרך כלל, עד חמישה סיבובים של תצוגת פאג', שבמהלכם מופעל לחץ בחירה חזק על UbVs שנקשרים בצורה חלשה ו/או מופקרת, כך שאלו עם זיקה גבוהה יותר מרוכזים ומועשרים. בסופו של דבר, UbVs המדגימים ספציפיות גבוהה יותר ו/או זיקה לחלבון היעד מאשר עמיתיהם בסוג הבר מבודדים וניתן לאפייןם באמצעות ניסויים נוספים.

קלסרים המיוצרים מתצוגת פאג' ניתנים לאימות וניתוח בדרכים רבות. מומלץ תחילה להמשיך ברצף הפאג' בפריימרים המאגפים את התוספת המגוונת בספריית הפאגמיד. ניסוי אידיאלי בתצוגת פאג' יציג הטיה ברורה כלפי מספר רצפים (איור 1). רצפים אחרים יהיו גם נוכחים אך עם ספירה נמוכה יותר, המופיעים יו...

Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ' כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.

שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

תצוגת פאג ' לא רק מסייעת לנו לחקור את המאפיינים המחייבים של אנזימים חשובים מבחינה קלינית, אלא גם לפתח אפננים לאותם אנזימים ולמחלות המתאימות. תצוגת Phage יכולה לשמש לפיתוח קלסרים חדשניים עבור מגוון רחב של חלבוני יעד והיא גם קלה יותר לביצוע מאשר שיטות תצוגה קונבנציונליות אחרות. הליך זה כלל הרבה פעולה חוזרת ונשנית, ולכן המפתח הוא לא טייס אוטומטי ולהישאר ממוקד לאורך כל הדרך.התחל על ידי חנק 30 מיליליטר של ציר טטרציקלין 2YT עם 200 microliters של תרבות הזרעים. לדגור אותו במשך כשלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולי עד החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן. יש להשליך את תמסת הציפוי מהצלחת לכיור.יבש אותו בעדינות עם מגבות נייר. לאחר מכן להוסיף 200 microliters של חוצץ PB לכל באר מצופה. יש להשליך את חיץ ה-PB מהצלחת ולייבש אותו על מגבות נייר.מוסיפים עוד 200 מיקרוליטרים של חוצץ PB לכל באר מצופה של הצלחת. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי. להפשיר את ספריית הפאג' על הקרח, ואז לדלל אותה לפי 100 מהמגוון בספרייה ב-PBS.מוסיפים את תמיסת הנתרן כלורי פוליאתילן גליקול בחמישית מנפח הספרייה המדוללת ודגרים את הפתרון על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 11, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant צנטריפוגה אותו עוד שתי דקות כדי למשוך את supernatant הנותרים ולרכז את גלולה פאג '.בעדינות resuspened את גלולה פאג במיליליטר אחד של חוצץ PBT לכל חלבון היעד להיות מנותח, בדרך כלל ארבעה בסך הכל. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ספריית פאג' לכל באר מצופה בלוח הבקרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.יש להשליך את חיץ ה-PB מצלחת היעד לכיור ולייבש את הצלחת על מגבות נייר. מעבירים את כל 100 המיקרו-לייטרים של ספריית הפאג' בלוח הבקרה לכל באר מצופה של לוחית המטרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.לאחר מכן, להסיר את ספריית פאג מהצלחת ולשטוף את הבארות מצופות ארבע פעמים עם חוצץ PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את טיפות החיץ האחרונות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית טוחנת 0.1 לכל באר מצופה כדי לחמוק מהפיג'.לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם 300 סל"ד רעד מסלולי. לאחר מכן, לנטרל את ה- pH על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטרים של pH 11 טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת לכל באר מצופה. מעבירים את הפאג' הנבה מכל שמונה בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר.פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך פתרונות הומוגניים ושאיפה כל נוזל מן בארות. הוסף 10% BSA ל phage eluted כדי להפוך את הריכוז הסופי 1%לאחסן את צינור microcentrifuge בארבע מעלות צלזיוס. זהו הפלט העגול הראשון.הכן תרבות זרעים לפולחן קלט הפאג ' לסיבוב הבחירה הבא על ידי חנק חמישה מיליליטרים של תרבות זרעי טטרציקלין 2YT עם מושבת E.coli מבודדת מצלחת אגר. לדגור אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. לדלל את חלבון היעד בסיבובים שניים ושלוש צינור עם כמות מתאימה של PBS.יש ליטול מחצית מתכולת הסיבובים 2 ו-3 צינור ומצפה ארבע בארות לכל חלבון יעד בלוח כריכה של 96 בארות לסיבוב הבא. לאחר מכן, השתמש בחצי מהפלט העגול כדי לחסן שלושה מיליליטרים של תאי פאזה באמצע יומן הרישום. לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם 200 סל"ד רעד מסלולית.הוסף M13KO7 עוזר פאג לריכוז סופי של 10 מיליארד PFU למיליליטר. לדגור אותו שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עם 200 סל"ד רעד מסלולי. לאחר שעה, להעביר את כל שלושת מיליליטר של תרבות ל 30 מיליליטר של פתרון 2YT carbenicillin kanamycin.לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. התוצאות הייצוגיות לבחירה בגרסה בכל מקום מול UBE4B מוצגות כאן. UBVs הוזמנו מהתדירות הגבוהה ביותר לנמוכים ביותר.רצפים מייצגים את אזור היוביקוויטין המגוון ב- UBV עם כל השאריות האקראיות. הזיקה המחייבת היחסית של הקלסרים לחלבון היעד של סוג הבר, חלבון היעד שעבר מוטציה, כמו גם חלבונים מחוץ למטרה נמדדת על ידי חיסון הקשור לאנזים או ELISA. כל ספיגות ELISA היו מנורמלות מול 96 ציוני BSA ELISA בממוצע ו 96 ציונים ממוצעים GST ELISA.ירוק כהה יותר מייצג את הכריכה היחסית החזקה יותר. GST נכלל כפקד עבור כריכה לא מינית מכיוון שחלבון היעד מתויג GST. תוצאות ELISA מוצגות כאן באופן גרפי.ציר ה- x מייצג את ה- UBVs וציר ה- y מייצג את הספיגה המנורמלת המתאימה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב כי אתה לא להשליך את הפתרון בצלחת לאחר הוספת חומצה הידרוכלורית. הפאג'ים מושעים כעת בפתרון וברצונך לשמור אותם כך שתוכלו לבצע ניתוחים אחרונים של העשרה או שניהם.לאחר הליך זה, יש לבצע רצף כדי לקבוע תדרי UBV. ELISAs ובבדיקות IC50 ניתן לעשות כדי לקבוע יעילות מחייבת ויעילות מעכבות בהתאמה וגם כדי לעזור לקבוע אילו UBVs לאפיין עוד יותר.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...