Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
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ユビキチン変異体技術は、博士サクデフ・シドゥ(トロント大学)の研究室で考案されました。WZは現在、人間とマイクロバイオームプログラムのCIFARアズリエリグローバルスカラーです。この研究は、WZ(RGPIN-2019-05721)に授与されたNSERCディスカバリー助成金によって資金提供されました。

1. 試薬の準備
<ol><li>PBS(リン酸緩衝塩水):450 mLの超純粋H2Oと10x PBS溶液の50 mLを混合し、4°Cまたは室温(〜20〜25°C)で濾過し、保存して滅菌します。</li>
	<li>10%BSA(ウシ血清アルブミン):BSAの1gを7mLの超純粋なH2Oにゆっくりと加え、完全に溶解するまで混ぜます(塊なし)。最終容積が10 mLになるまで超純粋なH2Oで上に上がって下ろします。ろ過により滅菌し、4°Cで保存します?...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

ステップ2.1(タンパク質調製物)で述べたように、タンパク質濃度を評価するために様々な方法を使用することができ、ファージディスプレイに使用される特定の標的タンパク質に基づいて、それぞれがユニークな利点と欠点を有するであろう。一般的なメソッドの詳細な説明とプロトコルのソースは、以前に提供されています 11.
前のラウンドのファー?...

タンパク質とタンパク質相互作用の分子的詳細を理解することは、生物学的プロセスのシグナル伝達機構、特に臨床的に重要な疾患に寄与するシグナル伝達機構を解き出す上で重要です。近年、ファージディスプレイは、目的の標的タンパク質1,2,3,4に対する結合力が大幅に改善されたタンパク質/ペプチドを単離する実用的かつアクセス可能な方法として利用されており、タンパク質とタンパク質相互作用の細胞内プローブとして使用することができます。
ユビキチン化は酵素活性(E1活性化酵素→E2共役酵素→E3リガース)のカスケードであり、タンパク質基質にユビキチン(Ub)を共有結合して分解または細胞シグナル伝達の変化を仲介する。さらに、デュビキチナーゼはタンパク質からのユビキチンの除去を触媒する。したがって、細胞には何千ものUb依存性タンパク質相互作用があり、その大半は親和性は低いが特異性が高い共通の表面を認識し、大きく多様な表面を介して弱い相互作用を可能にする。
Ernstらは、高い選択性を維持しながら、関心のあるタンパク質に対する結合親和性を高めることができるかどうかを確認するために、Ubの既知の結合領域に突然変異を導入した。100億個以上(7.5 x 1010)Ub変異体(UbV)の組み合わせライブラリで、既知のUbタンパク質相互作用を媒介するUb表面全体の位置に変異が生まれました。このライブラリーは、M13バクテリオファージpIIIコートタンパク質を多様なUbVに融合させたフェゲミドで構成されていました。したがって、個々のUbVは、発現時にコートタンパク質を介してファージ表面に表示することができる。選択プロセス中に、標的タンパク質とのかなりの結合相互作用を有するUbVを表示するファージは、ファージディスプレイの後のラウンドで保持され、濃縮され、一方、標的タンパク質に不十分に結合するUbVを表示するファージは洗い流され、ファージプールから除去される。保持されたファージ粒子は、表示されたUbVに対応するファージミドを含み、それらを配列し、一度単離した後にさらに特徴付けることを可能にする。
このタンパク質工学戦略を用いて、UbV阻害剤はヒトデュビキチン酵素5およびウイルスプロテアーゼ6のために開発された。重要なことに、我々は、E2結合部位をハイジャックし、HECTドメイン7上のUb結合エキソサイトを占有するUbVを活性化することによって、ヒトHECTファミリーE3リガス用の阻害UbVを生成した。また、E2結合部位を標的とすることにより単量体リングファミリーE3を阻害し、均一体性RING E3s8を活性化するためにUbV二量体化を誘導することができる。マルチサブユニットリングE3の場合、UbvはRINGサブユニット(例えば、APC / C complex9)を標的にするか、または複合体形成を妨害することによって阻害を達成することができます(例えば、SCF E3s10の場合)。UbVを活用して、Ub-プロテアソーム系(UPS)におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を体系的に問い合わせて、UPS酵素の生化学的メカニズムをよりよく解読し、治療介入のための機能的部位を同定および検証することができます。
以下のプロトコルは、以前に生成されたファージ表示UbVライブラリを使用して目的のタンパク質を標的とする方法と、ファージディスプレイの連続したラウンドを介して標的タンパク質と相互作用するUbVバインダーを濃縮する方法を説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

ユビキチンは、ユビキチンプロテアソーム系のコア成分である小さな8.6 kDaタンパク質です。その結果、高い特異性を持つが、親和性が低いタンパク質の多様な配列に結合することができます。ファージディスプレイを通じて、ユビキチン変異体(UbV)は、野生型ユビキチンに対する親和性が向上し、標的タンパク質に対する結合特異性を維持するように設計することができる。ファージディスプレイはファージミドライブラリーを利用し、それにより、糸状M13バクテリオファージ(ファージ表面に外部に表示されるために選択される)のpIIIコートタンパク質がUbVと融合する。ヒト野生型ユビキチンの特定の残基は、標的タンパク質との新規相互作用を促進するために必要な多様性を導入しながら、タンパク質の構造の有害な変化を回避するようにUbVを生成するために軟らかくランダム化される(すなわち、天然の野生型配列に偏りがある)。ファージ表示プロセス中に、これらのUbVはファージコートタンパク質上に発現および表示され、目的のタンパク質に対してパンされます。標的タンパク質との良好な結合相互作用を示すUbVは保持され、一方、不良な結合剤は洗い流され、ライブラリプールから除去される。UbVの対応するファージミドを含むファージ粒子に取り付けられた保持されたUbVは、別のファージディスプレイで同じ標的タンパク質に対してパンできるように溶出し、増幅し、濃縮されます。通常、ファージディスプレイの最大5ラウンドが実行され、その間に弱くおよび/または無差別に結合するUbVに対して強い選択圧力が課され、親和性の高い人が濃縮され、濃縮されます。最終的には、野生型よりも標的タンパク質に対する特異性および/または親和性を示すUbVは単離され、さらなる実験を通じて特徴付けることができます。

ファージディスプレイから製造されたバインダーは、多くの方法で検証および分析することができます。ファージミドライブラリー内の多様なインサートに隣接するプライマーでファージをシーケンシングする方法を最初に進めることが推奨されます。理想的なファージディスプレイ実験は、いくつかの配列に対する明確なバイアスを示す(図1)。他のシーケンスも存在?...

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Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。

ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

ファージディスプレイは、臨床的に重要な酵素の結合特性を調べるだけでなく、それらの酵素および対応する疾患のモジュレーターを開発するのに役立ちます。ファージディスプレイは、幅広い標的タンパク質の新規結合剤を開発するために使用することができ、また他の従来の表示方法よりも容易に実行できます。この手順には多くの繰り返しアクションが含まれるため、重要なのは自動操縦ではなく、全体に集中し続ける方法です。種子培養の200マイクロリットルで2YTテトラサイクリンスープの30ミリリットルを接種することから始めます。細菌が中対数相になるまで200 RPM軌道揺れで37°Cで約3時間インキュベートします。プレートからシンクにコーティング溶液を捨てます。ペーパータオルでやさしく乾かします。その後、各コーティングウェルにPBバッファーの200マイクロリットルを追加します。PBバッファーをプレートから捨て、ペーパータオルで乾かします。プレートのコーティングウェルに別の200マイクロリットルのPBバッファーを追加します。300 RPM軌道揺れで室温で1時間インキュベートします。氷の上でファージライブラリを解凍し、PBSでライブラリの多様性を100倍に希釈します。ポリエチレングリコール塩化ナトリウム溶液を希釈したライブラリの体積の5分の1に加え、氷上で30分間インキュベートします。次に、摂氏4度で30分間Gの11,000倍の溶液を遠心分離する。上清を捨て、さらに2分間遠心分離機を捨てて残りの上清を引き下げ、ファージペレットを濃縮します。分析される標的タンパク質当たりPBTバッファーの1ミリリットルでファージペレットを穏やかに再懸濁し、通常は合計で4個。コントロールプレートでよくコーティングされた各ファージライブラリに100マイクロリットルのファージライブラリを追加します。300 RPM軌道揺れで室温で1時間インキュベートします。PBバッファーをターゲットプレートからシンクに捨て、ペーパータオルでプレートを乾かします。制御プレート内のファージライブラリーの全100マイクロリットルを、対象プレートの各被覆ウェルに移します。300 RPM軌道揺れで室温で1時間インキュベートします。次に、ファージライブラリをプレートから取り出し、コーティングしたウェルをPTバッファーで4回洗浄します。プレートを反転し、ペーパータオルをタップして、バッファーの最後の滴を取り除きます。100マイクロリットルの0.1モル塩酸をコーティングした各々に加えてファージを溶かします。300 RPM軌道揺れでプレートを室温で5分間インキュベートします。その後、12.5マイクロリットルのpH11モルトリス塩酸塩をそれぞれ十分にコーティングしてpHを中和します。溶出したファージを8つの井戸すべてから1つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。ピペットは、溶液を均質にし、井戸からすべての液体を吸引するために、転送中に上下します。溶出したファージに10%BSAを加え、最終的な濃度を1%摂氏4度でマイクロ遠心分離管に保存します。これはラウンド1出力です。寒天プレートから単離された大腸菌コロニーを用いて2YTテトラサイクリン種子培養の5ミリリットルを接種することにより、次の選択の段階のためのファージ入力を培養するための種子培養を準備します。200 RPM軌道揺れで摂氏37度で一晩インキュベートします。適切な量のPBSで2本と3本のチューブを丸めて標的タンパク質を希釈します。ラウンド2と3チューブの内容の半分を取り、次のラウンドのために96ウェル結合プレートでターゲットタンパク質ごとに4つの井戸をコーティングします。次に、ラウンド1出力の半分を使用して、3ミリリットルの中ログ位相細胞を接種します。200 RPM軌道揺れで30分間摂氏37度でインキュベートします。M13KO7ヘルパーファージをミリリットル当たり100億PFUの最終濃度に加えます。200 RPM軌道揺れで摂氏37度で再び1時間インキュベートします。1時間後、培養3ミリリットル全体を2YTカルベニシリンカナマイシン溶液の30ミリリットルに移す。200 RPM軌道揺れで摂氏37度で一晩成長します。UBE4Bに対するユビキチンバリアント選択の代表結果を以下に示します。VPVは最も高い周波数から最低の周波数に注文されました。配列は、すべてのランダム化残基を有するUBVの多様なユビキチン領域を表す。結合剤の結合親和性を野生型標的タンパク質に対して、変異標的タンパク質、ならびにオフターゲットタンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISAによって測定される。すべてのELISA吸光度を96の平均BSA ELISAスコアおよび96の平均GST ELISAスコアに対して正規化した。濃い緑色は、強い相対結合を表します。GSTは、標的タンパク質がGSTタグ付けされているため、非特異的結合のコントロールとして含まれていた。ELISA の結果は、ここでグラフィカルに表示されます。X 軸は VV を表し、y 軸は対応する正規化された吸光度を表します。この手順を試みる場合は、塩酸を添加した後にプレートに溶液を捨てないでください。ファージは溶液中で中断され、後続の濃縮最終分析またはその両方を実行できるように、これらを維持したいと考えています。この手順に従って、UBV周波数を決定するためにシーケンスを実行する必要があります。ELISAおよびIC50アッセイは、それぞれ結合性有効性および阻害効果を決定し、さらに特徴付けるVPVを決定するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

インビトロとプランタにおけるRING型E3ユビキチンリガーゼの機能特性評価

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...