Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
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유비퀴틴 변종 기술은 닥터 Sachdev Sidhu (토론토 대학)의 실험실에서 고안되었습니다. WZ는 현재 인간 및 미생물군유전체 프로그램의 CIFAR 아즈리엘리 글로벌 학자입니다. 이 연구는 WZ (RGPIN-2019-05721)에 수여 NSERC 디스커버리 보조금에 의해 투자되었다.

1. 시약 준비
<ol><li>PBS (인산염 완충식식염수): 10x PBS 용액 50mL을 450mL초퓨어 H2O로 혼합하여 여과하여 살균하고 4°C 또는 실온(~20-25°C)에 보관하십시오.</li>
	<li>10% BSA (소 혈청 알부민): 천천히 초퓨어 H2O의 7 mL에 BSA의 1 g을 추가하고 완전히 용해 될 때까지 혼합 (덩어리 없음). 최종 부피가 10mL가 될 때까지 초순수 H2O로 위로 올려보아 보입니다. 여과에 의해 살균하고 4 °C에 ?...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

2.1 단계 (단백질 제제)에서 언급했듯이, 다양한 방법으로 단백질 농도를 평가할 수 있으며, 각 방법은 파지 디스플레이에 사용되는 특정 표적 단백질에 기초하여 독특한 이점과 단점을 가질 것이다. 인기 있는 메서드에 대 한 자세한 설명 및 프로토콜의 소스는 이전에 제공 되었습니다11.
후속 라운드에 대한 입력으로 파지 디스플레이의 이전 라운드에 의해 ?...

단백질-단백질 상호 작용의 분자 세부 사항을 이해하는 것은 생물학적 과정의 신호 변환 메커니즘, 특히 임상적으로 중요한 질병에 기여하는 신호를 파기하는 데 중요합니다. 최근 몇 년 동안 파지 디스플레이는 단백질/펩티드를 원하는 표적 단백질에 훨씬 개선된 결합으로 분리하는 실용적이고 접근 가능한 방법으로 활용되어 왔으며, 이는 단백질 단백질 상호작용의 세포내 프로브로서 사용될 수 있다.
유비퀴티닝은 유비퀴틴(Ub)을 단백질 기판에 곱하게 결합하여 분해또는 세포 신호 변화를 중재하는 효소 활동(E1 활성화 효소 → E2 컨쥬게이팅 효소 → E3 리게아제)의 폭포입니다. 또한, deubiquitinases 단백질에서 유비퀴틴의 제거를 촉매. 따라서, 세포에서는, Ub 의존적인 단백질 단백질 상호 작용의 수천이 있습니다, 대다수는 크고 다양한 표면을 통해 약한 상호 작용을 허용하는 낮은 친화성 그러나 높은 특이성을 가진 일반적인 표면을 인식합니다.
Ernst et al.은 여전히 높은 선택성을 유지하면서 관심있는 단백질에 대한 결합 친화성을 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 Ub의 알려진 결합 영역으로 돌연변이를 도입했습니다5. 알려진 Ub-protein 상호 작용을 중재하는 Ub 표면의 위치에서 돌연변이가 있는 100억 개 이상의 (7.5 x 1010) Ub 변이체(UbV)의 결합 라이브러리가 개발되었습니다. 이 라이브러리는 다양한 UbV에 융합된 M13 박테리오파지 pIII 코트 단백질을 표현하는 파지미드로 구성되었습니다. 따라서, 개별 UbV는 발현 시 코트 단백질을 통해 파지 표면에 표시될 수 있다. 선택 과정에서, 대상 단백질과 상당한 결합 상호 작용을 가진 UbV를 표시하는 파지는 파지 디스플레이의 후속 라운드에서 유지되고 풍부하게 되는 반면, 대상 단백질에 제대로 결합되지 않는 UbV를 표시하는 파지는 파지 풀에서 세척되고 제거됩니다. 유지된 파지 입자는 표시된 UbV에 해당하는 파지미드를 함유하고 있어 한 번 격리된 후 시퀀싱되고 더 많은 특징을 가할 수 있습니다.
이 단백질 엔지니어링 전략을 사용하여, UbV 억제제는 인간 deubiquitinases5 및 바이러스 성 proteases6를 위해 개발되었습니다. 중요한 것은, 우리는 E2 결합 사이트를 납치하고 HECT 도메인7에 Ub 결합 외사이트를 차지하는 UbV를 활성화하여 인간 HECT 가족 E3 리그효소에 대한 억제 UbV를 생성했습니다7. 또한 E2 결합 부위를 대상으로 단황 링 패밀리 E3s를 억제하고 UbV 이압을 유도하여 동종 형 링 E3s8을 활성화할 수 있습니다. 다중 서브유닛 링 E3의 경우, UbV는 링 하위 유닛(예: APC/C 복합체9)을 타겟팅하거나 복잡한 형성(예: SCF E3s10)을 방해하여 억제를 달성할 수 있다. UbV는 UB-proteasome 시스템(UPS)에서 단백질-단백질 상호 작용을 체계적으로 심문하여 UPS 효소의 생화학 적 메커니즘을 더 잘 해독하고 치료 개입을 위한 기능적 부위를 식별하고 검증할 수 있도록 활용할 수 있습니다.
다음 프로토콜은 이전에 생성된 파지를 사용하여 관심 있는 단백질을 타겟팅하는 방법과 연속적인 파지 디스플레이를 통해 대상 단백질과 상호 작용하는 UbV 바인더를 풍부하게 하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

유비퀴틴은 유비퀴틴-프로테솜 시스템의 핵심 성분인 작은 8.6 kDa 단백질이다. 따라서, 그것은 높은 특이성 그러나 낮은 친화력을 가진 단백질의 다양한 배열에 결합할 수 있습니다. 파지 디스플레이를 통해 유비퀴틴 변이체(UbV)는 야생형 유비퀴틴에 비해 친화성을 개선하고 표적 단백질에 대한 결합 특이성을 유지하도록 설계할 수 있다. 파지 디스플레이는 파지미드 라이브러리를 활용하여 필라멘트 M13 박테리오파지의 pIII 코트 단백질(파지 표면에 외부적으로 표시되기 때문에 선택)이 UbV와 융합됩니다. 인간 야생형 유비퀴틴의 특정 잔류물은 부드럽고 무작위화되어(즉, 네이티브 야생형 서열에 대한 편견이 있음) UbV를 생성하여 단백질 형성의 해로운 변화를 피하도록 하는 동시에 표적 단백질과의 새로운 상호 작용을 촉진하는 데 필요한 다양성을 도입한다. 파지 표시 과정에서 이러한 UbV는 파지 코트 단백질에 표현되고 표시되며 관심있는 단백질에 대해 패닝됩니다. 대상 단백질과 유리한 결합 상호 작용을 나타내는 UbV는 유지되지만 가난한 바인더는 세척되어 라이브러리 풀에서 제거됩니다. UbV의 해당 파지미드를 포함하는 파지 입자에 부착된 유지 된 UbV는 다른 파지 디스플레이에서 동일한 표적 단백질에 대해 패닝 될 수 있도록 용출, 증폭 및 농축됩니다. 일반적으로 최대 5라운드의 파지 디스플레이가 수행되며, 이 동안 약하게 결합되는 UbV에 대해 강력한 선택 압력이 부과되어 선호도가 높은 파지 디스플레이가 집중되고 풍부해집니다. 궁극적으로, 그들의 야생형 대조제 보다는 표적 단백질에 대한 더 높은 특이성 및/또는 친화성을 입증하는 UbV는 격리되고 추가 실험을 통해 특징화될 수 있다.

파지 디스플레이에서 생성된 바인더는 여러 가지 방법으로 검증 및 분석할 수 있습니다. 파지미드 라이브러리의 다양한 인서트 측면에 있는 프라이머로 파지를 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 이상적인 파지 디스플레이 실험은 여러 시퀀스에 대한 명확한 편향을 표시합니다(그림 1). 다른 시퀀스도 존재하지만 수가 낮을수록 배경 소음으로 더 많이 나타납니다. 제공된 예에서는...

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Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

파지 디스플레이는 임상적으로 중요한 효소의 결합 특성을 조사하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 이러한 효소및 해당 질병에 대한 변조기를 개발하는 데 도움이됩니다. 파지 디스플레이는 다양한 표적 단백질을 위한 새로운 바인더를 개발하는 데 사용될 수 있으며 다른 기존의 디스플레이 방법보다 더 쉽게 수행할 수 있다. 이 절차는 반복적인 행동을 많이 포함, 그래서 열쇠는 자동 조종하지 않고 전체에 초점을 유지하는 것입니다.종자 문화의 200 마이크로 리터와 함께 2YT 테트라 사이클린 국물의 30 밀리리터를 접종하여 시작합니다. 박테리아가 중간 로그 단계에 될 때까지 200 RPM 궤도 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 약 3 시간 동안 배양하십시오. 플레이트에서 도장 용액을 싱크대에 버리십시오.종이 타월로 부드럽게 말리십시오. 그런 다음 코팅된 각 버퍼에 200마이크로리터의 PB 버퍼를 추가합니다. 접시에서 PB 버퍼를 버리고 종이 타월에 말리십시오.플레이트의 각 코팅 된 웰에 PB 버퍼의 또 다른 200 마이크로 리터를 추가합니다. 300 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 실온에서 배양하십시오. 파지 라이브러리를 얼음 위에 해동한 다음 PBS의 라이브러리 다양성을 100배로 희석시킵니다.폴리에틸렌 글리콜 나트륨 염화나트륨 용액을 희석된 라이브러리 볼륨의 5분의 1에 넣고 30분 동안 얼음에 용액을 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30분 동안 11, 000배 G의 원심분리합니다. 상체를 버리고 원심분리기를 2분 더 남기고 남은 상체를 끌어내리고 파지 펠릿을 농축합니다.분석할 대상 단백질당 PBT 버퍼의 1밀리리터에서 파지 펠릿을 부드럽게 재중단하여 분석할 수 있으며, 전형적으로 총 4개. 컨트롤 플레이트에 잘 코팅된 각 파지 라이브러리에 100 마이크로리터를 추가합니다. 300 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 실온에서 배양하십시오.대상 플레이트에서 PB 버퍼를 싱크대에 넣고 종이 타월에 접시를 말리십시오. 제어판에 파지 라이브러리의 100마이크로리터를 모두 대상 플레이트의 각 코팅된 웰로 옮기. 300 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 실온에서 배양하십시오.다음으로, 플레이트에서 파지 라이브러리를 제거하고 PT 버퍼로 코팅 된 우물을 네 번 세척합니다. 접시를 반전하고 버퍼의 마지막 방울을 제거하기 위해 종이 타월을 누릅니다. 파지를 잘 코팅한 각 에 0.1 개의 어금니 염산 100 마이크로 리터를 추가합니다.300 RPM 궤도 흔들림으로 5분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 그 후, pH 11의 12.5 마이크로리터를 코팅한 각 에 1개의 어금니 트리스 염산염을 첨가하여 pH를 중화한다. 8개의 우물에서 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 용출된 파지를 전달합니다.파이펫은 전송 하는 동안 위아래로 파이펫 용액 균질 하 게 하 고 우물에서 모든 액체를 흡인. 10%BSA를 발출된 파지에 추가하여 최종 농도를 1%까지 섭씨 4도에 마이크로센트심분리기 튜브를 저장합니다. 이것은 라운드 1 출력입니다.한천 판에서 분리된 E.coli 콜로니와 함께 2YT 테트라사이클린 종자 배양 5마리를 접종하여 다음 선발을 위한 파지 입력을 배양하기 위한 종자 문화를 준비한다. 200 RPM 궤도 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 적당한 양의 PBS로 2라운드와 3개의 튜브에서 표적 단백질을 희석시 희석시다.다음 라운드를 위한 96웰 결합 플레이트에서 2라운드와 3회 튜브 및 4개의 우물을 96웰 레스트 플레이트에 넣습니다. 다음으로, 라운드 1 출력의 절반을 사용하여 미드 로그 상 셀의 3밀리리터를 접종합니다. 200 RPM 궤도 흔들림으로 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.밀리리터당 100억 PFU의 최종 농도에 M13KO7 도우미 파지를 추가합니다. 200 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 섭씨 37도에서 다시 배양하십시오. 한 시간 후, 문화의 전체 3 밀리리터를 2YT 카베니실린 카나마이신 용액의 30 밀리리터로 옮기.200 RPM 궤도 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 성장합니다. UBE4B에 대한 유비퀴틴 변형 선택에 대한 대표적인 결과는 여기에 표시됩니다. UBV는 가장 높은 주파수에서 가장 낮은 주파수로 주문되었습니다.시퀀스는 모든 무작위 잔류물이 있는 UBV의 다양한 유비퀴틴 영역을 나타냅니다. 바인더의 상대적 결합 친화성은 야생형 표적 단백질, 돌연변이 표적 단백질, 뿐만 아니라 오프타겟 단백질은 효소-연결된 면역흡혈구 분석기 또는 ELISA에 의해 측정된다. 모든 ELISA 흡수는 평균 96개의 BSA ELISA 점수와 96개의 평균 GST ELISA 점수에 대해 정규화되었습니다.녹색이 더 어둡게 표시되는 것은 더 강한 상대 바인딩을 나타냅니다. GST는 표적 단백질이 GST 태그되기 때문에 비특이적 결합을 위한 대조군으로 포함되었다. ELISA 결과는 여기에 그래픽으로 표시됩니다.x축은 UBV를 나타내고 y축은 해당 정규화된 흡광도를 나타냅니다. 이 절차를 시도할 때 염산을 추가한 후 플레이트에 용액을 버리지 않는 것이 중요합니다. 이제 파지 솔루션에서 일시 중단되고 후속 농축 최종 분석 또는 둘 다 수행할 수 있도록 이러한 작업을 유지하려고 합니다.이 절차에 따라 UBV 주파수를 결정하기 위해 시퀀싱을 수행해야 합니다. ELISA 및 IC50 에세이는 각각 결합 효능및 억제 효능을 결정하고 더 특징을 가지는 UBV를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...