Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Технология убиквитинового варианта была разработана в лаборатории доктора Сачдева Сидху (Университет Торонто). WZ в настоящее время является глобальным ученым CIFAR Azrieli в программе «Люди и микробиом». Это исследование финансировалось грантами NSERC Discovery, присужденными WZ (RGPIN-2019-05721).

1. Подготовка реагентов
<ol><li>PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор): Смешайте 50 мл 10-кратного раствора PBS с 450 мл сверхчистого H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).</li>
	<li>10% BSA (бычий сывороточный альбумин): Медленно добавляйте 1 г BSA к 7...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

Как упоминалось на этапе 2.1 (получение белка), для оценки концентрации белка могут быть использованы различные методы, и каждый из них будет иметь уникальные преимущества и недостатки, основанные на конкретном целевом белке, используемом для отображения фагов. Источник подробных описа?...

Понимание молекулярных деталей белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для определения механизмов сигнальной трансдукции биологических процессов, особенно тех, которые способствуют клинически важным заболеваниям. В последние годы фаговой дисплей использовался в качестве практичного и доступного метода выделения белков/пептидов с значительно улучшенным связыванием с желаемым целевым белком1,2,3,4, который, в свою очередь, может быть использован в качестве внутриклеточных зондов белково-белковых взаимодействий.
Убиквитинирование представляет собой каскад ферментативной активности (активирующий фермент E1 → конъюгирующий фермент E2 → лигазы E3), которые ковалентно конъюгируют убиквитин (Ub) с белковыми субстратами, чтобы нацелить их на деградацию или опосредовать изменения клеточной сигнализации. Кроме того, деубиквитиназы катализируют удаление убиквитина из белков. Таким образом, в клетках существуют тысячи Ub-зависимых белково-белковых взаимодействий, подавляющее большинство из которых распознают общую поверхность с низким сродством, но высокой специфичностью, чтобы обеспечить слабые взаимодействия через большие и разнообразные поверхности.
Ernst et al. ввели мутации в известные области связывания Ub, чтобы увидеть, могут ли они повысить сродство связывания с интересующим белком, сохраняя при этом высокую селективность5. Была разработана комбинаторная библиотека из более чем 10 миллиардов (7,5 x 1010) вариантов Ub (UbV) с мутациями в положениях по всей поверхности Ub, которые опосредуют известные взаимодействия Ub-белка. Эта библиотека состояла из фагемидов, которые экспрессируют белок оболочки бактериофага PIII M13, слитый с диверсифицированными UbV. Таким образом, отдельные UbV могут отображаться на поверхности фага через белок оболочки при экспрессии. Во время процесса селекции фаг, который отображает UbV со значительными связывающими взаимодействиями с целевым белком, будет сохранен и обогащен в последующих раундах отображения фагов, тогда как фаг, отображающий UbV, которые плохо связываются с целевым белком, смывается и удаляется из фагового пула. Сохраненные фаговые частицы содержат фагемид, соответствующий их отображаемому UbV, что позволяет секвенировать их и дополнительно характеризовать после выделения.
Используя эту стратегию белковой инженерии, ингибиторы UbV были разработаны для человеческих деубиквитиназ5 и вирусных протеаз6. Важно отметить, что мы создали ингибирующие UbV для человеческих лигазов E3 семейства HECT путем захвата сайта связывания E2 и активации UbV, которые занимают Ub-связывающий экзозит на домене HECT7. Мы также можем ингибировать мономерные RING-семейства E3s, нацеливаясь на сайт связывания E2 и индуцируя димеризацию UbV для активации гомодимерного RING E3s8. Для многосубъединичных RING E3s UbV могут достигать ингибирования путем нацеливания на субъединицу RING (например, для комплекса APC/C9) или нарушения образования комплекса (например, для SCF E3s10). В совокупности UbV могут быть использованы для систематического опроса белково-белковых взаимодействий в системе Ub-протеасом (UPS), чтобы мы могли лучше расшифровать биохимические механизмы ферментов UPS, а также идентифицировать и проверить функциональные сайты для терапевтического вмешательства.
Следующий протокол описывает, как использовать ранее сгенерированную фаговую отображаемую библиотеку UbV для нацеливания на интересующий белок и как обогатить связующие вещества UbV, которые взаимодействуют с целевым белком посредством последовательных раундов отображения фагов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

Убиквитин представляет собой небольшой белок 8,6 кДа, который является основным компонентом системы убиквитин-протеасома. Следовательно, он может связываться с разнообразным массивом белков с высокой специфичностью, но низкой аффинностью. С помощью фагового дисплея варианты убиквитина (UbV) могут быть спроектированы таким образом, что они демонстрируют улучшенное сродство к убиквитину дикого типа и сохраняют специфичность связывания с целевыми белками. Фаговый дисплей использует библиотеку фагемидов, в соответствии с которой белок оболочки pIII нитевидного бактериофага M13 (выбранный потому, что он отображается снаружи на поверхности фага) сливается с UbVs. Специфические остатки убиквитина дикого типа человека мягкие и рандомизированные (т.е. существует уклон в сторону нативной последовательности диких типов) для генерации UbV, чтобы избежать вредных изменений в конформации белка при одновременном введении разнообразия, необходимого для содействия новым взаимодействиям с целевым белком. Во время процесса отображения фагов эти UbV экспрессируются и отображаются на белках фаговой оболочки и сравниваются с интересующим белком. UbV, которые демонстрируют благоприятные связывающие взаимодействия с целевым белком, сохраняются, в то время как плохие связующие смываются и удаляются из библиотечного пула. Сохраненные UbV, которые присоединены к фаговой частице, содержащей соответствующий фагемид UbV, элюируют, усиливают и концентрируют таким образом, чтобы их можно было панорамировать против того же целевого белка в другом раунде фагового дисплея. Как правило, выполняется до пяти раундов отображения фагов, во время которых сильное давление отбора накладывается на UbV, которые связываются слабо и / или беспорядочно, так что те, у кого более высокое сродство, концентрируются и обогащаются. В конечном счете, UbV, которые демонстрируют более высокую специфичность и /или сродство к целевому белку, чем их аналоги дикого типа, выделяются и могут быть охарактеризованы с помощью дальнейших экспериментов.

Связующие вещества, полученные из фагового дисплея, могут быть проверены и проанализированы различными способами. Рекомендуется сначала приступить к секвенированию фага с помощью праймеров, которые обрамляют диверсифицированную вставку в библиотеке фагемид. Идеальный эксперимент с...

Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Убиквитинация является критической посттрансляционной модификацией белка, дисрегуляция которой была вовлечена в многочисленные заболевания человека. Этот протокол подробно описывает, как фаговый дисплей может быть использован для выделения новых вариантов убиквитина, которые могут связывать и модулировать активность лигазов E3, которые контролируют специфичность, эффективность и паттерны убиквитинирования.

Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Фаговый дисплей не только помогает нам исследовать характеристики связывания клинически важных ферментов, но и разрабатывать модуляторы для этих ферментов и соответствующих заболеваний. Фаговый дисплей может быть использован для разработки новых связующих для широкого спектра белков-мишеней, а также его легче выполнить, чем другие обычные методы отображения. Эта процедура включала в себя много повторяющихся действий, поэтому ключ заключается в том, чтобы не автопилотировать и оставаться сосредоточенным во всем.Начните с инокуляции 30 миллилитров тетрациклинового бульона 2YT с 200 микролитрами семенной культуры. Инкубируйте его в течение примерно трех часов при температуре 37 градусов по Цельсию с орбитальным встряхиванием 200 оборотов в минуту, пока бактерии не окажутся в середине фазы. Выбросьте раствор покрытия с пластины в раковину.Аккуратно высушите его бумажными полотенцами. Затем добавьте 200 микролитров буфера ПБ к каждому хорошо покрытому. Выбросьте буфер ПБ с тарелки и высушите его на бумажных полотенцах.Добавьте еще 200 микролитров буфера ПБ к каждому покрытому колодцу пластины. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием 300 об/мин. Разморозьте библиотеку фагов на льду, а затем разбавьте ее в 100 раз больше библиотечного разнообразия в PBS.Добавьте раствор полиэтиленгликоля натрия хлорида на одну пятую часть разбавленного объема библиотеки и инкубируйте раствор на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируют раствор в 11 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант и центрифугируйте его еще на две минуты, чтобы вытащить оставшийся супернатант и сконцентрировать гранулу фага.Осторожно повторно суспендируйте гранулу фага в одном миллилитре буфера ПБТ на целевой белок, подлежащий анализу, обычно в общей сложности четыре. Добавьте 100 микролитров библиотеки фагов к каждому покрытому колодцу в контрольной пластине. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.Выбросьте буфер ПБ с целевой пластины в раковину и высушите пластину на бумажных полотенцах. Переложите все 100 микролитров фаговой библиотеки в контрольной пластине на каждый покрытый колодец целевой пластины. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.Затем извлеките библиотеку фагов из тарелки и четыре раза вымойте покрытые лунки с помощью буфера PT. Переверните тарелку и нажмите на бумажное полотенце, чтобы удалить последние капли буфера. Добавьте 100 микролитров 0,1 молярной соляной кислоты к каждому хорошо покрытому, чтобы элюировать фаг.Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение пяти минут с орбитальным встряхиванием 300 об/мин. После этого нейтрализуют рН, добавляя 12,5 микролитра рН 11 одного молярного триса гидрохлорида к каждому хорошо покрытому. Перенесите элюированный фаг из всех восьми лунок в одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 миллилитра.Пипетка вверх и вниз во время переноса, чтобы сделать растворы однородными и аспирировать всю жидкость из скважин. Добавьте 10% BSA к элюированному фагу, чтобы сделать конечную концентрацию 1% Храните трубку микроцентрифуги при четырех градусах Цельсия. Это круглый выход.Подготовьте семенную культуру для культивирования фагового ввода для следующего раунда селекции путем инокуляции пяти миллилитров культуры семян тетрациклина 2YT изолированной колонией E.coli из агаровой пластины. Высиживайте его ночью при 37 градусах Цельсия с орбитальным сотрясением орбиты 200 об/мин. Развести целевой белок в двух и трех раундах пробирки с соответствующим количеством PBS.Возьмите половину содержимого двух и трех раундов и покройте четыре лунки на целевой белок в 96-луночной связующей пластине для следующего раунда. Затем используйте половину круглого выхода, чтобы привить три миллилитра среднелогарифмических фазовых ячеек. Высиживайте его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.Добавьте фаг-хелпер M13KO7 к конечной концентрации 10 миллиардов ПФЕ на миллилитр. Высиживайте его снова при 37 градусах Цельсия в течение часа с орбитальным встряхиванием 200 об/мин. Через час переложить все три миллилитра культуры на 30 миллилитров раствора канамицина 2YT.Расти ночью при 37 градусах Цельсия с орбитальным сотрясением 200 оборотов в минуту. Репрезентативные результаты выбора варианта убиквитина против UBE4B показаны здесь. UBV были заказаны от самой высокой до самой низкой частоты.Последовательности представляют собой диверсифицированную область убиквитина в UBV со всеми рандомизированными остатками. Относительное сродство связующих веществ к белку-мишени дикого типа, мутированному белку-мишени, а также нецелевым белкам измеряют с помощью иммуноферментных анализов или ИФА. Все поглощения ИФА были нормализованы по сравнению с 96 средними баллами BSA ELISA и 96 средними баллами GST ELISA.Более темный зеленый цвет представляет собой более сильную относительную привязку. GST был включен в качестве контроля для неспецифического связывания, потому что целевой белок помечен GST. Результаты ИФА графически представлены здесь.Ось X представляет UBV, а ось Y представляет соответствующую нормализованную поглощенность. При попытке этой процедуры важно, чтобы вы не выбрасывали раствор в пластину после добавления соляной кислоты. Фаги теперь суспендированы в растворе, и вы хотите сохранить их, чтобы вы могли выполнить последующие окончательные анализы обогащения или и то, и другое.Следуя этой процедуре, следует выполнить секвенирование для определения частот UBV. Анализы ИФА и IC50 могут быть проведены для определения эффективности связывания и ингибирующей эффективности соответственно, а также для определения того, какие УБВ следует дополнительно охарактеризовать.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Метод альтернативной культуры для поддержания геномной Hypomethylation мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием MEK ингибитор PD0325901 и витамином С

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Функциональная характеристика РИНГ-типа E3 Ubiquitin Ligases in Vitro и В Планте

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...