Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
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La tecnología de variante de ubiquitina fue ideada en el laboratorio del Dr. Sachdev Sidhu (Universidad de Toronto). WZ es actualmente un CIFAR Azrieli Global Scholar en el Programa de Humanos y Microbioma. Esta investigación fue financiada por NSERC Discovery Grants otorgada a WZ (RGPIN-2019-05721).

1. Preparación de reactivos
<ol><li>PBS (solución salina tamponada con fosfato): Mezcle 50 ml de 10 x solución de PBS con 450 ml de H2O ultrapuro. Esterilice por filtración y almacene a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C).</li>
	<li>BSA al 10% (albúmina sérica bovina): Agregue lentamente 1 g de BSA a 7 ml de H2O ultrapuro y mezcle hasta que se disuelva por completo (sin grumos). Recarga con H2O ultrapuro hasta que el volumen final sea de 10 mL. Esterilizar por filtración y ...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

Como se mencionó en el paso 2.1 (preparación de proteínas), se puede utilizar una variedad de métodos para evaluar la concentración de proteínas, y cada uno tendrá beneficios e inconvenientes únicos basados en la proteína objetivo específica utilizada para la visualización de fagos. Anteriormente se ha proporcionado una fuente de descripciones y protocolos detallados para métodos populares11.
El uso del fago retenido por una ronda anterior de visualización ...

Comprender los detalles moleculares de las interacciones proteína-proteína es fundamental para delinear los mecanismos de transducción de señales de los procesos biológicos, particularmente aquellos que contribuyen a enfermedades clínicamente importantes. En los últimos años, la visualización de fagos se ha utilizado como un método práctico y accesible para aislar proteínas / péptidos con una unión mucho mejor a una proteína objetivo deseada1,2,3,4, que a su vez se puede utilizar como sondas intracelulares de interacciones proteína-proteína.
La ubiquitinación es una cascada de actividades enzimáticas (enzima activadora de E1 → enzima conjugante E2 → ligasas E3) que conjugan covalentemente ubiquitina (Ub) con sustratos de proteínas para dirigirse a ellos para su degradación o para mediar cambios en la señalización celular. Además, las deubiquitinasas catalizan la eliminación de la ubiquitina de las proteínas. Por lo tanto, en las células, hay miles de interacciones proteína-proteína dependientes de Ub, la gran mayoría de las cuales reconocen una superficie común con baja afinidad pero alta especificidad para permitir interacciones débiles a través de superficies grandes y diversas.
Ernst et al. introdujeron mutaciones en regiones de unión conocidas de Ub para ver si podían mejorar la afinidad de unión por una proteína de interés sin dejar de mantener una alta selectividad5. Se desarrolló una biblioteca combinatoria de más de 10 mil millones (7,5 x 1010) variantes de Ub (UbV) con mutaciones en posiciones a través de la superficie de Ub que median las interacciones conocidas entre la proteína Ub. Esta biblioteca consistía en fagémidas que expresan la proteína de la capa de bacteriófagos M13 pIII fusionada a UbV diversificados. Por lo tanto, los UbV individuales se pueden mostrar en la superficie del fago a través de la proteína de la capa al momento de la expresión. Durante el proceso de selección, los fagos que muestran UbV con interacciones de unión considerables con la proteína objetivo se conservarán y enriquecerán en rondas posteriores de visualización de fagos, mientras que los fagos que muestran UbV que se unen mal a la proteína objetivo se eliminan y eliminan del grupo de fagos. Las partículas de fagos retenidos contienen el fagamida correspondiente a su UbV mostrado, lo que les permite ser secuenciadas y caracterizadas una vez aisladas.
Utilizando esta estrategia de ingeniería de proteínas, se desarrollaron inhibidores de UbV para deubiquitinasas humanas5 y proteasas virales6. Es importante destacar que hemos generado UbV inhibitorios para ligasas E3 de la familia HECT humanas a través del secuestro del sitio de unión a E2 y la activación de UbVs que ocupan un exosito de unión a Ub en el dominio HECT7. También podemos inhibir los E3 monoméricos de la familia RING dirigiéndonos al sitio de unión E2 e inducir la dimerización de UbV para activar el ANILLO homodimérico E3s8. Para los RING E3 de subunidades múltiples, los UbV pueden lograr la inhibición dirigiéndose a la subunidad RING (por ejemplo, para el complejo APC/C9) o interrumpiendo la formación de complejos (por ejemplo, para SCF E3s10). Colectivamente, los UbV se pueden aprovechar para interrogar sistemáticamente las interacciones proteína-proteína en el sistema Ub-proteasoma (UPS) para que podamos descifrar mejor los mecanismos bioquímicos de las enzimas UPS e identificar y validar sitios funcionales para la intervención terapéutica.
El siguiente protocolo describe cómo emplear una biblioteca de UbV mostrada de fagos previamente generada para apuntar a una proteína de interés y cómo enriquecer los aglutinantes de UbV que interactúan con la proteína objetivo a través de rondas sucesivas de visualización de fagos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

La ubiquitina es una pequeña proteína de 8,6 kDa que es un componente central del sistema ubiquitina-proteasoma. En consecuencia, puede unirse a una amplia gama de proteínas con alta especificidad pero baja afinidad. A través de la visualización de fagos, las variantes de ubiquitina (UbV) pueden diseñarse de tal manera que exhiban una afinidad mejorada sobre la ubiquitina de tipo salvaje y mantengan la especificidad de unión a las proteínas objetivo. La pantalla de fagos utiliza una biblioteca de fagomides, mediante la cual la proteína de la capa pIII de un bacteriófago filamentoso M13 (elegido porque se muestra externamente en la superficie del fago) se fusiona con UbV. Los residuos específicos de ubiquitina de tipo silvestre humano son blandos y aleatorizados (es decir, existe un sesgo hacia la secuencia de tipo silvestre nativo) para generar UbV de modo que se eviten cambios perjudiciales en la conformación de proteínas al tiempo que se introduce la diversidad necesaria para promover nuevas interacciones con la proteína objetivo. Durante el proceso de visualización de fagos, estos UbV se expresan y muestran en las proteínas de la capa de fagos y se comparan con una proteína de interés. Los UbV que exhiben interacciones de unión favorables con la proteína objetivo se conservan, mientras que los aglutinantes pobres se eliminan y se eliminan del grupo de la biblioteca. Los UbV retenidos, que están unidos a la partícula de fago que contiene la fagomida correspondiente del UbV, se eluyen, amplifican y concentran para que puedan ser analizados contra la misma proteína objetivo en otra ronda de visualización de fagos. Por lo general, se realizan hasta cinco rondas de visualización de fagos, durante las cuales se impone una fuerte presión de selección contra ubV que se unen débilmente y / o promiscuamente para que aquellos con afinidades más altas se concentren y enriquezcan. En última instancia, los UbV que demuestran una mayor especificidad y / o afinidad por la proteína objetivo que sus contrapartes de tipo salvaje se aíslan y se pueden caracterizar a través de experimentos adicionales.

Los aglutinantes producidos a partir de la pantalla de fagos se pueden verificar y analizar de muchas maneras. Se recomienda proceder primero a la secuenciación del fago con cebadores que flanqueen el inserto diversificado en la biblioteca de fagomides. Un experimento de visualización de fagos ideal mostrará un claro sesgo hacia varias secuencias (Figura 1). Otras secuencias también estarán presentes pero con un recuento más bajo, apareciendo más como ruido de fondo. En el ejemplo pro...

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Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

La visualización de fagos no solo nos ayuda a investigar las características de unión de enzimas clínicamente importantes, sino que también desarrolla moduladores para esas enzimas y las enfermedades correspondientes. La pantalla de fagos se puede utilizar para desarrollar nuevos aglutinantes para una amplia gama de proteínas objetivo y también es más fácil de realizar que otros métodos de visualización convencionales. Este procedimiento implicó una gran cantidad de acciones repetitivas, por lo que la clave es no piloto automático y permanecer enfocado en todo momento.Comience inoculando 30 mililitros de caldo de tetraciclina 2YT con 200 microlitros del cultivo de semillas. Incubarlo durante aproximadamente tres horas a 37 grados centígrados con agitación orbital de 200 RPM hasta que las bacterias estén en la fase de registro medio. Deseche la solución de recubrimiento de la placa en un fregadero.Sécalo suavemente con toallas de papel. Luego agregue 200 microlitros de tampón de PB a cada pozo recubierto. Deseche el tampón de PB del plato y séquelo en toallas de papel.Agregue otros 200 microlitros de tampón de PB a cada pozo recubierto de la placa. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM. Descongele la biblioteca de fagos en hielo, luego diluya a 100 veces la diversidad de la biblioteca en PBS.Agregue la solución de cloruro de sodio de polietilenglicol a una quinta parte del volumen de la biblioteca diluida e incube la solución en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugue la solución a 11, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y centrímelo durante otros dos minutos para tirar del sobrenadante restante y concentrar el gránulo de fago.Resusped suavemente el pellet de fago en un mililitro de tampón PBT por proteína objetivo a analizar, típicamente cuatro en total. Agregue 100 microlitros de biblioteca de fagos a cada pozo recubierto en la placa de control. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.Deseche el tampón de PB de la placa objetivo en el fregadero y séquelo en toallas de papel. Transfiera los 100 microlitros de la biblioteca de fagos en la placa de control a cada pozo recubierto de la placa objetivo. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.A continuación, retire la biblioteca de fagos de la placa y lave los pozos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y toque una toalla de papel para quitar las últimas gotas de tampón. Agregue 100 microlitros de ácido clorhídrico molar 0.1 a cada pozo recubierto para eludir el fago.Incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos con agitación orbital de 300 RPM. Después de eso, neutralice el pH agregando 12.5 microlitros de pH 11 un triclorhidrato molar a cada pozo recubierto. Transfiera el fago eluido de los ocho pocillos a un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Pipetear hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para hacer soluciones homogéneas y aspirar todo el líquido de los pozos. Agregue 10% BSA al fago eluido para hacer la concentración final 1% Almacene el tubo de la microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Esta es la salida redonda.Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección inoculando cinco mililitros de cultivo de semillas de tetraciclina 2YT con una colonia aislada de E. coli de una placa de agar. Incubarlo durante la noche a 37 grados centígrados con un temblor orbital de 200 RPM. Diluya la proteína objetivo en las rondas dos y tres tubos con una cantidad adecuada de PBS.Tome la mitad del contenido de las rondas dos y tres tubos y cubra cuatro pocillos por proteína objetivo en una placa de unión de 96 pocillos para la siguiente ronda. A continuación, use la mitad de la salida redonda para inocular tres mililitros de células de fase logarítmica media. Incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos con un temblor orbital de 200 RPM.Agregue el fago auxiliar M13KO7 a una concentración final de 10 mil millones de PFU por mililitro. Incubarlo de nuevo a 37 grados centígrados durante una hora con un temblor orbital de 200 RPM. Después de una hora, transfiera los tres mililitros completos de cultivo a 30 mililitros de solución de kanamicina de carbenicilina 2YT.Crece durante la noche a 37 grados centígrados con un temblor orbital de 200 RPM. Los resultados representativos para una selección de variantes de ubiquitina contra UBE4B se muestran aquí. Los UBV se ordenaron de mayor a menor frecuencia.Las secuencias representan la región diversificada de ubiquitina en el UBV con todos los residuos aleatorios. La afinidad de unión relativa de los aglutinantes a la proteína diana de tipo salvaje, la proteína diana mutada, así como las proteínas fuera del objetivo se mide mediante ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas o ELISA. Todas las absorbancias de ELISA se normalizaron contra 96 puntajes promedio de BSA ELISA y 96 puntajes promedio de GST ELISA.El verde más oscuro representa la unión relativa más fuerte. Gst se incluyó como un control para la unión inespecífica porque la proteína objetivo está marcada con GST. Los resultados de ELISA se presentan gráficamente aquí.El eje x representa las UBV y el eje y representa la absorbancia normalizada correspondiente. Al intentar este procedimiento, es importante que no deseche la solución en la placa después de agregar el ácido clorhídrico. Los fagos ahora están suspendidos en solución y desea conservarlos para que pueda realizar análisis finales de enriquecimiento posteriores o ambos.Después de este procedimiento, se debe realizar la secuenciación para determinar las frecuencias de UBV. Los ensayos ELISA e IC50 se pueden realizar para determinar las eficacias de unión y las eficacias inhibitorias, respectivamente, y también para ayudar a determinar qué UBV caracterizar más a fondo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Investigación

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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