Name: using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Ubiquitin varyant teknolojisi Dr. Sachdev Sidhu 'nun (Toronto Üniversitesi) laboratuvarında tasarlanmıştır. WZ şu anda İnsanlar ve Mikrobiyom Programı'nda CIFAR Azrieli Global Scholar'dır. Bu araştırma WZ'ye (RGPIN-2019-05721) verilen NSERC Discovery Grants tarafından finanse edildi.

1. Reaktif hazırlama
<ol><li>PBS (fosfat tamponlu salin): 50 mL 10x PBS çözeltiyi 450 mL ultra saf H2O ile karıştırın.</li>
	<li>%10 BSA (sığır serum albümini): 7 mL ultra saf H2O'ya yavaşça 1 g BSA ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın (küme yok). Son ses seviyesi 10 mL olana kadar ultra saf H2O ile yükleme yap. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>PB tamponu (%1 BSA ile desteklenmiş PBS): Yavaşça 400 mL ultra saf H2O'ya</s...

<ol>
	<li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+PDZbody,+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus.">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).</li><li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis.">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling.">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li><li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+(SUMO)-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation.">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li><li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system.">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants.">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes.">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li><li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants.">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li><li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC/C.">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li><li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface.">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li><li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis.">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li><li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries.">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li><li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+and+yeast+display.">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li><li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+phage+display:+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries.">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li><li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display.">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li><li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules.">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li><li>Gal&#225;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library-based+display+technologies:+where+do+we+stand.">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo.">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li><li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+display:+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions.">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li><li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures.">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li><li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIS+display:+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes.">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li><li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system.">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li><li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability/function+trade-offs+in+the+selection+process.">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10.">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li><li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15.">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li></ol>

Adım 2.1'de (protein hazırlama) belirtildiği gibi, protein konsantrasyonunu değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve her birinin faj görüntüleme için kullanılan belirli hedef proteine dayanarak benzersiz yararları ve dezavantajları olacaktır. Daha önce popüler yöntemler için ayrıntılı açıklamalar ve protokoller kaynağı sağlanmıştır11.
Sonraki bir tur için giriş olarak önceki bir faj ekranı tarafından tutulan fajı kull...

Protein-protein etkileşimlerinin moleküler ayrıntılarını anlamak, özellikle klinik olarak önemli hastalıklara katkıda bulunan biyolojik süreçlerin sinyal transdüksiyon mekanizmalarını suçlu bulmak için kritik öneme sahiptir. Son yıllarda, faj görüntüleme, protein-protein etkileşimlerinin hücre içi probları olarak kullanılabilen istenen bir hedef proteine çok daha iyi bağlanmış proteinleri / peptitleri izole etmek için pratik ve erişilebilir bir yöntem olarak kullanılmaktadır1,2,3,4.
Ubiquitination, ubiquitin'i (Ub) bozulma veya hücre sinyal değişikliklerine aracılık etmek için protein substratlarına kovalent olarak eşleyen enzimatik faaliyetlerin (E1 aktive enzim → E2 konjugating enzimi → E3 ligazyonları) bir çağlayanıdır. Ek olarak, deubiquitinases, ubiquitin'in proteinlerden uzaklaştırılmasını katalİze eder. Bu nedenle, hücrelerde, büyük çoğunluğu büyük ve çeşitli yüzeylerde zayıf etkileşimlere izin vermek için düşük benzeşimli ancak yüksek özgüllüğe sahip ortak bir yüzeyi tanıyan binlerce Ub bağımlı protein-protein etkileşimi vardır.
Ernst ve arkadaşları, Ub'in bilinen bağlayıcı bölgelerine mutasyonlar getirdi ve hala yüksek seçiciliği korurken ilgi çekici bir protein için bağlayıcı yakınlığı artırıp artıramayacağını görmek için5. Bilinen Ub-protein etkileşimlerine aracılık eden Ub yüzeyindeki pozisyonlarda mutasyonlara sahip 10 milyardan fazla (7,5 x 1010) Ub varyantından (UbV) oluşan bir kombinatoryal kütüphane geliştirildi. Bu kütüphane, çeşitlendirilmiş UbV'lere kaynaşmış M13 bakteriyofaj pIII kat proteinini ifade eden fajmidlerden oluşuyordu. Bu nedenle, bireysel UbV'ler ifade üzerine kat proteini aracılığıyla faj yüzeyinde görüntülenebilir. Seçim sürecinde, hedef proteinle önemli bağlayıcı etkileşimlere sahip UbV'leri görüntüleyen fajlar sonraki faj görüntüleme turlarında tutulacak ve zenginleştirilecek, hedef proteine zayıf bağlanan UbV'leri gösteren faj ise yıkanarak faj havuzundan çıkarılacaktır. Tutulan faj parçacıkları, görüntülenen UbV'lerine karşılık gelen fajmidi içerir ve izole edildikten sonra sıralanmalarını ve daha fazla karakterize olmalarını sağlar.
Bu protein mühendisliği stratejisi kullanılarak, UbV inhibitörleri insan deubiquitinases5 ve viral proteazes6 için geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, E2-bağlama sitesini ele geçirerek ve HECT etki alanında Ub bağlayıcı bir dış kaplamayı işgal eden UbV'leri etkinleştirerek insan HECT ailesi E3 bağları için inhibitör UbV'ler oluşturduk7. Ayrıca E2 bağlama bölgesini hedefleyerek monomerik RING ailesi E3'leri inhibe edebilir ve homodimerik RING E3s8'i etkinleştirmek için UbV dimerizasyonunu teşvik edebiliriz. Çok alt üne sahip RING E3'ler için, UbV'ler RING alt birimini (örneğin, APC/C kompleksi9 için) hedef alarak veya karmaşık oluşumu bozarak (örneğin, SCF E3s10 için) inhibisyon elde edebilir. Toplu olarak, UbV'ler, Ub-proteazom sistemindeki (UPS) protein-protein etkileşimlerini sistematik olarak sorgulamak için kullanılabilir, böylece UPS enzimlerinin biyokimyasal mekanizmalarını daha iyi deşifre edebilir ve terapötik müdahale için fonksiyonel bölgeleri belirleyebilir ve doğrulayabiliriz.
Aşağıdaki protokol, ilgi çekici bir proteini hedeflemek için daha önce oluşturulmuş bir faj görüntülenen UbV kütüphanesinin nasıl kullanılacağını ve ardışık faj görüntüleme turları aracılığıyla hedef proteinle etkileşime giren UbV bağlayıcılarının nasıl zenginleştirilerek zenginleştirilmeyi açıklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-198</td>
			<td>Culturing phage outputs after phage display.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C1389-5G</td>
			<td>Culturing phagemid-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-337</td>
			<td>Shaking plates during incubation with the phage library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>Sealing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-01-0</td>
			<td>Preparing plates for titering.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>DS-11 FX+</td>
			<td>Protein concentration measurement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7000133</td>
			<td>Storing phage glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Phage elution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C854003</td>
			<td>Bacterial strain for phage infection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td>Culturing M13K07 helper phage-infected cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7 Helper Phage</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&#160;N0315S</td>
			<td>Permit phagemid packing and secretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-076</td>
			<td>Bacterial cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>Immobilizing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Buffer component/phage resuspension medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Films for ELISA and Incubation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-120</td>
			<td>Covering the microplates during incubation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Phage precipitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-1D</td>
			<td>Culturing phage inputs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td>Culturing E. coli OmniMax cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1525</td>
			<td>Neutralizing eluted phage solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td>Buffer component.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td>Cell growth media component.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phage display to develop ubiquitin variant modulators for e3 ligases

Ubiquitin, ubiquitin-proteazom sisteminin temel bir bileşeni olan küçük bir 8.6 kDa proteinidir. Sonuç olarak, yüksek özgüllüğe ancak düşük benzeşime sahip çeşitli proteinler dizisine bağlanabilir. Faj ekranı sayesinde, ubiquitin varyantları (UbV'ler) wildtype ubiquitin üzerinde gelişmiş benzeşim gösterecek ve hedef proteinlere bağlayıcı özgüllüğü koruyacak şekilde geliştirilebilir. Faj ekranı, filamentli bir M13 bakteriyofajının pIII kat proteininin (faj yüzeyinde harici olarak görüntülendiği için seçilir) UbV'lerle kaynaştırıldığı bir fajmid kütüphanesi kullanır. İnsan wildtype ubiquitin'in spesifik kalıntıları yumuşak ve randomizedir (yani, yerel wildtype dizisine karşı bir önyargı vardır), böylece hedef proteinle yeni etkileşimleri teşvik etmek için gerekli çeşitliliği tanıtırken protein uyumundaki zararlı değişikliklerden kaçınılır. Faj görüntüleme işlemi sırasında, bu UbV'ler faj kat proteinleri üzerinde ifade edilir ve görüntülenir ve ilgi çekici bir proteine karşı tavalanır. Hedef proteinle olumlu bağlayıcı etkileşimler gösteren UBV'ler korunurken, zayıf bağlayıcılar yıkanır ve kütüphane havuzundan çıkarılır. UbV'nin karşılık gelen fajmidini içeren faj parçacığına bağlı tutulan UbV'ler, başka bir faj ekranında aynı hedef proteine karşı panned edilebilmeleri için eluted, amplified ve konsantre edilir. Tipik olarak, beş adede kadar faj ekranı gerçekleştirilir ve bu sırada zayıf ve/veya karışık bir şekilde bağlanan UBV'lere karşı güçlü bir seçim baskısı uygulanır, böylece daha yüksek yakınlıkları olanlar konsantre edilir ve zenginleştirilir. Sonuç olarak, hedef protein için wildtype meslektaşlarından daha yüksek özgüllük ve/veya benzeşim gösteren UbV'ler izole edilir ve daha fazla deneyle karakterize edilebilir.

Faj ekranından üretilen bağlayıcılar birçok şekilde doğrulanabilir ve analiz edilebilir. Öncelikle fajmid kütüphanesindeki çeşitlendirilmiş kesici ucun yanında bulunan astarlarla fajın dizilimine devam etmeniz önerilir. İdeal bir faj görüntüleme deneyi, çeşitli dizilere karşı net bir önyargı gösterecektir (Şekil 1). Diğer diziler de mevcut olacak, ancak daha düşük bir sayıyla, daha çok arka plan gürültüsü olarak görünecektir. Faj görüntüsünün ubi...

Watch this Scientific Journal Video about Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases at JoVE.com

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Faj görüntüleme sadece klinik olarak önemli enzimlerin bağlayıcı özelliklerini araştırmamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bu enzimler ve ilgili hastalıklar için modülatörler geliştirir. Faj ekranı, çok çeşitli hedef proteinler için yeni bağlayıcılar geliştirmek için kullanılabilir ve diğer geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre daha kolaydır. Bu prosedür çok fazla tekrarlayan eylem içeriyordu, bu nedenle anahtar otomatik pilot olmamak ve boyunca odaklanmak.Tohum kültürünün 200 mikrolitresi ile 30 mililitre 2YT tetrasiklin suyu aşılayarak başlayın. Bakteriler orta kütük evresinde olana kadar 200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede yaklaşık üç saat kuluçkaya yatırın. Kaplama solüsyonunun plakadan bir lavaboya atılması.Kağıt havlularla hafifçe kurulayın. Ardından, iyi kaplanmış her bir kuyuya 200 mikrolitre PB arabelleği ekleyin. PB tamponu tabaktan atın ve kağıt havlularda kurulayın.Plakanın her kaplamalı kuyusuna 200 mikrolitre pb tampon daha ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün, sonra PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katını seyreltin.Polietilen glikol sodyum klorür çözeltisini seyreltilmiş kütüphane hacminin beşte birine ekleyin ve çözeltiyi 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın. Daha sonra, çözeltiyi 11.000 kez G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve kalan süpernatantı aşağı çekmek ve faj peletini konsantre etmek için iki dakika daha santrifüjleyin.Faj peletini analiz edilecek hedef protein başına bir mililitre PBT tamponunda hafifçe yeniden diriltin, genellikle toplamda dört. Kontrol plakasındaki her bir iyi kaplanmış faj kütüphanesine 100 mikrolitre ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.PB tamponu hedef plakadan lavaboya atın ve plakayı kağıt havlularda kurulayın. Kontrol plakasındaki faj kütüphanesinin 100 mikrolitresinin tamamını hedef plakanın her kaplamalı kuyusuna aktarın. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.Ardından, faj kütüphanesini plakadan çıkarın ve kaplanmış kuyuları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Plakayı ters çevirin ve son tampon damlalarını çıkarmak için bir kağıt havluya dokunun. Fajı elute etmek için her bir kaplamalı kuyuya 100 mikrolitre 0,1 molar hidroklorik asit ekleyin.Plakayı oda sıcaklığında 300 RPM yörünge sarsıntısı ile beş dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her iyi kaplanmış kuyuya 12,5 mikrolitre pH 11 molar tris hidroklorür ekleyerek pH'ı nötralize edin. Elde edilen fajı sekiz kuyudan tek bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Çözeltileri homojen hale getirmek ve kuyulardan gelen tüm sıvıyı aspire etmek için aktarım sırasında pipet yukarı ve aşağı. Son konsantrasyonu yapmak için elde edilen fajlara%10 BSA ekleyin %1 Mikrosantrifüj tüpünü dört santigrat derecede saklayın. Bu birinci raunt çıktısı.Bir ağar plakasından izole edilmiş bir E.coli kolonisi ile beş mililitre 2YT tetrasiklin tohum kültürünü aşılayarak bir sonraki seçim turu için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatır. Hedef proteini uygun miktarda PBS ile iki ve üç tüplü turlarda seyreltin.İkinci ve üç tüplü mermilerin içeriğinin yarısını alın ve hedef protein başına dört kuyuyu bir sonraki tur için 96 kuyu bağlama plakasında kapla. Daha sonra, üç mililitre orta kütük faz hücresini aşılamak için yuvarlak bir çıkışın yarısını kullanın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır.Mililitre başına 10 milyar PFU'luk son konsantrasyona M13KO7 yardımcı faj ekleyin. 200 RPM yörünge sarsıntısı ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yatır. Bir saat sonra, kültürün üç mililitresinin tamamını 30 mililitre 2YT karbenisilin kanamycin çözeltisine aktarın.200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede bir gecede büyüyün. UBE4B'ye karşı her yerde bulunan varyant seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. UBV'ler en yüksek frekanstan en düşük frekansa sipariş edildi.Diziler, UBV'deki çeşitlendirilmiş ubiquitin bölgesini tüm randomize kalıntılarla temsil eder. Bağlayıcıların yabani tip hedef proteine, mutasyona uğramış hedef proteine ve hedef dışı proteinlere göreli bağlayıcılığı enzime bağlı immünorbent tahlilleri veya ELISA ile ölçülür. Tüm ELISA absorbansları 96 ortalama BSA ELISA puanına ve 96 ortalama GST ELISA puanına göre normalleştirildi.Koyu yeşil, daha güçlü bağıl bağlamayı temsil eder. Hedef protein GST etiketli olduğundan GST spesifik olmayan bağlama için bir kontrol olarak dahil edildi. ELISA sonuçları grafiksel olarak burada sunulmaktadır.x ekseni UBV'leri, y ekseni ise karşılık gelen normalleştirilmiş absorbansı temsil eder. Bu prosedürü denerken, hidroklorik asidi ekledikten sonra çözeltiyi plakaya atmamanız önemlidir. Fajlar artık çözelti içinde askıya alınmıştır ve bunları saklamak istersiniz, böylece sonraki zenginleştirme son analizlerini veya her ikisini de gerçekleştirebilirsiniz.Bu işlemi takiben UBV frekanslarını belirlemek için sıralama yapılmalıdır. ELISAs ve IC50 tahlilleri sırasıyla bağlayıcı etkileri ve inhibitör etkileri belirlemek ve ayrıca hangi UBV'lerin daha fazla karakterize edileceğini belirlemeye yardımcı olmak için yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...