Name: tail vein transection bleeding model in fully anesthetized hemophilia a mice
Uploaded: 2021-09-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice at JoVE.com

Esther Bloem og Thomas Nygaard er anerkendt for støtte med målinger af FVIII i plasma. Bo Alsted er anerkendt for at tegne og bearbejde skabelonen og skæreblokkene.

Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er godkendt af Dyrevelfærdsorganet hos Novo Nordisk A/S og Dyreforsøgstilsynet, Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri. Den optimerede 40 minutters metode inkluderer anæstesi og doseringstid i designet (figur 1). Hæmofile mus af begge køn mellem 10-16 uger er nødvendige for denne procedure.
1. Forberedelser før undersøgelsen
<ol><li>Forbered doseringsopløsningerne i de korrekte koncentrationer...

Denne optimerede metode til halevenetranssektion (TVT) har flere fordele sammenlignet med TVT-overlevelsesmetoden. Dyrene bedøves fuldt ud i hele forsøgsperioden, hvilket gør musehåndtering lettere og øger dyrenes trivsel. I modsætning til TVT-overlevelsesmodellen er der ikke behov for observation natten over, og denne optimerede model giver mulighed for at måle blodtab og observere den nøjagtige blødningstid over 40 minutter. Også længere perioder med blødning hos bevidste dyr kan forårsage død ved ekssang...

Dyremodeller er afgørende for at forstå patogenesen af hæmofili og udvikle og teste behandlingsregimer og terapier. Faktor VIII knock-out mus (F8-KO) er en meget anvendt model til undersøgelse af hæmofili A 1,2. Disse mus rekapitulerer nøglefunktioner i sygdommen og er blevet brugt i vid udstrækning til udvikling af behandlinger, såsom rekombinante FVIII-produkter 3,4,5 og genterapistrategier 6,7.
Der er forskellige blødningsskademodeller til evaluering af de farmakologiske virkninger af forskellige hæmostatiske forbindelser in vivo. En af disse koagulationsmodeller er overlevelsesmodellen for halevenetranssektion hos mus 8,9,10,11,12,13,14, der måler hæmofile mus evne til at overleve ekssanguination efter haletranssektion. Denne metode blev introduceret for mere end fire årtier siden15 og bruges stadig 9,16,17. Modellen bruger dog overlevelse som endepunkt og kræver observation af dyrene over en periode på op til 24 timer, hvor dyrene er ved bevidsthed og dermed kan opleve smerte og angst.
Blødningsmodeller af kortere varighed og under fuld bedøvelse er tidligere beskrevet, såsom haleclipsmodellen (også kendt som halespidsen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Ikke desto mindre kræver disse modeller doser af prokoagulerende forbindelser (f.eks. FVIII) langt højere end dem, der administreres klinisk29 for en fuldstændig normalisering af blodtab efter blødningsudfordringen. En anden skadesmodel under anæstesi, vena saphena blødningsmetoden, er følsom over for lavere doser af prokoagulerende forbindelser30, men kræver et højt niveau af eksperimentatorintervention, da blodpropperne skal forstyrres ofte (i modsætning til 3 gange i den præsenterede model).
Standardisering i retning af en fælles protokol til test af nye prokoagulerende forbindelser ville i høj grad lette datasammenligningen mellem laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller er der endnu ikke en fælles aftale om studerede endepunkter (blodtab 7,26, blødningstid 9,34 og overlevelsesrate35,36), og eksperimentel længde varierer mellem undersøgelse13.
Vores primære mål er at beskrive og karakterisere en optimeret model med høj reproducerbarhed, muligheden for at studere on-demand samt en profylaktisk behandling, følsomhed over for farmakologisk intervention svarende til overlevelsesmodellen, men ikke ved at bruge død eller nærdød som endepunkter. For at mindske smerte og angst bør dyrene ikke være bevidste under blødning, og der skal gennemføres et mere etisk endepunkt37.
Haleclipsmodeller udføres generelt i en af to varianter, enten amputering af halespidsen, f.eks. amputation af 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller i en mere alvorlig variant transekteret med en halediameter omkring 1-3 mm 8,22,25 . Dette medfører en kombineret arteriovenøs blødning, da laterale og dorsale vener og ventral arterie normalt afskæres, og generelt jo større amputationen er, desto lavere er følsomheden over for en prokoagulerende forbindelse. Da halespidsen er amputeret, udsættes den arteriovenøse skade desuden uden noget modsat væv; således er det i det mindste i teorien forskelligt fra de mest almindelige hæmofile blødninger.
Som navnet antyder, er det kun venen, der er skadet i halevenetranssektionsmodeller som beskrevet i dette papir, hvilket resulterer i en udelukkende venøs blødning. Da karret ikke er helt afskåret, forventes skaden at være mindre end i amputationsmodellerne, og vævet omkring snittet, som en blodprop kan klæbe til, bevares. Derudover er der lavere blodtryk i venen i modsætning til arterien. Disse faktorer bidrager til en øget følsomhed i forhold til amputationsmodeller, således at normalisering af blødning kan opnås med klinisk relevante doser substitutionsterapi, fx med rFVIII i hæmofili A, hvilket er nyttigt til evaluering af størrelsen og holdbarheden af virkningerne af prokoagulerende behandling 26,38,39.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One, Austria</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needles connected to 300 &#181;L precision (insulin) syringes for dosing</td>
			<td>BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe</td>
			<td>320830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advate</td>
			<td>Takeda, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pads 70% ethanol</td>
			<td>Hartmann, Soft-Zellin</td>
			<td>999 979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting template (Stainless steel)</td>
			<td>Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocytes (RBC) lysing solution</td>
			<td>Lysebio, ABX Diagnostics</td>
			<td>906012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematological analyser</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>CT-2000iv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp on stand</td>
			<td>Phillips</td>
			<td>IR250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad with thermostat</td>
			<td>CMA</td>
			<td>model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent</td>
			<td>HemoCue, Denmark</td>
			<td>HemoCue calibrator, 707037</td>
			<td>Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box</td>
			<td>Sigma Delta Dameca</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifier with lights</td>
			<td>Eschenbach</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring template (Aluminum)</td>
			<td>Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes + tips</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Molecular Devices Corporation, CA, USA</td>
			<td>SpectraMax 340 photometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Software</td>
			<td>GraphPad, San Diego, CA, USA</td>
			<td>Version 9.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline 0.9% NaCl</td>
			<td>Fresenius Kabi, Sweden</td>
			<td>883264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special tail marker block for TVT tail cut</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum liquid suction</td>
			<td>Vacusafe comfort, IBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath and thermostat</td>
			<td>TYP 3/8 Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tail vein transection bleeding model in fully anesthetized hemophilia a mice

Haleblødningsmodeller er vigtige værktøjer i hæmofiliforskning, specifikt til vurdering af prokoagulerende virkninger. Overlevelsesmodellen for halevenetranssektion (TVT) er blevet foretrukket i mange indstillinger på grund af følsomhed over for klinisk relevante doser af FVIII, mens andre etablerede modeller, såsom haleclipsmodellen, kræver højere niveauer af prokoagulerende forbindelser. For at undgå at bruge overlevelse som endepunkt udviklede vi en TVT-model, der etablerede blodtab og blødningstid som endepunkter og fuld bedøvelse under hele eksperimentet. Kort fortalt placeres bedøvede mus med halen nedsænket i tempereret saltvand (37 ° C) og doseres med testforbindelsen i højre laterale halevene. Efter 5 min krydses den venstre laterale halevene ved hjælp af en skabelonguide, halen returneres til saltvandet, og alle blødningsepisoder overvåges og registreres i 40 minutter, mens blodet opsamles. Hvis der ikke opstår blødning 10 min, 20 min eller 30 min efter skaden, udfordres blodproppen forsigtigt ved at tørre snittet to gange med en våd gazepind. Efter 40 minutter kvantificeres blodtab ved mængden af hæmoglobin, der blødte ind i saltvandet. Denne hurtige og relativt enkle procedure resulterer i ensartede og reproducerbare blødninger. Sammenlignet med TVT-overlevelsesmodellen bruger den en mere human procedure uden at gå på kompromis med følsomheden over for farmakologisk intervention. Desuden er det muligt at bruge begge køn, hvilket reducerer det samlede antal dyr, der skal opdrættes, i overensstemmelse med principperne i 3R'er. En potentiel begrænsning i blødningsmodeller er den stokastiske karakter af hæmostase, som kan reducere reproducerbarheden af modellen. For at imødegå dette sikrer manuel blodpropforstyrrelse, at blodproppen udfordres under overvågning, hvilket forhindrer primær (blodplade) hæmostase i at stoppe blødningen. Denne tilføjelse til kataloget over blødningsskademodeller giver mulighed for at karakterisere prokoagulerende virkninger på en standardiseret og human måde.

For at vurdere anvendeligheden af den optimerede model blev der udført en undersøgelse i F8-KO (C57BL genetisk baggrund) mus administreret med en kommercielt tilgængelig rekombinant faktor VIII substitutionsterapi (rFVIII); fire forskellige doser blev testet: 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg. Desuden testede vi den tilsvarende køretøjs (negative) kontrol i F8-KO-mus og vildtype (WT) gruppe ved hjælp af C57BL-mus som en positiv kontrolgruppe for at vurdere responsområdet i modellen.
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice at JoVE.com

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

Den raffinerede halevenetranssektion (TVT) blødningsmodel i bedøvede mus er en følsom in vivo-metode til vurdering af hæmofil blødning. Denne optimerede TVT-blødningsmodel bruger blodtab og blødningstid som endepunkter, forfiner andre modeller og undgår død som et endepunkt.

Hale vene transsektion blødning model i fuldt bedøvet hæmofili A mus

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

Haleblødningsmodeller kan være vigtige værktøjer til at vurdere farmakologiske virkninger af hæmostatiske forbindelser in vivo for at sikre reproducerbarhed mellem eksperimenter. Sammenlignet med andre følsomme blødningsmodeller bruger vores model blodtab og blødningstid som endepunkter i stedet for overlevelse. Modellen udføres også under anæstesi, hvilket reducerer smerte og nød for dyrene.Denne teknik er især nyttig til præklinisk undersøgelse af hæmofili og andre koagulationsforstyrrelser, da den måler blodets evne til at størkne og stoppe en blødning efter en skade. Vi har brugt denne model i vid udstrækning og testet prokoagulerende forbindelser i vores arbejde med at udvikle nye hæmofiliterapier ved hjælp af hæmofili A-mus. Imidlertid kan andre hæmofile musestammer eller mus, hvor hæmofili induceres med et antifaktor VIII-antistof, også anvendes.Sarah og Dennis, som er ekspertteknikere i mit laboratorium, demonstrerer eksperimentet. Efter bedøving af musen skal du placere den på en varmeplade og sikre, at næsen er i næsekeglen. Påfør en passende øjensalve for at forhindre tørhed under anæstesi.Marker halen med en diameter på 2,5 millimeter ved hjælp af halemærkeblokken, pas på ikke at tvinge halen ind i spalten og sørg for, at den sidder tæt. Placer derefter halen i saltvandsrøret i mindst fem minutter for at sikre en varm halevene, der er optimal til intravenøs dosering. Om nødvendigt kan IV-dosering udføres efter fem minutter.Placer derefter et plastikdæksel over musen for at reducere varmetabet. Lad halerne være nedsænket i fem minutter efter dosering af testopløsning, og udfør derefter halevenetranssektion ved at placere halen i skæreblokken og dreje den 90 grader for at udsætte venen. Lav snittet på den modsatte side, hvorfra testopløsningen blev doseret.Træk skalpelbladet nummer 11 gennem skæreblokkens spalte, der holder halen, for at skabe blødning. Returner derefter straks halen til saltvandet og nulstil stopuret. Blødning skal være synlig med det samme.Nedsænkning af halen i saltvand er vigtig for konsekvent blødning, da den hurtigt ville stoppe i fri luft. Overhold blødningen og anmærk blødningens start og stop gennem 40 minutter på blodgennemstrømningsnotationspapiret. Diskvalificere og udskift musen, hvis primær blødning ikke stopper inden for tre minutter efter snittet er lavet, hvilket kan indikere, at snittet er for dybt, eller at musen mangler primær hæmostase.Udfordre haleskæringen, hvis der ikke er blødning, 10, 20 og 30 minutter efter skaden. Brug en gasbind, der er gennemblødt og varm saltvand, løft halen ud af saltvandet og tør den blødt, men fast to gange med det våde gasbind i distal retning over haleskæringen. Sæt straks halen tilbage i saltvandsrøret efter hver udfordring.Når forsøget er færdigt, skal du fjerne halen fra saltvand, indsamle blodprøver, hvis det ønskes, og aflive musene, mens de stadig er under fuld bedøvelse. Centrifuger 15-milliliter blodopsamlingsrørene med saltvand ved 4.000 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten fra rørene.Resuspend pelleten i to milliliter erythrocytlyseopløsning. Fortynd det derefter med op til 12 ekstra milliliter lysopløsning, indtil det når en lys kaffefarve. Bemærk det samlede volumen og overfør to milliliter af fortyndingen til et hæmoglobinrør.Stil det på køl indtil hæmoglobinanalysen. En signifikant reduktion i blodtab for rekombinante koagulationsfaktor VIII-behandlingsgrupper blev observeret ved anvendelse af den optimerede protokol. En dosis på 20 internationale enheder pr. kg normaliserede blødningen fuldstændigt, og 10 IE pr. kg forårsagede en betydelig effekt, hvilket reducerede blodtabet næsten til den øvre grænse for vildtypeområdet.Lignende resultater blev observeret for blødningstid. En reduktion blev observeret i 5, 10 og 20 IE pr. Kg grupper, idet den blev fuldstændig normaliseret i gruppen på 20 IE pr. Kg. I vildtypemus varierede det samlede blodtab fra 200 til 840 nanomol hæmoglobin og i køretøjsmus fra 5.300 til 7.100 nanomol hæmoglobin.Den gennemsnitlige blødning var 5.200 nanomol i køretøjsbehandlede mus og 720 nanomol i gruppen på 20 IE pr. Kg. Blødningstiden for vildtypemus varierede fra et til ni minutter, og dosisniveauer på 10 og 20 IE pr. kg reducerede blødningstiden til inden for dette interval. En stærk sammenhæng mellem blodtab og blødningstid blev observeret i de kombinerede data.Alle registrerede blødningsepisoder blev plottet for at give en visualisering af længden og antallet af blødninger, der blev oplevet for hver enkelt mus. Bemærk, at i køretøjsgruppen fortsætter de fleste dyr med at bløde indtil forsøgets afslutning efter den anden udfordring. Måling af plasmafaktor VIII-koncentration bekræftede, at den effekt, der blev observeret ved reduktion af blodtab og blødningstid, var rekombinant faktor VIII koncentrationsafhængig.Antallet af blodplader blev ikke mærkbart påvirket, og hæmatokritniveauerne lå inden for normalområdet hos dyr, der fik moderate og højere rekombinante faktor VIII-doser, men signifikant lavere hos dyr, der blødte meget, f.eks. i køretøjet og en IE pr. kg grupper. Hos dyr, der oplever kraftig blødning, kan der forekomme mindre indflydelse på blodtællinger, især total hæmoglobin eller hæmatokrit. For at evaluere effekten af køn i denne optimerede model blev både blodtab og blødningstidsresultater udsat for tovejs ANOVA-analyse med køn og dosis som faktorer.Disse resultater viste, at respons på behandling ikke var forskellig mellem køn. Korrekt mærkning af halen og oprettelse af snittet er vigtige trin for at sikre pålidelighed og reproducerbarhed i teknikken, ligesom udfordringen, hvis der ikke er blødning. Desuden er god anæstesi induktion og vedligeholdelse af dyrets kropstemperatur særlig relevant.Vi har også brugt denne model til at undersøge stop af etablerede blødninger i en mere on-demand-lignende indstilling ved at behandle med faktor VIIA 10 minutter efter inducering af blødning.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Blood Pressure in Mice using Volume Pressure Recording, a Tail-cuff Method

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo elektroporation af Morpholinos i Regenerating Adult zebrafisk Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blodprøvetagning fra den laterale halevene af Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering af en musemodel at afbryde LINC komplekser i en celle-specifik måde

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Afsløring Etablering af fælles blodforsyning i parabiotiske mus ved Caudal Veneglucose Injektion

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometri analyse til at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Capsule-Based Model for Immature Hard Tick Stages Infestation on Laboratory Mice

En kapsel-baseret model for umodne Hard Tick Stages Angreb på Laboratoriemus

Ticks are obligatory blood feeding parasites at all stages of development (except eggs) and are recognized as vectors of various pathogens. The use of ...