Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

وقد تم دعم هذا المشروع من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240، رقم المشروع 374031971، مشروع INF) إلى J.B وK.G.H.
نشكر مركز رودولف فيرتشو على الدعم المالي والتصوير الفلوري للوحدة الأساسية على الدعم الفني. بالإضافة إلى ذلك، نشكر أشوين بالاكريشنان على قراءة الأدلة الشاملة.

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تعارضات يعلنونها.

التحليل الطيفي الفلوري هو واحد من الطرق الرئيسية لقياس ديناميات البروتين والتفاعلات البروتين البروتين مع الحد الأدنى من الاضطراب في السياق الخلوي. التحليل الطيفي للارتباط الفلوري الكونفوكوكال (FCS) هو واحد من الأساليب القوية لتحليل الديناميات الجزيئية كما هو جزيء واحد حساسة، انتقائية للغاية، ويعيش الخليةمتوافقة 1. بالمقارنة مع النهج الأخرى الموجهة نحو الديناميكيات ، فإن FCS لديها نطاق زمني أوسع قابل للقياس يمتد من ~ ns إلى ~ s ، والأهم من ذلك تغطية المقاييس الزمنية السريعة التي غالبا ما لا يمكن الوصول إليها عن طريق الأساليب القائمة على التصوير. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر أيضا الانتقائية المكانية بحيث يمكن بسهولة تمييز الغشاء، السيتوبلازميك، والنواة الديناميات الجزيئية 2. وهكذا، يمكن تحليل الوميض الجزيئي ومتوسط التركيز المحلي ومعامل الانتشار كميا باستخدام FCS. الديناميات بين الجزيئية مثل الربط تصبح سهلة الوصول إليها عند التحقيق في الانتشار المشترك لنوعين الجزيئية في التحليل الطيفي عبر الارتباط الفلوري (FCCS)تحليل 3،4،5 في نهج ثنائي اللون.
المبدأ الأساسي الأساسي في التحليل الطيفي للارتباط هو التحليل الإحصائي لتقلبات الكثافة المنبعثة من الجزيئات الحيوية المسماة الفلورية المنتشرة داخل وخارج تركيز الليزر(الشكل 1A). يمكن بعد ذلك تحليل وظائف الارتباط التلقائي أو المتبادل الناتجة عن ذلك عن طريق منحنى مناسب لاشتقاق ثوابت معدل الفائدة في نهاية المطاف. وبعبارة أخرى، فإن الأساليب الإحصائية FCS و FCCS لا توفر آثار جزيء واحد كما هو الحال في تتبع الجسيمات واحد، ولكن نمط ديناميكي أو "بصمة" عينة التحقيق مع دقة زمنية عالية. عندما يقترن Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) ، يمكن رصد الديناميات داخل الجزيئية مثل التغيرات تشكيلية في نفس الوقت في الإعداد confocalالمشتركة 5،6. FRET تحقيقات المسافة من اثنين من الفلوروفوريس وغالبا ما يشار إليها باسم الجزيئية "nanoruler". ولا يحدث نقل الطاقة إلا عندما تكون الجزيئات في محيط قريب (< 10 نانومتر)، ويتداخل طيف انبعاثات المتبرع بشكل كبير مع طيف امتصاص جزيء المقبول، ويوازي اتجاه ثنائي القطب للمتبرع والمتقبل (بما فيه الكفاية). وهكذا ، فإن الجمع بين FRET و FCCS يوفر تقنية ذات دقة زمنية عالية جدا. عندما الانتقائية المكانية، والحساسية، فضلا عن التوافق بين الخلايا الحية مطلوب، FRET-FCCS لديه مفيد واضح على أساليب أخرى مثل قياس حرارية المعايرة Isothermal (ITC)7،سطح بلازمون الرنين (SPR)8،أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR)9،10 لقياس ديناميات البروتين والتفاعلات.
على الرغم من قدرات ووعد مزدوج اللون مضان عبر الارتباط الطيفي (DC-FCCS)، أداء DC-FCCS في الخلايا الحية هو التحدي من الناحية الفنية بسبب نزيف الطيفية من خلال أو عبر الحديث بين القنوات3،4، والفرق في أحجام confocal بسبب خطوط الليزر متميزة طيفيا3،4،11، إشارة الخلفية ، والضوضاء أو القدرة الضوئية المحدودة للعينات12، 13،14،15. وكان إدخال الإثارة النبض interleaved (PIE) ل FCCS قرص مهم لفصل زمنيا الإثارة الليزر المختلفة للحد من الكلام الطيفي بين القنوات16. طرق التصحيح الأخرى لمواجهة النزيف الطيفي من خلال17،18،19 وتصحيحات الخلفية كما تم قبولها جيدا17،18،19. للحصول على تفاصيل وأساسيات على FCS، PIE أو FRET القارئ يشار إلى المراجع التالية2،4،6،16،20،21،22،23،24.
هنا، يتم تقديم جميع تجارب المعايرة اللازمة والتحليل جنبا إلى جنب مع النتائج التجريبية لمستقبلات G-البروتين إلى جانب نموذجي، β2-مستقبلات الأدرينالين (β2AR)، لثلاثة سيناريوهات مختلفة: (1) جزيئات ذات تسمية واحدة تحمل إما "الأخضر" (eGFP) أو "الأحمر" (SNAP-tag القائم على وضع العلامات)25 الفلوروفور؛ (2) بناء مزدوج المسمى، الذي يحمل علامة SNAP-محطة N وeGFP داخل الخلايا (NT-SNAP) [في هذه الحالة، كل التسميات هي في نفس البروتين. وبالتالي من المتوقع 100٪ نشر مشترك]؛ و (3) عينة مزدوجة التسمية، حيث يكون كلا الفلوروفوريس على نفس الجانب من غشاء الخلية (CT-SNAP). وهو يحمل علامة SNAP-TERMINAL C وeGFP داخل الخلايا. هنا، مرة أخرى كل التسميات هي في نفس البروتين مع مرة أخرى 100٪ المشاركة في الانتشار المتوقع. كما كل التسميات هي قريبة جدا من بعضها البعض، على نفس الجانب من غشاء الخلية، فإنه يظهر القدرة على مراقبة FRET والسلوك المضادة للارتهان. تم تحويل جميع المنشآت المصابة في خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) ووصفت في وقت لاحق مع ركيزة الفلورسنت الحمراء التي هي غشاء غير منفذة لبناء NT-SNAP والغشاء نفاذية لبناء CT-SNAP. وأخيرا، فإن البيانات المحاكاة تجسد تأثير المعلمات التجريبية على مضاد الارتباط الناجم عن FRET، وتأثير التفاعلات بين البروتين والبروتين على اتساع الانتشار المشترك.
وهكذا، يوفر هذا البروتوكول دليلا كاملا لأداء FRET-FCCS مجتمعة في الخلايا الحية لفهم ديناميات البروتين والتفاعلات البروتين البروتين مع جعل على بينة من التحف التقنية / المادية، والتحديات، والحلول الممكنة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

نحن نقدم بروتوكول وسير العمل لأداء الخلية الحية المزدوجة اللون مضان عبر الارتباط الطيفي (FCCS) جنبا إلى جنب مع Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) لدراسة ديناميات مستقبلات الغشاء في الخلايا الحية باستخدام تقنيات وضع العلامات الفلورية الحديثة. في FCCS ثنائي اللون ، حيث تمثل التقلبات في كثافة الفلورسينس "بصمة" ديناميكية للجزيئ الحيوي الفلوري المعني ، يمكننا التحقيق في الانتشار المشترك أو الربط بين المستقبلات. FRET، مع حساسيتها العالية للمسافات الجزيئية، بمثابة "نانورولر" معروفة لرصد التغيرات داخل الجزيئية. وإذا ما أخذت معا، فإن التغيرات التنظيمية والمعلمات الرئيسية مثل تركيزات المستقبلات المحلية وثوابت التنقل تصبح متاحة في البيئات الخلوية.
إن أساليب الفلورسينس الكمية تشكل تحديا في الخلايا بسبب مستويات الضوضاء العالية وضعف العينة. هنا نعرض كيفية إجراء هذه التجربة، بما في ذلك خطوات المعايرة باستخدام اللون المزدوج المسمى β2-مستقبلاتالأدرينالية (β2AR) المسمى مع eGFP وSNAP-tag-TAMRA. يتم توفير إجراء تحليل البيانات خطوة بخطوة باستخدام برامج مفتوحة المصدر وقوالب يسهل تخصيصها.
يمكن دليلنا الباحثين من كشف التفاعلات الجزيئية للجزيئات الحيوية في الخلايا الحية في الموقع مع موثوقية عالية على الرغم من مستويات الإشارة إلى الضوضاء المحدودة في تجارب الخلايا الحية. وتسمح النافذة التشغيلية ل FRET وخاصة FCCS بتركيزات منخفضة بالتحليل الكمي في الظروف شبه الفسيولوجية.

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

نقدم بروتوكول تجريبي وسير عمل تحليل البيانات لأداء الخلية الحية المزدوجة اللون مضان عبر التحليل الطيفي الارتباط (FCCS) جنبا إلى جنب مع Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) لدراسة ديناميات مستقبلات الغشاء في الخلايا الحية باستخدام تقنيات وضع العلامات الفلورية الحديثة.

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

مضان عبر الارتباط الطيفي هو وسيلة إحصائية تستخدم مضان نتيجة الوقت لتحديد التوقيع الديناميكي لمستقبلات G المقترنة بالبروتين في الخلايا الحية. هنا، ونحن مهتمون بشكل خاص، في مستقبلات بيتا-2 الأدرينالية. مستقبلات Sphingolipid أساسا توفير المعلومات حول ديناميات الانتشار الترجمي وبمساعدة من anisotropy مضان أيضا نشر التناوب.من خلال إدخال تسمية إضافية ، يمكننا أيضا إجراء تغييرات مؤيدة للربط أو حتى تشكيلية إذا عززت نقل الطاقة بالرنين بين التسميات كما تم فحصها. يتطلب الوقت الكمي المحلول الفلورسينس محاذاة دقيقة لقياسات الإعداد والمعايرة. في الدقائق التالية، سوف نقدم دليلا تجريبيا للطيف ارتباط مضان خلايا الحياة، عبر التحليل الطيفي الارتباط، ونقل الطاقة الرنين فورستر من مستقبلات G البروتين مقرونة، وذلك باستخدام استنساخ قادرة على العلامات وقوة التدفق الاصطناعية.يجب إجراء الجلوس في الخلايا ونقلها في ظل ظروف معقمة. وضع جرس زلة غطاء نظيف على لوحة ثقافة البئر ستة، وغسله مع العازلة الفوسفات العقيمة المالحة إضافة اثنين مل من الخلايا المتوسطة الثقافة مع فينول الأحمر تكملها 10٪ مصل البقر الجنين، 100 ميكروغرام، لكل البنسلين أمين و 100 ميكروغرام لكل مل ستربتوميسين إلى كل بئر، ويبقيه جانبا. تأخذ الخلايا CHO التي يتم استزراعها في نفس الوسط مع فينول الأحمر في 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة وغسلها مع خمسة مل برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا الميتة.إضافة اثنين مل من التريبسين واحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تمييع خلايا البيانات مع ثمانية مل من المتوسط مع فينول الأحمر وتخلط بعناية عن طريق pipetting. عد الخلايا في غرفة نيوباور والجلوس الخلايا في كثافة 150،000 خلية لكل بئر في لوحة ثقافة البئر الستة التي تحتوي على زلة الغطاء.دع الخلايا تنمو في حاضنة لمدة 24 ساعة من أجل تحقيق التقاء 80٪ تقريبا. تمييع اثنين ميكروغرام من الحمض النووي المتجه المطلوب. على سبيل المثال، CT SNAP أو NT SNAP، وستة ميكرولتر من كاشف العدوى هذا في أنبوبين منفصلين.كل تحتوي على 500 ميكرولتر انخفاض متوسط المصل لكل بئر واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. امزج الحلين معا للحصول على خليط العدوى واحتضانه لمدة 20 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، غسل خلايا CHO يجلس مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني عقيمة.استبدال برنامج تلفزيوني مع مل واحد لكل بئر من فينول الأحمر المتوسطة الحرة, تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنينية وليس المضادات الحيوية. إضافة خليط البناء بأكمله من قطرة واحدة مل الحكمة إلى كل بئر واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة في خمسة في المئة CO2. لوضع العلامات، تمييع الركيزة SNAP المناسبة في وسط مل واحد تكملها مصل البقر الجنيني 10٪ للحصول على تركيز نهائي من ميكرومولار واحد.غسل الخلايا المصابة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة مل واحد لكل بئر من محلول واحد MICROMOLAR SNAP الركيزة. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في 37 درجة في خمسة في المئة CO2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع فينول الأحمر المتوسطة الحرة، وإضافة اثنين مل لكل فينول جيدا المتوسطة الحرة الحمراء.احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5 في المئة CO2. نقل زلة غطاء من جميع العينات في وقت لاحق في غرفة التصوير وغسل مع 500 ميكرولتر التصوير العازلة. إضافة 500 ميكرولتر التصوير المخزن المؤقت قبل الانتقال إلى الإعداد فريد FCS.تم تجهيز إعداد FRED FCS بهدف مياه المجهر confocal ، واثنين من خطوط الليزر ، ونظام عد أجنبي واحد للحاف الزمني ، واثنين من BMTs الهجين ، وأسهمين لجمع الفوتون وبرامج جمع البيانات. من المهم جدا محاذاة الإعداد في كل مرة قبل القياس في الخلايا الحية. لضبط التركيز، الثقب ووضع التلوين، ضع اثنين من محلول المعايرة الخضراء نانومولار على زلة غطاء زجاجي والتبديل على الليزر نانومتر 485 و 560 نانومتر تعمل في أكوام، الإثارة بين الشقوق أو وضع PI.التركيز على الحل وضبط الثقب وطوق موقف حلقة بحيث يتم الحصول على أعلى معدل العد وأصغر حجم confocal للحصول على أقصى قدر من السطوع الجزيئي. كرر هذه العملية للقنوات الحمراء مع 10 نانومولار حل المعايرة الحمراء وخليط من كليهما. ضع 10 نانومولار حل الحمض النووي على زلة غطاء الزجاج، وضبط تركيز الثقب وموقف حلقة طوق بحيث الألوان المتقاطعة بين قنوات الكشف الأخضر والأحمر هو أعلى.هذا هو المصدر أعلى السعة. للقياسات في الخلايا الحية، ابحث عن خلية مناسبة عن طريق الحد من مصباح العلامة والمراقبة من خلال العين. قم بتشغيل كل من الليزر في وضع PI وركز على الغشاء من خلال البحث عن أقصى عدد ممكن في الثانية.يرجى ملاحظة أن طاقة الليزر قد تحتاج إلى تقليل لعينات الخلية. ويفضل أن يكون أقل من خمسة ميكروواط في الهدف. هذا يعتمد اعتمادا كبيرا على الأزهار المستخدمة والإعداد.مراقبة السيارات وعبر المنحنيات كول من بيتا-2 AR ملزمة جنيه والمفاجئة تحقيقات العلامة في المعاينة عبر الإنترنت من برنامج جمع البيانات وجمع العديد من القياسات الفرز مع وقت الاستحواذ بين 60 إلى 180 ثانية. تصدير مسار الارتباط والتباين من جميع القياسات. يرجى الحرص هنا لتحديد الإطارات الوقت السريع والتأخير بشكل صحيح واستخدام بعض الوقت الجزئي الحصول على الخيار في برنامج ارتباط البيانات.في المجموع، هناك حاجة إلى ثلاثة ارتباطات مختلفة. الارتباط التلقائي للنافذة الزمنية موجه القناة الخضراء. الارتباط التلقائي للقنوات الحمراء ونافذة وقت التأخير.وأخيرا كان الارتباط المتبادل لإشارة القناة الخضراء، والنافذة الزمنية السريعة هي إشارة القناة الحمراء في نافذة وقت التأخير. وهنا وظائف الارتباط التلقائي للفريد الأخضر والأحمر للحلول وتناسبها لنموذج نشر DT 3 مع مصطلح ثلاثي إضافي من المطلوب لمعايرة شكل وحجم حجم الكشف عن كونفوجال لاثنين من استخدام قنوات اللون، حيث B هو خط الأساس للمنحنى وعدد من الجزيئات والتركيز، TD وقت الانتشار و S، الصفر على أوميغا صفر عامل شكل عنصر حجم confocal. يوصف الوميض الثلاثي وفيزياء الصور بأنها سعة AR ووقت الاسترخاء TR. استخدام معامل الانتشار المعروف للمعايرة الخضراء والحمراء تبرز والحصول على عوامل الشكل لتحديد أبعاد وحجم عنصر حجم الكونفوجال المعدية.احسب الطيف عبر مثل IFR، وإشارة الفلورسنت الخضراء التي تم جمعها على الأصفار القنوات، واثنين في قناة الكشف الصحيح، القناة الأولى وثلاثة، كنسبة من الخلفية جمع الإشارات. تحديد التوقعات المباشرة لتدفق مقبول البيانات من قبل الأطوال الموجية الإثارة المانحة بنسبة الخلفية التي تم جمعها على النقيض من قياسات المعايرة الحمراء والإثارة نافذة الوقت الفوري عن طريق الليزر الأخضر إلى حساب الصحيح الخلفية الحق في تأخير الوقت نافذة الإثارة بواسطة الليزر الأحمر. حساب السطوع الجزيئي للB كل من قوة التدفق الأخضر والأحمر على أساس الخلفية التي تم جمعها التباين، والحصول على عدد من الجزيئات والتركيز على 3 DT تناسب الانتشار.تناسب كل من الارتباطات فائقة من القناة الخضراء والحمراء، وكذلك عبر الارتباط من المطالبة الخضراء والتأخير الأحمر من الحمض النووي على مستوى مزدوج لنموذج نشر DT 3 يحافظ على الحصول على عوامل على شكل ثابت لوظائف الارتباط التلقائي. عامل الشكل لدوال الارتباط المتبادل عادة ما يكون بين هاتين القيمتين. تحديد السعة في وقت الارتباط صفر استنادا إلى قيم الخط من العدد الظاهر من الجزيئات والتركيز.حساب نسبة السعة لعينة كان 100٪ نشر مشترك من قوة الكلمة الخضراء والحمراء. احتواء عينات الخلية إلى نموذج مناسب. كيف كنت تظهر نشر مستقبلات الغشاء ليست غريبة بطريقة ثنائية مشروط كان قصيرا، لا وقت نشر طويلة.بالإضافة إلى ذلك ، يجب النظر في فيزياء الصور والوميض خارج قوة الأرضية. هنا إلى TD1 و TD2 ، هما المطلوبان لنشر مرات. واحد هو جزء صغير من وقت الانتشار الأول على النقيض من قياس المعايرة التي تنتشر فيها خيوط النرد والحمض النووي الحر ، تظهر جميع الاتجاهات ومستقبلات الأغشية انتشارا ثنائي الأبعاد فقط على طول أغشية الخلايا لحساب تركيز بروتينات التسمية الخضراء أو الحمراء من احترام عدد الجزيئات والتركيز.وحجم عنصر حجم confocal، وذلك باستخدام كتلة التحيز. تناسب الارتباطات ألتو اثنين من العينة المسماة مزدوجة باستخدام نفس النموذج كما لبناء مستوى واحد ووظيفة الارتباط عبر باستخدام نموذج نشر ثنائي مشروط، لاحظ لوصف عالمي للنظام. يجب أن تكون جميع المحاصيل الثلاثة صالحة بشكل مشترك.مصطلح الانتشار مطابق لجميع المحاصيل الثلاثة. والفرق الوحيد هو أن وقت السمعة يقع، وظيفة الارتباط المتبادل. حساب تركيز بروتينات العمل الخضراء أو الحمراء من عدد الجزيئات المعنية والتركيز وحجم عنصر حجم الكونفوجكال.تقدير جزء أو تركيز البروتينات الخضراء والحمراء المتفاعلة من عينات الخلية باستخدام عوامل التصحيح التي تم الحصول عليها من عينات الحمض النووي ونسب السعة لعينة الخلية والتركيزات التي تم الحصول عليها. تناسب الارتباطات تغيير اثنين من عينة فريد كعينات واحدة وصفت وارتباط الصليب الأمامي لنموذج نشر ثنائي الوسائط التي تحتوي على مصطلح الارتباط المضادة، حيث AF يعكس اتساع الارتباط المضادة الكلي وAR وTR السعة ذات الصلة ووقت الاسترخاء. في حالة التغيرات الفلورية المضادة للارتباط بسبب فريد واحد أو عدة شروط الارتباط المضادة قد تكون هناك حاجة، مما أدى إلى تراجع وظيفة فريد عبر الارتباط في أوقات الارتباط منخفضة بالتزامن مع ارتفاع في اثنين من وظائف الارتباط السيارات.قياسات المعايرة من المحاليل الأزهار الخضراء والحمراء لعوامل الحلاقة من 6.5 والقنوات الخضراء، و 6.8 في القنوات الحمراء. وبالتالي ، فإن حجم الكونفوجكال لديه حجم 1.4 و 1.9 فيمتو في وقت لاحق من هذا اليوم القياس ، وسطوع الجزيء يكمن في 12.5 كيلوهيرتز لكل جزيء ، و 2.6 كيلوهيرتز لكل جزيء. لدينا 15٪ من الحديث المتبادل من الأزهار الخضراء إلى القنوات الحمراء بعد الإثارة المانحة و 38٪ من المباشر باستثناء الإثارة من شكل الأزهار الحمراء من قبل الأخضر، من قياس الحمض النووي لدينا، ونحن نحدد عوامل التصحيح لحجم التداخل confocal إلى 0.6 و 0.7 أيضا، والخلايا المصابة مع تسمية واحدة بناء تظهر ثنائي مشروط انتشار ثنائي الأبعاد على غشاء الخلية حيث ما يقرب من نصف الجزيئات تنتشر ببطء على مقياس الوقت 50 إلى 100 مللي ثانية والنصف الآخر سريع نسبيا حول ميلي ثانية اثنين في كلا البناءين.بالإضافة إلى ذلك، الوميض الثلاثي موجود. ومع ذلك، في المفاجئة المستوى الأحمر بناء يتم الحصول على وقت استرخاء آخر في 180 ميكروثانية، والتي قد تنبع من المفاجئة غير منضم على التوالي. من التسمية المزدوجة نفسها ، مع تقسيم بناء المضادة المفاجئة حيث التسميات اثنين على جانبين مختلفين من غشاء الخلية ، وقد تم جمع اثنين من أقل القياسات الضوضاء ومعطف أحمر على الارتباط.وارتباط PI المتبادل مرتفع جدا هنا. هنا 70٪ من الجزيئات، إذا كنت ببطء تحت مقياس زمني مائة مللي ثانية، وفقط 30٪ بسرعة حوالي ميلي ثانية واحدة، وجزء من جزيئات تحرير مزدوجة منخفضة وتقع بين 15 إلى 25٪، والبيانات لالتقاط CT تبدو أفضل وانها أقل ضجيجا. ومع ذلك ، لا يمكن رؤية الجبهة المتوقعة أعمق ارتباط مضاد ، وعلى الأرجح كتلة من خلال كمية عالية من الكلام المتبادل ، والإثارة قبول مباشر وامض الثلاثي من كل من قوة الأزهار ، وبمجرد أن مخططات تحليل البيانات الاستفادة من كثافة الفلورية التي تم جمعها DKS قد تساعد على انقاذ هذا كما هو مبين لمجموعة البيانات محاكاة.ميزة تقنية فريد FCS هو أنه جنبا إلى جنب مع التنقل، يمكننا التحقيق في ديناميات المؤتمر من GPCRs. ومع ذلك ، فإن أداء FRED FCs في المختبرات يمثل تحديا ويطلب خلايا متحولة جيدة ووضع علامات فعالة وإعداد معايرة مثالية. مجرد زوج فريد الموالية القوة هو أيضا حاسمة جدا.وتشمل الخطوات التجريبية الحاسمة التحسين الأمثل لالعاب العدوى ، والتقليل من الخلفية ، وفلورسينس السيارات. بالإضافة إلى ذلك، وسوف تساعد خط أنابيب تحليل الذرات لفهم ديناميات مختلفة من التعاليم في الخلايا الحية. نأمل أن يكون هذا البروتوكول مفيدا في تنفيذ نهج FRED FCS في تجارب الخلايا الحية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...