Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

该项目得到了德国联邦研究协会（SFB/TR 240，项目编号374031971，INF项目）对J.B和K.G.H.的支持。
我们感谢Rudolf Virchow中心的财政支持和Core Unit Fluorescence Imaging的技术支持。此外，我们感谢Ashwin Balakrishnan的彻底校对。

1. 实验方案
<ol><li>样品制备 注意：在无菌条件下进行细胞接种和转染。<ol>
<li>将每孔清洁的盖玻片放入6孔培养板中，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。 注：盖玻片清洁规程详见补充说明1。</li>
		<li>向每个孔中加入2mL含有酚红的完整细胞培养基（补充10%胎牛血清（FBS），100μg/ mL青霉素和100μg/ mL链霉素），并将板放在一边。</li>
		<li>在37°C和5%CO2 下将CHO细胞培养在含有酚红的同一培养基中。用5 mL PBS洗涤细胞以除去死细胞。</li>
		<li>加入2毫升胰蛋白酶，在室温（RT）下孵育2分钟。</li>
		<li>用8mL含有酚红的培养基稀释分离的细胞，并通过移液小心混合。</li>
		<li>在Neubauer室中计数细胞，并在含有盖玻片的6孔细胞培养板中以1.5×105 个细胞/孔的密度接种（在步骤1.1.1-1.1.2中制备）。</li>
		<li>让细胞在培养箱（37°C，5%CO2）中生长24小时，以达到约80%的汇合度。</li>
		<li>将2μg所需载体DNA（例如CT-SNAP或NT-SNAP）和6μL转染试剂稀释在两个单独的管中，每个试管中每个试管含有500μL还原血清培养基，并在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将两种溶液混合在一起以获得转染混合物，并在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>同时，用无菌PBS洗涤接种的CHO细胞一次。</li>
		<li>用 1 mL/孔的酚类无红培养基代替 PBS，并补充 10% FBS，不含任何抗生素。</li>
		<li>将整个1mL转染混合物滴加到每个孔中，并在37°C下在5%CO2中孵育细胞过夜。</li>
		<li>为了标记SNAP构建体，将适当的SNAP底物储备溶液稀释在1 mL补充有10%FBS的培养基中，以获得1μM的最终浓度。</li>
		<li>用PBS洗涤转染的细胞一次，每孔加入1mL的1μM SNAP底物溶液。将细胞在37°C下在5%CO 2中孵育20分钟。</li>
		<li>用无酚红培养基洗涤细胞三次，每孔加入2mL无酚红培养基。将细胞在37°C下在5%CO2中孵育30分钟。</li>
		<li>随后将所有样品的盖玻片转移到成像室中，并用500μL成像缓冲液洗涤。在移至FRET-FCS设置之前加入500 μL成像缓冲液。</li>
	</ol></li>
	<li>校准测量 注：FRET-FCS装置配备了一个共聚焦显微镜水物镜、两条激光线、一个时间相关单光子计数（TCSPC）系统、两个混合光电倍增管（PMT）和两个用于光子采集和数据收集软件的雪崩光电二极管（APD）。在每次活细胞测量之前对齐设置非常重要。详细的设置说明可以在 补充说明2中找到。在测量过程中，激光器和所有探测器（两个PMT和两个APD）始终处于导通状态，因为所有测量都需要在相同的条件下进行。对于校准测量，使用来自细胞接种的同一批次的盖玻片，这可以减少衣领环校正的变化。<ol>
<li>要调整焦点、针孔和环环位置，请将 2 nM 绿色校准溶液放在玻璃盖玻片上，然后打开 485 nm 和 560 nm 激光器。在脉冲交错激发（PIE）模式下操作激光16。</li>
		<li>专注于溶液并调整针孔和环的位置，以获得最高的计数率和最小的共聚焦体积，以获得最大的分子亮度。</li>
		<li>使用10 nM红色校准溶液和两者（绿色和红色校准溶液）的混合物对红色通道重复此过程。</li>
		<li>将10 nM DNA溶液放在玻璃盖玻片上，调整焦点、针孔和环位置，使绿色和红色检测通道之间的互相关最高，即显示最高振幅。 注意：可能需要来回重复步骤 1.2.1 和 1.2.4 才能找到最佳对齐方式。在对焦、针孔和环形位置针对绿色和红色检测通道以及共聚焦重叠体积进行最佳对齐后，从每个校准溶液中进行 3-5 次测量 30 秒 - 120 秒。</li>
		<li>测量一滴ddH2O，成像培养基和未转染细胞3-5次，每次30秒 - 120秒，以确定背景计数率。</li>
		<li>收集仪器响应功能，进行 30 s - 120 s 的 3-5 次测量。这是可选的，但强烈建议您这样做。</li>
	</ol></li>
	<li>活细胞测量<ol>
<li>通过用汞灯照明并通过目镜观察来找到合适的细胞。 注意：合适的细胞是活的，显示出各自贴壁细胞系的典型形态。目标蛋白质的荧光，这里是表面受体，在整个表面都是可见的。不太亮的细胞比较亮的细胞更适合，因为当少数分子聚焦时，FCS的对比度更好。</li>
		<li>在 PIE 模式下打开两个激光器，并通过查看每秒的最大计数来聚焦膜。 注：可能需要降低细胞样品的激光功率（物镜下小于5 μW）。这取决于所使用的荧光团和设置。</li>
		<li>在数据收集软件的在线预览中观察附着在β2AR上的eGFP或标记的SNAP标签的自相关曲线和互相关曲线，并收集几个短测量值（~2 -10），采集时间在60 -180 s之间。 注意：不要长时间连续激发细胞，因为荧光团可能会漂白。但是，这将取决于每个单元的亮度，测量可以多长时间以及总共可以执行多少次测量。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 数据分析
<ol><li>数据导出<ol>
<li>从所有测量值中导出相关曲线 G（tc） 和计数率 CR。</li>
		<li>注意正确定义"提示"和"延迟"时间窗口，并使用数据关联软件中的"微时间门控"选项。 注意：总共需要三种不同的相关性：（1）提示时间窗口中绿色通道的自相关（ACFgp），（2）延迟时间窗口中红色通道的自相关（ACFrd），最后（3）提示时间窗口中的绿色通道信号与延迟时间窗口中的红色通道信号（CCFPIE）的互相关。数据导出在补充说明3中分步显示不同软件。</li>
	</ol></li>
	<li>校准测量<ol><li>使用绿色（ACFgp） 和红色 （ACFrd）荧光团溶液的自相关函数，并将它们拟合到具有额外三重态项的 3D 扩散模型（等式 1）以校准两个所用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小： <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> 等式 1 这里，b是曲线的基线，N是聚焦中的分子数量，tD是扩散时间（以ms为单位），s = z0/w0是共聚焦体积元素的形状因子。三重态闪烁或其他光物理学由其振幅为R和弛豫时间tR来描述。 注：协议中使用的所有变量和符号均列于表 1 中。</li>
		<li>使用绿色26的已知扩散系数D和红色校准标准27以及获得的形状因子s绿色和s 红色来确定共聚焦体积元件的尺寸（宽度 w0和高度 z0）和体积Veff（等式 2a-c）。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">等式 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">等式 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">等式 2c 注：用于计算校准参数的模板作为补充文件 （S7） 提供。</li>
		<li>计算绿色荧光信号（在通道0和2中收集）进入红色检测通道（通道1和3） 的光谱 串扰α作为背景校正（BG）信号（等3）的比率。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> 等式 3</li>
		<li>通过"提示"时间窗口 （ 绿色激光激发）中红色校准测量值的背景校正计数率与"延迟"时间窗口（红色激光激发）中的背景校正计数速率之比（等式4），确定供体激发波长δ受体荧光团的直接激发。 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> 等式 4</li>
		<li>根据背景校正计数率和从3D扩散拟合（等式1）获得的聚焦分子数量N，计算绿色和红色荧光团的分子亮度B（等式5a-b）： <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">等式 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">等式 5b</li>
		<li>将双标记DNA的 ACFgp 和 ACFrd 以及 CCFPIE拟合到3D扩散模型（等式1）。保持获得的形状因子 ，s绿色 和 s红色，分别对 ACFgp 和 ACFrd恒定。 CCFPIE的形状因子 sPIE 通常介于这两个值之间。 注意：在理想的设置中 ，Veff，绿色 和 Veff，红色 将具有相同的大小并完美地重叠。</li>
		<li>确定零相关时间G0（tc）下的振幅，基于所发现的聚焦分子表观数量的值（N绿色，N红色和NPIE）。</li>
		<li>计算绿色和红色荧光团100%共扩散的样品的振幅比r GR和rRG（等式6）。请注意，NPIE不反映聚焦中的双标记分子的数量，而仅反映1 /G0（tc）。 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">和 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> 等式 6</li>
	</ol></li>
	<li>活细胞实验<ol><li>对于单标记结构，将细胞样品拟合到适当的模型中。对于所示的膜受体，扩散以双峰方式发生，扩散时间短，扩散时间长。此外，必须考虑荧光团的光物理和闪烁： <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> 等式 7 这里，td1和td2是两个必需的扩散时间，1是第一个扩散时间的分数。 注意：与校准测量相反，其中游离染料和DNA链向各个方向自由扩散，膜受体仅显示沿细胞膜的2D扩散。3D和2D扩散之间的这种差异通过修改后的扩散项（比较等式1）反映出来，其中2D情况下的tD不依赖于共聚焦体积元素的形状因子s。</li>
		<li>使用基本数学（等式8）从各自的N和Veff中计算绿色或红色标记蛋白质的浓度c： <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">等式 8 其中NA = 阿伏伽德罗数</li>
		<li>对于 N 端 SNAP 标记和细胞内 eGFP，使用与 ACF 的单标记构造（等式 7）和CCFPIE的单标记构造（等式 9）相同的模型拟合双标记样品的两个自相关（ACFgp和ACFrd）： <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">等式 9 注意：对于系统的全局描述，所有三条曲线必须共同拟合：所有三条曲线的扩散项相同，唯一的区别是 CCFPIE的弛豫项。由于两个荧光团的光物理学通常是不相关的，因此不需要相关项。这种松弛项的缺失导致 CCFPIE 在短时间内持平。然而，由于供体荧光团引起的受体串扰和直接激发可能显示假阳性幅度，应仔细检查是否使用校准测量。</li>
		<li>使用等式8从各自的N和Veff中计算绿色或红色标记蛋白质的浓度c。</li>
		<li>使用从DNA样品中获得的校正因子，细胞样品的振幅比rGR和r RG以及它们各自获得的浓度（等式10），估计细胞样品中相互作用的绿色和红色标记蛋白质的分数或浓度，c GR或c RG。 <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> 和 <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> 等式 10</li>
		<li>对于C端SNAP标记和细胞内eGFP，将FRET样品的两个自相关（ACFgp 和 ACFrd）拟合为单标记样品（等式7）和 CCFFRET 到包含反相关项（等式11）的双峰扩散模型 <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> 等式 11 其中f反映总反相关幅度，R和t R反映各自的振幅和弛豫时间。 注意：如果由于FRET导致反相关荧光变化，则可能需要一个或多个反相关项（等式11），导致CCFFRET在低相关时间的"下降"，与两个自相关（ACFgp和ACF rd）的上升相吻合。但是，请注意，光物理（如三重闪烁）可能会通过抑制 FRET 诱导的反相关来掩盖反相关项。补充过滤的FCS方法的联合分析可能有助于揭示反相关项。此外，应排除纳秒范围内计数电子设备中死区时间产生的技术伪影16。有关如何在ChiSurf28中执行分析的更详细的分步过程以及用于计算共聚焦体积或分子亮度的模板，可在Github存储库（https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS）和补充文件（补充注释4和补充注释6）中提供。此外，还可以在那里找到用于批量导出使用Symphotime软件以.ptu格式获取的数据的python脚本。</li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有冲突要声明。

GPCR中的FCS技术允许评估活细胞内受体的迁移率和相互作用41。FRET-FCS技术的优点是，除了移动性外，还可以研究GPCR的构象动力学。然而，在活细胞中进行FRET-FCS具有挑战性，并且需要显示出目标荧光标记蛋白的低（或最大适中）表达的细胞，校准良好的设置和良好的分析数据管道。在这里，首先讨论样品制备和实验过程中的生物学，光谱学和技术观点的要点。
关键的实验步骤包括最小化背景和自发荧光（通过使用广泛清洁的盖玻片和无酚红培养基），优化转染条件（例如，质粒DNA的量和转染后的时间），以实现低表达水平和有效的标记。当然，确保标记蛋白质的功能不受阻碍也至关重要。因此，在活细胞实验中，标记策略和标记位置的决定通常有利于荧光蛋白或附着在柔性N-或C-末端42，43的SNAP / CLIP标签上。替代标记策略，例如插入具有反应性侧链的非天然氨基酸，用于用有机荧光团标记，在过去几年中已经出现44。
对于仅研究两个目标分子相互作用的双色PIE-FCS，可以从大量已建立的荧光蛋白或SNAP / CLIP底物中选择荧光团。在这里，光谱学方面的目标应该是选择一对，使得发生很少的串扰或直接受体激发。此外，所选的荧光团应具有光稳定性，并且在所选的实验条件下很少或没有漂白。建议选择红色光谱范围内的荧光团，因为（1）来自细胞的自发荧光背景减少，（2）激发光波长较长，因此光毒性较小14。光漂白可以通过首先进行所谓的"功率序列"来最小化，其中激光功率逐步增加，并观察到分子亮度。最佳激发强度范围在于结果45的线性范围。
如果这两个标签也应该通过FRET报告蛋白质构象动力学，那么可用荧光团的选择就更加有限。在这里，应事先估计两个荧光团之间可能的最小/最大距离，例如，基于可用的结构或分子大小，并且选择具有合理Förster半径 R0 的荧光团对，使得FRET实际上可以发生20。
在这里，选择eGFP和SNAP标签进行标记，并且SNAP标签用细胞内或膜不透水的表面基质标记。光谱与图2C-D所示的光谱相似。荧光团的这种组合显示，在提示时间窗口内，绿色激发将eGFP与红色检测通道和直接受体激发SNAP底物的高串扰，并在提示时间窗口中的红色通道中产生显着的"假"信号。理想情况下，相声和直接受体激励这两个值都不应超过5%5，6，38。然而，Förster半径为57 Å，非常适合探测β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP结构中标签之间的距离，这可以从淬灭的eGFP寿命进行评估（补充注5）。
从技术上讲，与任何荧光光谱实验一样，该装置应良好对齐，并应具有合适的激发源，发射滤光片和灵敏的探测器。为了避免探测器在μs时间尺度上发生后脉冲产生的伪影，每种颜色的探测器至少应存在两个可以交叉关联的探测器。在现代时间相关单光子计数电子学中，由于独立的路由通道，检测卡在ns时间范围内的死区时间几乎不起作用，但是，如果感兴趣的时间范围位于sub-μs/ns时间范围内，则可以按照Müller等人16的建议对其进行检查。此外，对于ps范围内更高的时间分辨率，每个检测通道应加倍，即每种颜色应使用四个探测器，以绕过探测器死区时间2，15，29，46。虽然可以使用非偏振荧光检测来估计平均荧光寿命，但为了分析荧光团之间的距离（~分布），发射必须收集偏振相关。这是因为FRET中能量传递的效率依赖于两个荧光团的方向。更详细的信息可以在这里找到20，28，47.最后，在PIE实验中，提示脉冲和延迟脉冲之间的距离至关重要，应该选择荧光团的荧光强度在很大程度上衰减（图1B）。一个常见的规则是将两个脉冲相隔荧光寿命的5倍，即对于荧光寿命为2.5 ns的eGFP，距离应为12.5 ns，至少为22。
在详细介绍了实验过程的所有考虑因素之后，将更详细地讨论数据及其分析。如实验方案部分所述，必须每天检查设置的对齐情况，包括对校准测量的分析。例如，图2A-C所示的数据显示了8-40 μs范围内的额外松弛分量。已知绿色校准荧光团的典型三重态闪烁发生在2-10μs范围内13，15，48。DNA样品的所有曲线中所需的慢弛豫组分（图3C）对于实际的三重态眨眼来说太慢，可能源于DNA与荧光团39的相互作用。然而，在CCFPIE中，这种成分是不会预期的，并且很可能源于残留的串扰。因此，强烈建议在进行细胞实验之前直接对校准样品进行分析，以判断当天的对准质量。
正确校准共聚焦重叠体积需要具有100%共扩散绿色和红色标签的样品。这里，使用荧光标记的双链DNA。两条DNA链都可以定制，以在彼此之间所需的距离处具有所需的荧光团。设计的股线可以退火，产量高。然而，良好实验室规范建议通过琼脂糖凝胶电泳和测量吸收光谱来检查DNA链的完整性和标记程度。此外，还应检查双股组件的产量，因为这种校准测量主要依赖于绿色与红色标签存在100%共扩散的假设。如果假设无效，则可能必须应用校正因子16，22。在图2和图3所示的校准测量中，绿色和红色通道的检测体积分别为1.4 fL和1.9 fL。对于具有几乎衍射极限激发体积的设置，预计会出现这种尺寸差异（补充注2）。在此条件下，激发体积的大小随激发波长成比例。这反过来又解释了图3B中观察到的不同相关幅度。推导的校正因子rGR = 0.56和rRG = 0.72校正了这种大小差异和两个激发体积的潜在非完美重叠3，4。
图4、图5、图6和图7展示了基于PIE-F（C）CS的研究的工作流程，旨在了解构象蛋白动力学。首先，β 2 AR-IL3-eGFP和NT-SNAP-β 2 AR的两种单标记构建体作为对照，以表征在没有各自其他荧光团的情况下细胞中的荧光团性质（图4）。接下来，双标记结构NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP携带面向细胞外部的SNAP标签，细胞质侧的eGFP作为"100%共扩散"对照（图5）。最后一个构建体β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP，在细胞质侧携带两个荧光团，并且足够接近以进行FRET。在这里，由于蛋白质动力学影响FRET效率31，32，33，在瞬态时间窗口内，即供体激发后，绿色和红色通道信号中的反相关强度波动将再次期望100%共扩散。这种动态可能会在CCFFRET中显示为反相关（图6-7）。
所有GPCR β 2AR构建体均显示细胞膜上的双峰扩散（图4A）。而β 2AR-IL3-eGFP仅显示预期的三重态闪烁（图5B），13，15，NT-SNAP-β 2 AR显示额外的慢弛豫时间（图5C-D）。tR2可能源于未结合的SNAP底物。这可以通过进一步的实验来阐明，例如，通过测量所用SNAP基板在水溶液中的扩散和光物理性质。值得注意的是，区分扩散和弛豫时间的直接实验是改变共聚焦设置的针孔，即增加有效体积：虽然扩散时间随着有效体积的增加而增加，但弛豫项保持不变13。当根据拟合结果确定荧光蛋白（FP）的浓度时，请注意FP通常经历一个成熟过程，其中最终形成发色团12。这个成熟时间可能因FP而异，除了取决于局部化学环境的光物理13，15。因此，食品接触物质报告的样品中存在的实际蛋白质浓度通常被低估，如果可以在实验中确定非荧光FP的分数，则可以校正。最后，如果需要，建议检查活细胞中的荧光团光谱以校正α和δ的值，因为大多数荧光团对其环境敏感反应13，15，48。减去的背景由在未转染细胞中收集的信号决定。此外，应检查相应其他颜色通道和CCFPIE的自相关，以便能够识别错误信号（补充注4 - 图30）。
来自NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP的两个测量结果（图5D），其中荧光团位于膜的不同侧面，是在不同的日子里获得的，并显示了时间分辨单分子荧光统计的重要性。在这里，不同的结果可能是由于标记程度的不同：在一个单元中，较高的标记度和测量平均值导致相对较低的噪声（图5B），而从另一个单元中，只能收集两个测量值（图5A）。除了收集足够的数据量外，及时评估结果并可能优化标签策略也至关重要。在设计实验时，重要的是要记住FRET是灵敏的，但仅限于10nm的距离，否则是"盲目的"。在我们的例子中，这种"失明"由未改变的eGFP荧光寿命表示（补充注5）。在β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP结构（图6A）中，可以从淬灭的eGFP寿命中精确定位FRET（补充注5）。然而，没有观察到反相关项（图6B），这意味着FRET要么没有波动，要么在比扩散时间慢的时间尺度上。在ACFgp，ACF rp，ACF rd和CCFFRET中最多需要三个额外的松弛项（图6C）。ACFrp，ACF rd和CCF FRET中的慢分量可能是由于受体漂白，当然，会影响这些曲线中发现的慢速扩散的获得值（〜350 ms，而ACFgp中的117 ms）。红色通道中的t D应该比绿色通道中的D略大，因为共聚焦体积的大小不同（图2）- 但只有与大小差异相当的系数。3 μs的极快弛豫时间反映了荧光团13，15，48的三重闪烁，而37 μs的较慢弛豫时间可能是由于FRET：同样，由于FRET在CCFFRET中诱导反相关，因此自相关31，32，33预计正相关。该术语在CCFFRET中作为"阳性"存在及其在ACFrd中的存在可以用高串扰来解释，并应进一步阐明。请注意，CCFPIE在较短的相关时间内与预期持平。
另一方面，应该注意的是，在感兴趣的系统中发生FRET会导致相关曲线6的非线性效应。例如，分子的分子亮度缩放成相关幅度平方，并且每个FRET状态（以及始终存在的没有活性受体的分子）显示出不同的分子亮度。事实上，FRET降低了检测到的绿色分子的表观浓度（即，增加ACFgp振幅），并且红色分子的数量（从红色提示确定）被高估了5。这两种效应都会影响CCFFRET和CCF PIE的相互作用量。然而，如图所示的全局分析，例如对钙调蛋白31、32或Syntaxin33的分子内动力学可以揭示蛋白质动力学。当仔细校准时，可以从相对CCFPIE和ACF振幅22中提取平均FRET效率，而限制状态可以从分析供体荧光寿命分布33来确定。
考虑到在使用eGFP等大型荧光团的活细胞实验中，FRET对比度可能比图6所示模拟的假设更低，并且模拟中没有添加受体的直接激发，这也许可以解释为什么在活细胞实验中鉴定反相关是非常具有挑战性的。一种有前途的分析替代方案依赖于收集编码在光子到达时间直方图（图1B）中的信息，由于时间相关的单光子计数数据收集29，30。如果样品中两种（或多种）（FRET）物种的荧光寿命（~模式）已知（图7A），则可以选择在相关过程中应用的"滤光片"或砝码（图7B）17，18，19。由此获得的相关性曲线不再代表检测通道的相关性，而是两个不同（FRET）物种之间的自相关或互相关，因此更名为物种-ACF（sACF）或物种-CCF（sCCF）。将这种方法应用于具有中等FRET对比度，高串扰和三重闪烁的模拟数据，可以恢复反相关项（图7C-D）。但是，应该注意的是，可以获得松弛时间，但与振幅的关系丢失了18。这种方法以前已应用于活细胞实验中，例如用于研究EGFR与其拮抗剂49的相互作用，或将荧光从附着在具有极短和长荧光寿命的eGFP变体上的蛋白质中分离出来50。
虽然纯化蛋白质中基于PIE的FRET测量主要用于研究蛋白质动力学3622，但在活细胞中，它侧重于理解蛋白质 - 蛋白质相互作用。这种方法已被应用于研究酵母51 中MAP激酶活性的调节或解决膜蛋白与其胞质结合伴侣的相互作用，如最近的第52条所总结的那样。在这里，当绿色荧光团的显著串扰仍然存在于红色通道的延迟时间窗口中或红色信号在提示时间窗口中的绿色通道中时，可能会出现并发症。前者可能是由于红色脉冲相对于绿色脉冲的延迟不足引起的，而这两种效应都源于所选荧光团的激发和发射光谱重叠过强。建议仔细检查相应的单个标记结构，并纠正假阳性 CCFPIE 振幅，特别是在荧光寿命非常短的自发荧光可能是另一个复杂因素22的细胞中。
总而言之，这里描述的FRET-FCS方法具有巨大的潜力来理解接近生理浓度的活细胞中的蛋白质 - 蛋白质相互作用和蛋白质动力学。在该协议中，重点放在所需的校准测量和在活细胞测量期间进行的必要定量分析上。为此，展示了不同的活细胞测量，并辅以模拟。仿真提供了一般理解，因为参数可以通过定制的拟合模型系统地变化，这些模型描述了各自数据的特定移动性和光物理特性。分析是使用开源软件工具执行的，具有广泛的分步协议和易于调整的模板。最后，技术进步，以及即购即用的稳定PIE-FCS系统的可用性以及用于数据分析的开源软件的传播，将使这种技术越来越容易被更大的研究社区所接受，最终以最高的灵敏度揭示活细胞中的蛋白质相互作用和动力学。

荧光光谱是在细胞环境中以最小的扰动量化蛋白质动力学和蛋白质 - 蛋白质相互作用的主要方法之一。共聚焦荧光相关光谱（FCS）是分析分子动力学的强大方法之一，因为它具有单分子敏感性，高选择性和活细胞相容性1。与其他面向动力学的方法相比，FCS具有更广泛的可测量时间范围，从~ns到~s，最重要的是涵盖了基于成像的方法通常无法访问的快速时间尺度。此外，它还提供了空间选择性，因此可以很容易地区分膜，细胞质和细胞核分子动力学2。因此，分子闪烁，平均局部浓度和扩散系数可以用FCS定量分析。当在双色方法中探测荧光互相关光谱（FCCS）分析3，4，5中两种分子物种的共扩散时，诸如结合的分子间动力学变得容易获得。
相关光谱学的主要基本原理是对荧光标记的生物分子在激光焦点中扩散和扩散的强度波动进行统计分析（图1A）。然后，可以通过曲线拟合进进一步分析生成的自相关或互相关函数，以最终推导出感兴趣的速率常数。换句话说，FCS和FCCS的统计方法不像单粒子跟踪那样提供单分子迹线，而是提供具有高时间分辨率的探针标本的动态模式或"指纹"。当与Förster共振能量转移（FRET）结合使用时，可以在共同的共聚焦设置5，6中同时监测分子内动力学，例如构象变化。FRET探测两个荧光团的距离，通常被称为分子"纳米规则"。只有当分子靠近（<10nm）时，能量转移才会发生，供体的发射光谱与受体分子的吸收光谱显着重叠，并且供体和受体的偶极子方向（足够）平行。因此，FRET和FCCS的结合提供了一种具有非常高时空分辨率的技术。当需要空间选择性、灵敏度和活细胞相容性时，FRET-FCCS比其他方法（如等温滴定量热法（ITC）7、表面等离子体共振（SPR）8或核磁共振（NMR）9、10具有明显的优势，用于测量蛋白质动力学和相互作用。
尽管双色荧光互相关光谱（dc-FCCS）具有功能和前景，但由于通道之间的光谱渗漏或串扰，在活细胞中执行dc-FCCS在技术上具有挑战性3，4，由于光谱不同的激光线3，4，11，背景信号和样品的噪声或有限的光稳定性而导致的共聚焦体积差异12， 13，14，15 。在FCCS中引入脉冲交错激励（PIE）是一项重要的调整，以暂时解耦不同的激光激发，以减少通道16之间的光谱串扰。其他用于对抗光谱渗漏17、18、19和背景校正的校正方法也得到了很好的接受17、18、19。有关FCS，PIE或FRET的详细信息和基础知识，请参阅以下参考文献2，4，6，16，20，21，22，23，24。
在这里，提出了所有必要的校准实验和分析以及原型G蛋白偶联受体β 2-肾上腺素能受体（β 2 AR）的实验结果，用于三种不同的情况：（1）携带"绿色"（eGFP）或"红色"（基于SNAP标签的标记）的单标记分子25荧光团;（2）双标记结构，携带N端SNAP标签和细胞内eGFP（NT-SNAP）[在这种情况下，两个标签位于同一蛋白质。因此，预计100%共扩散];（3）双标记样品，其中两个荧光团位于细胞膜的同一侧（CT-SNAP）。它携带C端SNAP标签和细胞内eGFP。在这里，两个标签再次处于相同的蛋白质中，预计再次具有100%的共扩散。由于两个标记彼此非常接近，在细胞膜的同一侧，它显示出观察FRET和反相关行为的潜力。所有构建体均在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中转染，然后用红色荧光底物标记，该底物对于NT-SNAP构建体是膜不透水的，对于CT-SNAP构建体是膜通透的。最后， 仿真数据验证了实验参数对FRET诱导的反相关的影响， 以及蛋白质-蛋白质相互作用对共扩散幅度的影响.
因此，该协议为在活细胞中执行组合的FRET-FCCS提供了完整的指南，以了解蛋白质动力学和蛋白质 - 蛋白质相互作用，同时了解技术/物理伪影，挑战和可能的解决方案。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

我们提出了一种方案和工作流程，以执行活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与Förster共振能量转移（FRET）相结合，以使用现代荧光标记技术研究活细胞中的膜受体动力学。在双色FCCS中，荧光强度的波动代表相应荧光生物分子的动态"指纹"，我们可以探测受体的共扩散或结合。FRET对分子距离具有高灵敏度，是一种众所周知的"纳米规则"来监测分子内的变化。综上所述，构象变化和关键参数（如局部受体浓度和迁移率常数）在细胞环境中变得可及。
由于高噪声水平和样品的脆弱性，定量荧光方法在细胞中具有挑战性。在这里，我们展示了如何执行该实验，包括使用双色标记的β 2-肾上腺素能受体（β 2 AR）标记eGFP和SNAP-tag-TAMRA的校准步骤。使用易于自定义的开源软件和模板提供分步数据分析过程。
我们的指南使研究人员能够在活细胞实验中信噪比水平有限的情况下 ，以高可靠性原位 解开活细胞中生物分子的分子相互作用。FRET，特别是低浓度FCCS的操作窗口允许在近生理条件下进行定量分析。

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Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

我们提出了一种实验方案和数据分析工作流程，以执行活细胞双色荧光交叉相关光谱（FCCS）与Förster共振能量转移（FRET）相结合，以使用现代荧光标记技术研究活细胞中的膜受体动力学。

双色荧光互相关光谱研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质动力学

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

荧光互相关光谱是一种统计方法，它使用时间结果荧光来精确定位活细胞中G蛋白偶联受体的动态特征。在这里，我们对β-2肾上腺素能受体特别感兴趣。鞘脂受体主要提供有关平移扩散动力学的信息，并且在荧光各向异性的帮助下也提供旋转扩散。通过引入额外的标签，如果促进所探测的标签之间的共振能量转移，我们还可以亲结合甚至构象变化。定量时间分辨荧光需要仔细对准设置和校准测量。在接下来的几分钟里，我们将提供生命细胞荧光相关光谱学，交叉相关光谱学和G蛋白偶联受体的Forster共振能量转移的实验指南，使用克隆标签和合成流力。细胞坐位和转置需要在无菌条件下进行。将干净的盖子滑杠铃放在六孔培养板上，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗，加入两mL含有酚红的细胞培养基，其中补充有10%胎牛血清，100微克，每胺青霉素和100微克每毫升链霉素到每个孔中，并将其放在一边。取在37摄氏度下以5%CO 2的苯酚红培养基培养的CHO细胞，并用5 mL PBS洗涤它们以除去死细胞。加入两毫升胰蛋白酶，在室温下孵育两分钟。用8 mL含酚红培养基稀释数据细胞，并通过移液小心混合。在Neubauer室中计数细胞，并将细胞以每孔150， 000个细胞的密度置于含有盖玻片的六孔培养板中。让细胞在培养箱中生长24小时，以达到约80%的汇合度。稀释两微克所需的载体DNA。例如，CT SNAP或NT SNAP，并将六微升的该转染试剂放入两个单独的管中。每个孔含有500微升的还原血清培养基，并在室温下孵育五分钟。将两种溶液混合在一起以获得转染混合物，并在室温下再孵育20分钟。同时，用无菌PBS洗涤一次坐着的CHO细胞。用每孔1毫升酚红游离培养基代替PBS，补充10%胎牛血清，不含抗生素。将一毫升滴的整个构建混合物加入每个孔中，并在37度下在5%的CO 2中孵育细胞过夜。为了标记，将适当的SNAP底物稀释在一个mL培养基中，补充10%胎牛血清，以获得一个微摩尔的最终浓度。用PBS洗涤转染的细胞一次，每孔加入一个微摩尔SNAP底物溶液一mL。将细胞在37度下在5%的CO 2中孵育20分钟。用酚红游离培养基洗涤细胞三次，每孔加入两mL酚红游离培养基。将细胞在37摄氏度下在5%的CO 2中孵育30分钟。随后将所有样品的盖玻片转移到成像室中，并用500微升成像缓冲液洗涤。在移动到FRED FCS设置之前添加500微升成像缓冲液。FRED FCS装置配备了一个共聚焦显微镜水物镜，两条激光线，一个时间缝合器单一外来计数系统，两个混合BMT以及两个用于光子收集和数据收集软件的股票。在活细胞中每次测量之前，对设置进行校准非常重要。为了调整焦点，针孔和着色位置，将两个纳米摩尔绿色校准溶液放在玻璃盖滑轨上，然后打开在桩，交错激发或PI模式下操作的485纳米和560纳米激光器。专注于溶液并调整针孔和环的位置，以获得最高的计数率和最小的共聚焦体积，以获得最大的分子亮度。用10纳摩尔红校准溶液和两者的混合物对红色通道重复此过程。将10纳米摩尔DNA溶液放在玻璃盖玻片上，调整针孔的焦点和环的位置，使绿色和红色检测通道之间的交叉颜色最高。这是最高振幅的来源。对于活细胞的测量，通过用标记灯限制并通过眼观察来找到合适的细胞。在PI模式下打开两个激光器，并通过查找每秒的最大计数来聚焦膜。请注意，可能需要降低细胞样品的激光功率。优选在物镜处小于五微瓦。这在很大程度上取决于所使用的花卉和设置。在数据收集软件的在线预览中观察绑定到EGP和捕捉标签探头的beta-2 AR的自动和交叉碰撞曲线，并收集多个排序测量值，采集时间在60到180秒之间。导出所有测量值的相关过程和对比度。请在此处小心正确定义提示和延迟时间窗口，并在数据关联软件中使用一些微时间获取选项。总共需要三种不同的相关性。绿色通道提示时间窗口的自动关联。红色通道和延迟时间窗口的自动关联。最后是绿色通道信号的互相关，提示时间窗口是延迟时间窗口中的红色通道信号。以下是用于解的绿色和红色FRED的自动相关函数，并将它们拟合到3 DT扩散模型中，并具有额外的三重项，用于校准两个使用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小，其中B是曲线的基线以及分子和焦点的数量， TD的扩散时间和S，零超过欧米茄零的共聚焦体积元件的形状因子。三重闪烁和光物理被描述为振幅AR和弛豫时间TR。使用绿色和红色校准的已知扩散系数，并获得形状因子以确定感染共聚焦体积元件的尺寸和体积。计算跨越的光谱像IFR一样，将绿色荧光信号采集到的通道为零，并将两个通道放入正确的检测通道，通道1和3，作为背景收集的信号的比率。通过红色校准测量值的背景收集对比度与绿色激光激发的提示时间窗口激发到背景正确帐户的比率，确定供体激发波长对受体数据流的直接期望值。根据采集的背景对比度计算B的分子亮度，同时将绿色和红色两者的流动力两者收集到对比，并得到分子数并聚焦于3 DT扩散拟合。拟合来自绿色和红色通道的超相关，以及从双水平DNA的绿色提示和红色延迟到3 DT扩散模型的跨相关，使获得的形状因子对于自动相关函数保持恒定。互相关函数的形状因子通常介于这两个值之间。根据分子表观数的字体值和焦点确定零相关时间的振幅。计算样品的振幅比是绿色和红色地板力的100%共扩散。将细胞样本拟合到适当的模型。它们如何以双模态方式显示膜受体扩散并不好奇，这是一个短的，没有长的扩散时间。此外，还必须考虑照片物理和眨眼地板力。这里到TD1和TD2，是两者所需的扩散时间。与自由骰子和DNA链扩散的校准测量相比，所有方向的膜受体仅显示沿细胞膜的2D扩散，从分子数量和焦点的角度计算绿色或红色标记蛋白的浓度。和共聚焦体积元件的体积，使用偏置质量。使用与单能级构造相同的模型拟合双标记样本的两个中音相关性，并使用双模态扩散模型拟合互相关函数，注意系统的全局描述。所有三种作物必须共同适合。所有三种作物的扩散项都是相同的。唯一的区别是信誉时间下降，互相关函数。根据各自的分子数量和焦点以及共聚焦体积元件的体积来计算绿色或红色劳动蛋白的浓度。使用从DNA样品中获得的校正因子，细胞样品的振幅比和各自获得的浓度来估计细胞样品中相互作用的绿色和红色标记蛋白的分数或浓度。将FRED样本的两个变化相关性拟合为单个标记样本和前交叉相关到包含反相关项的双模态扩散模型，其中AF反映总反相关项的振幅，AR和TR反映各自的振幅和弛豫时间。在由于FRED引起的反相关荧光变化的情况下，可能需要一个或多个反相关项，这导致Fred互相关函数在低相关时间的下降与两个自动相关函数的增加相吻合。绿色和红色花卉溶液的校准测量值为6.5和绿色通道，红色通道中的系数为6.8。因此，共聚焦体积在此测量日的晚些时候具有1.4和1.9毫微特的大小，分子亮度为每分子12.5千赫兹，每分子2.6千赫兹。我们有15%的串扰从绿色花卉进入供体激发后的红色通道和38%的直接（除了绿色激发红色花型的激发），从我们的DNA测量中，我们确定共聚焦重叠体积的校正因子到0.6和0.7，用单标签结构转染的细胞在细胞膜上显示出双模态二维扩散，其中大约一半的分子在细胞膜上缓慢扩散在两种构造中，50 到 100 毫秒的时间尺度和另一半相对较快的时间范围约为两毫秒。此外，存在三重闪烁。然而，在红色水平捕捉构造中，在180微秒处获得了另一个松弛时间，这可能源于未绑定的快照直。从双标签本身，用抗卡扣结构进行横切，其中两个标签在细胞膜的两个不同侧面，两个较少的测量值已经收集了噪声和红色涂层的相关性。这里的PI互相关相当高。这里70%的分子，如果你慢慢地在一百毫秒的时间尺度下，并且在一毫秒左右只有30%的速度，那么双释放分子的比例很低，介于15%到25%之间CT快照的数据看起来更好，噪音更小。然而，预期的前部最深的反相关是看不见的，并且很可能是通过大量的串扰，直接接受激发和两种花力的三重闪烁来质量，并且一旦数据分析方案利用收集的荧光强度DKS可能有助于挽救这一点，如模拟数据集所示。Fred FCS技术的优势在于，除了移动性之外，我们还可以研究GPCR的会议动态。然而，在实验室中执行FRED FC具有挑战性，需要良好的转染细胞，有效的标记和完美的校准设置。只是一个FRED对专业力量也是非常关键的。关键的实验步骤包括转染优化的优化、背景的最小化和自动荧光。此外，原子分析管道将有助于了解活细胞中受体的各种动力学。我们希望该协议在活细胞实验中执行FRED FCS方法将是有用的。

Research

JoVE Journal

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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