Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dette projekt blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, projektnummer 374031971, Project INF) til J.B. og K.G.H.
Vi takker Rudolf Virchow Center for økonomisk støtte og Core Unit Fluorescens Imaging for teknisk support. Derudover takker vi Ashwin Balakrishnan for grundig korrekturlæsning.

1. Eksperimentel protokol
<ol><li>Prøveforberedelse BEMÆRK: Udfør cellesåning og transfektion under sterile forhold.<ol>
<li>Placer en renset coverlip per godt i en 6-brønd kultur plade og vask tre gange med steril fosfat-buffered saltvand (PBS). BEMÆRK: Coversliprengøringsprotokollen er beskrevet i supplerende bestemmelse 1.</li>
		<li>Til hver brønd tilsættes 2 mL af det komplette cellekulturmedium, der indeholder phenolrød (suppleret med 10% fosterkvægsserum (FBS), 100 μg/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin) og holder pladen til side.</li>
		<li>Dyrke cho-cellerne i samme medium, der indeholder phenolrød ved 37 °C og 5% CO2. Vask cellerne med 5 mL PBS for at fjerne de døde celler.</li>
		<li>Tilsæt 2 mL trypsin og inkuber i 2 min ved stuetemperatur (RT).</li>
		<li>Fortynd de løsrevne celler med 8 mL medium, der indeholder phenol rød og blandes omhyggeligt ved pipettering.</li>
		<li>Cellerne tælles i et Neubauer-kammer og frø ved en massefylde på 1,5 x 105 celler/brønd i den 6-brønds cellekulturplade, der indeholder omslagene (fremstillet i trin 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>Lad cellerne vokse i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i 24 timer for at opnå ca. 80% sammenløb.</li>
		<li>Fortynd 2 μg af det ønskede vektor-DNA (f.eks. CT-SNAP eller NT-SNAP) og 6 μL af transfectionreagenset i to separate rør, der hver indeholder 500 μL af det reducerede serummedium for hver brønd og inkuberer i 5 min ved RT.</li>
		<li>Bland de to opløsninger sammen for at opnå transfectionblandingen og inkubere den i 20 minutter på RT.</li>
		<li>I mellemtiden vaskes de seedede CHO-celler en gang med steril PBS.</li>
		<li>Udskift PBS med 1 mL/brønd af phenol rød-fri medium suppleret med 10% FBS uden antibiotika.</li>
		<li>Der tilsættes hele 1 mL transfectionblandingen dropwise til hver brønd og inkuberes cellerne natten over ved 37 °C, i 5% CO2.</li>
		<li>Ved mærkning af SNAP-konstruktionen fortyndes den relevante SNAP-substratlageropløsning i 1 mL af mediet suppleret med 10% FBS for at opnå en endelig koncentration på 1 μM.</li>
		<li>Vask de transfected celler én gang med PBS og tilsæt 1 mL pr. brønd af 1 μM SNAP substratopløsning. Inkuberes cellerne i 20 min ved 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Vask cellerne tre gange med phenol rød-fri medium og tilsæt 2 mL pr godt phenol rød-fri medium. Inkuberes cellerne i 30 min ved 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Dækslerne af alle prøver overføres efterfølgende til billedkammeret, og der vaskes med 500 μL billedbuffer. Tilføj 500 μL billedbuffer, før du går over til FRET-FCS-opsætningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibreringsmålinger BEMÆRK: FRET-FCS setup er udstyret med en konfokal mikroskop vand mål, to laser linjer, en Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system, to hybrid photomultiplier rør (PMT) og to lavine photodiodes (APD) for foton indsamling og dataindsamling software. Det er meget vigtigt at justere opsætningen hver gang før live celle målinger. Den detaljerede opsætningsbeskrivelse findes i supplerende note 2. Både lasere og alle detektorer (to PMT'er og to APD'er) er altid TÆNDT under målingerne, da alle målinger skal udføres under identiske forhold. Til kalibreringsmålingerne skal du bruge en coverlip fra det samme parti, som cellerne blev sået på, hvilket reducerer variationen i kraveringenskorrektion.<ol>
<li>For at justere fokus, pinhole og krave ring position, placere 2 nM grøn kalibrering løsning på et glas coverlip og tænde 485 nm og 560 nm laser. Betjen laser i Pulserende Interleaved Excitation (PIE) tilstand16.</li>
		<li>Fokuser på opløsningen og juster pinhole og krave ring position således, at den højeste tællehastighed og mindste konfokale volumen opnås for at få den maksimale molekylære lysstyrke.</li>
		<li>Gentag denne proces for de røde kanaler med 10 nM rød kalibreringsopløsning og en blanding af både den grønne og røde kalibreringsløsning.</li>
		<li>Placer 10 nM DNA-opløsningen på en glasdækslede og juster fokus-, pinhole- og kraveringspositionen, så krydskorrelationen mellem de grønne og røde detektionskanaler er størst, dvs. BEMÆRK: Trin 1.2.1 og 1.2.4 skal muligvis gentages frem og tilbage for at finde den optimale justering. Tag 3-5 målinger fra hver kalibreringsløsning i 30 s - 120 s efter fokus, pinhole og krave ring position er blevet justeret optimalt for de grønne og røde detektionskanaler og confocal overlapning volumen.</li>
		<li>Mål et fald på ddH2O, billedmediet og en ikke-overført celle 3-5 gange hver for 30 s - 120 s for at bestemme baggrundstællingsraterne.</li>
		<li>Saml instrumentresponsfunktionen med 3-5 målinger i 30 s - 120 s. Dette er valgfrit, men kan varmt anbefales.</li>
	</ol></li>
	<li>Målinger af levende celler<ol>
<li>Find en passende celle ved at belyse med kviksølvlampen og observere gennem okulæren. BEMÆRK: Egnede celler er i live, der viser den typiske morfologi af den respektive klæbende cellelinje. Fluorescensen af proteinet af interesse, her en overflade receptor, er synlig over hele overfladen. Mindre lyse celler er mere egnede end lysere på grund af den bedre kontrast i FCS, når et lavt antal molekyler er i fokus.</li>
		<li>Tænd begge lasere i PIE-tilstand og fokuser på membranen ved at se på de maksimale antal pr. Sekund. BEMÆRK: Lasereffekten skal muligvis reduceres for celleprøverne (mindre end 5 μW under mål). Dette afhænger af de anvendte fluorophores og opsætningen.</li>
		<li>Overhold eGFP's auto- og krydskorrelationskurver eller mærket SNAP-tag, der er fastgjort til β2AR i onlineeksemplet af dataindsamlingssoftwaren, og indsamle flere korte målinger (~ 2 -10) med en anskaffelsestid mellem 60 -180 s. BEMÆRK: Opildne cellerne ikke i lang tid kontinuerligt, da fluorophorerne kan blege. Det afhænger dog af lysstyrken i hver celle, hvor længe målingerne kan være, og hvor mange målinger i alt der kan udføres.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dataanalyse
<ol><li>Eksport af data<ol>
<li>Eksporter korrelationskurverne, G(tc) og tællehastigheder, CR, fra alle målinger.</li>
		<li>Pas på at definere tidsvinduerne "prompt" og "delay" korrekt, og brug indstillingen "microtime gating" i datakorrelationssoftwaren. BEMÆRK: I alt kræves der tre forskellige korrelationer: (1) autokorrelation mellem den grønne kanal i prompttidsvinduet (ACFgp), (2) autokorrelation mellem de røde kanaler i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd) og endelig (3) krydskorrelationen mellem det grønne kanalsignal i prompttidsvinduet med det røde kanalsignal i forsinkelsestidsvinduet (CCFPIE). Dataeksporten vises trin for trin for forskellig software i supplerende note 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibreringsmålinger<ol><li>Brug autokorrelationsfunktionerne for de grønne (ACFgp) og de røde (ACFrd)fluorophoreopløsninger, og sæt dem i en 3D-diffusionsmodel med et ekstra tredobbelt udtryk, hvis det kræves (eq. 1) til at kalibrere formen og størrelsen af den konfokale detektionsvolumen for de to anvendte farvekanaler: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 Her er b kurvens grundlinje, N antallet af molekyler i fokus, tD diffusionstiden (i ms) og s = z0/w0 formfaktoren for det konfokale volumenelement. Triplet blinkende eller anden fotofysik er beskrevet ved sin amplitud enR og afslapning tid tR. BEMÆRK: Alle variabler og symboler, der bruges i protokollen, er angivet i tabel 1.</li>
		<li>Brug de kendte diffusionskoefficienter D for den grønne26 og røde kalibreringsstandard27 og de opnåede formfaktorer grønne og røde til at bestemme dimensionerne (bredde w0 og højde z0) og volumen V-eff af det konfokale volumenelement (eq. 2a-c). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c BEMÆRK: Skabeloner til beregning af kalibreringsparameteren leveres som supplerende filer (S7).</li>
		<li>Spektral krydstale α af det grønne fluorescenssignal (indsamlet i kanal 0 og 2) i de røde detektionskanaler (kanal nummer 1 og 3) som et forhold mellem de baggrundskorrigerede (BG)-signaler (eq. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>Bestem den direkte excitation af acceptorfluoriorten δ af donor excitation bølgelængden ved forholdet mellem baggrundskorrigeret optællingshastighed for de røde kalibreringsmålinger i tidsvinduet "prompt" (excitation ved grøn laser) til den baggrundskorrigerede tællehastighed i tidsvinduet "forsinkelse" (excitation ved rød laser) (eq. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>Den molekylære lysstyrke B beregnes på basis af baggrundskorrigerede tællehastigheder og det opnåede antal molekyler i fokus, N, fra 3D-diffusionsanfaldet (eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>Der er plads til både ACFgp og ACFrd samt CCFPIE af det dobbeltmærkede DNA til 3D-diffusionsmodellen (eq. 1). Hold de opnåede formfaktorer, sgrøn og rød , konstant for henholdsvis ACFgp og ACFrd. Figurfaktoren for CCFPIE, sPIE , er normalt mellem disse to værdier. BEMÆRK: I en ideel opsætning, både Veff,grøn og Veff, rød ville have samme størrelse og overlappe perfekt.</li>
		<li>Bestem amplituden ved nul korrelationstid, G0(tc), baseret på de fundne værdier af det tilsyneladende antal molekyler i fokus (Ngrøn, Nrød og NPIE).</li>
		<li>Amplitudforholdet rGR og rRG beregnes for en prøve med 100% co-diffusion af grønne og røde fluorophorer (eq. 6). Vær opmærksom på, at NPIE ikke afspejler antallet af dobbeltmærkede molekyler i fokus, men kun afspejler 1 /G0(tc). <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">og <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Eksperimenter med levende celler<ol><li>For konstruktioner med en enkelt etiket skal celleeksemplerne tilpasses en passende model. For den viste membran receptor, diffusion sker i en bimodal måde med en kort og en lang diffusion tid. Derudover skal fotofysikken og blinkende af fluorophorerne overvejes: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 Her er td1 og td2 de to krævede diffusionstider, og en1 er den brøkdel af den første diffusionstid. BEMÆRK: I modsætning til kalibreringsmålingerne, hvor de frie farvestoffer og DNA-strenge frit diffuserer i alle retninger, viser membranreceptoren kun 2D-diffusion langs cellemembranerne. Denne forskel mellem 3D- og 2D-diffusion afspejles af det ændrede diffusionsudtryk (sammenlign eq. 1), hvor tD i 2D-sagen ikke afhænger af formfaktorerne for det konfokale volumenelement.</li>
		<li>Koncentrationen c af grønne eller røde mærkede proteiner beregnes ud fra de respektive N- og V-eff ved hjælp af grundtetik (eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 hvor NA = Avogadros nummer</li>
		<li>For N-terminal SNAP-etiket og intracellulær eGFP skal de to autokorrelationer (ACFgp og ACFrd)for den dobbeltmærkede prøve ved hjælp af samme model som for de enkeltmærkede konstruktioner for AIF'erne (eq. 7) og CCFPIE ved hjælp af en tomodal diffusionsmodel (eq. 9): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 BEMÆRK: For en global beskrivelse af systemet skal alle tre kurver være i form i fællesskab: Diffusionsudtryk er identisk for alle tre kurver, og den eneste forskel er afslapningsbetegnelsen for CCFPIE. Da fotofysik af to fluorophorer er normalt uafhængige, ingen korrelation sigt er påkrævet. Denne mangel på afslapning vilkår resulterer i en flad CCFPIE på korte korrelation gange. Krydstale og direkte excitation af acceptoren på grund af donorfluoriphen kan dog vise falsk-positive amplituder og bør kontrolleres omhyggeligt for at bruge kalibreringsmålingerne.</li>
		<li>Koncentrationen c af grønne eller røde mærkede proteiner ud fra de respektive N- og V-eff ved hjælp af ligning 8.</li>
		<li>Skøn over fraktionen eller koncentrationen, cGR eller cRG, af interagerende grønne og røde mærkede proteiner fra celleprøverne ved hjælp af de korrektionsfaktorer, der er opnået fra DNA-prøverne, amplitudforhold rGR og rRG i celleprøven og deres respektive opnåede koncentrationer (eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> og <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>For C-terminal SNAP-etiket og intracellulær eGFP skal du passe til de to autokorrelationer (ACFgp og ACFrd)i FRET-prøven som enkeltmærkede prøver (ligning 7) og CCFFRET til en bimodal diffusionsmodel, der indeholder et antikorrelationsudtryk (ligning 11) <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 hvor enf afspejler amplituden af den samlede antikorrelation og enR og tR den respektive amplitud og afslapningstid. BEMÆRK: I tilfælde af antikorrelerede fluorescensændringer som følge af FRET kan der være behov for et eller flere korrelationsbegreber (eq. 11), hvilket resulterer i et "dyk" af CCFFRET ved lave korrelationstider, der falder sammen med en stigning i de to autokorrelationer (ACFgp og ACFrd). Vær dog opmærksom på, at fotofysik som triplet blinkende kan maskere antikorrelationsudtryk ved at dæmpe den FRET-inducerede antikorrelation. En fælles analyse suppleret med filtrerede FCS-metoder kan bidrage til at afsløre antikorrelationsbegrebet. Derudover bør tekniske artefakter, der stammer fra døde tider i tælleelektronik i nanosekunder rækkevidde udelukkes16. En mere detaljeret trinvis procedure for, hvordan analysen udføres i ChiSurf28 og skabeloner til beregning af konfokal volumen eller molekylær lysstyrke, findes på Github-lageret (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) og som supplerende filer (supplerende note 4 og supplerende note 6). Derudover kan python-scripts til batcheksport af data erhvervet med Symphotime-softwaren i .ptu-format findes der.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne har ingen konflikter at erklære.

Fluorescensspektroskopi er en af de vigtigste metoder til at kvantificere proteindynamik og proteinproteininteraktioner med minimal forstyrrelser i en cellulær sammenhæng. Konfokal fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) er en af de kraftfulde metoder til at analysere molekylær dynamik, da det er enkelt-molekyle følsomme, meget selektiv, og levende celle kompatibel1. Sammenlignet med andre dynamik-orienterede tilgange, FCS har en bredere målbar tidsinterval spænder fra ~ ns til ~ s, vigtigst dækker de hurtige tidsskalaer, der ofte er utilgængelige ved billedbehandling-baserede metoder. Desuden giver det også rumlig selektivitet, så membran, cytoplasmisk og kerne molekylær dynamik let kan skelnes 2. Molekylær blink, den gennemsnitlige lokale koncentration og diffusionskoefficienten kan således analyseres kvantitativt med FCS. Intermolekylær dynamik såsom binding bliver let tilgængelig, når sondering co-diffusion af to molekylære arter i fluorescens krydskorrelation spektroskopi (FCCS) analyse3,4,5 i en tofarvet tilgang.
Det vigtigste underliggende princip i korrelationsspektroskopi er den statistiske analyse af intensitetsudsving, der udsendes af fluorescerende mærkede biomolekyler, der spreder sig ind og ud af et laserfokus (Figur 1A). De resulterende auto- eller krydskorrelationsfunktioner kan derefter analyseres yderligere ved kurvemontering for i sidste ende at udlede rentekonstanter af interesse. Med andre ord giver de statistiske metoder FCS og FCCS ikke enkeltmolekylespor som i enkelt partikelsporing, men et dynamisk mønster eller "fingeraftryk" af en undersøgt prøve med høj tidsmæssig opløsning. Når det kombineres med Förster resonans energioverførsel (FRET), intramolekylær dynamik såsom kropsbygning ændringer kan overvåges på samme tid i en fælles confocal setup5,6. FRET sonder afstanden mellem to fluorophorer og kaldes ofte en molekylær "nanoruler". Energioverførsel finder kun sted, når molekylerne er i nærheden (< 10 nm), donorens emissionsspektrum overlapper signifikant med acceptmolekylets absorptionsspektrum, og donorens og acceptorens dipoloris orientering er (tilstrækkeligt) parallel. Således giver kombinationen af FRET og FCCS en teknik med meget høj spatio-temporal opløsning. Når rumlig selektivitet, følsomhed samt levende celle kompatibilitet er påkrævet, FRET-FCCS har indlysende fordelagtige i forhold til andre metoder såsom Isoterm titrering Calorimetry (ITC)7, Surface Plasmon Resonans (SPR)8, eller Nuclear Magnetic Resonance (NMR)9,10 til måling af protein dynamik og interaktioner.
På trods af evnerne og løftet om dual-color fluorescens krydskorrelation spektroskopi (dc-FCCS), udfører dc-FCCS i levende celler er teknisk udfordrende på grund af spektrale bleed-through eller krydstale mellem kanalerne3,4, forskellen i confocal mængder på grund af spektralt forskellige laser linjer3,4,11, baggrundssignal, og støj eller begrænset fotostabilitet af prøverne12, 13,14,15. Indførelsen af puls interleaved excitation (PIE) til FCCS var en vigtig tweak at tidsmæssigt afkoble de forskellige laser excitationer for at reducere den spektrale krydstale mellem kanalerne16. Andre korrektionsmetoder til imødegåelse af spektrale gennemblødning17,18,19 og baggrundskorrektioner er også blevet godt accepteret17,18,19. For detaljer og grundlæggende om FCS, PIE eller FRET læseren henvises til følgende referencer2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Her præsenteres alle nødvendige kalibreringsforsøg og analyser sammen med de eksperimentelle resultater af en prototypisk G-protein koblet receptor, β 2-adrenergic receptor (β2AR), for tre forskellige scenarier: (1) enkeltmærkede molekyler, der bærer enten en "grøn" (eGFP) eller en "rød" (SNAP-tag-baseret mærkning)25 fluorophor; (2) en dobbeltmærket konstruktion, som bærer et N-terminal SNAP-tag og intracellulær eGFP (NT-SNAP) [i dette tilfælde er begge etiketter på samme protein. Der forventes således 100 % co-diffusion]; og (3) en dobbeltmærket prøve, hvor begge fluorheste er på samme side af cellemembranen (CT-SNAP). Det bærer en C-terminal SNAP-tag og en intracellulær eGFP. Her er begge etiketter igen på samme protein med igen 100% co-diffusion forventes. Da begge etiketter er meget tæt på hinanden, på samme side af cellemembranen, viser det potentialet til at observere FRET og antikorreleret adfærd. Alle konstruktioner blev transficeret i kinesiske Hamster Ovary (CHO) celler og senere mærket med en rød fluorescerende substrat, som er membran-uigennemtrængelig for NT-SNAP konstruktion og membran-permeable for CT-SNAP konstruktion. Endelig eksemplificerer simulerede data eksperimentelle parametres indflydelse på den FRET-inducerede antikorrelation og effekten af protein-proteininteraktioner på co-diffusions amplituden.
Således giver denne protokol en komplet guide til at udføre den kombinerede FRET-FCCS i levende celler for at forstå proteindynamik og protein-protein interaktioner, samtidig med at du gør opmærksom på tekniske / fysiske artefakter, udfordringer og mulige løsninger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Vi præsenterer en protokol og arbejdsgang til at udføre levende celle dual-color fluorescens krydskorrelation spektroskopi (FCCS) kombineret med Förster Resonans Energioverførsel (FRET) til at studere membran receptor dynamik i levende celler ved hjælp af moderne fluorescens mærkning teknikker. I dual-color FCCS, hvor udsvingene i fluorescensintensiteten repræsenterer det dynamiske "fingeraftryk" af den respektive fluorescerende biomolekyle, kan vi sonde co-diffusion eller binding af receptorerne. FRET, med sin høje følsomhed over for molekylære afstande, tjener som en velkendt "nanoruler" til at overvåge intramolekylære ændringer. Samlet set bliver kropslige ændringer og nøgleparametre såsom lokale receptorkoncentrationer og mobilitetskonstanter tilgængelige i cellulære indstillinger.
Kvantitative fluorescens tilgange er udfordrende i celler på grund af høje støjniveauer og sårbarheden af prøven. Her viser vi, hvordan du udfører dette eksperiment, herunder kalibreringstrinene ved hjælp af dual-color mærket β2-adrenergic receptor (β2AR) mærket med eGFP og SNAP-tag-TAMRA. Der tilbydes en trinvis dataanalyseprocedure ved hjælp af open source-software og skabeloner, der er nemme at tilpasse.
Vores retningslinje gør det muligt for forskere at optrævle molekylære interaktioner af biomolekyler i levende celler in situ med høj pålidelighed på trods af de begrænsede signal-til-støj-niveauer i levende celleforsøg. FRET's operationelle vindue og især FCCS ved lave koncentrationer muliggør kvantitativ analyse ved næsten fysiologiske forhold.

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Vi præsenterer en eksperimentel protokol og dataanalyse workflow til at udføre levende celle dual-color fluorescens kryds korrelation spektroskopi (FCCS) kombineret med Förster Resonans Energioverførsel (FRET) til at studere membran receptor dynamik i levende celler ved hjælp af moderne fluorescens mærkning teknikker.

Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Fluorescens krydskorrelation spektroskopi er en statistisk metode, der bruger tid resultat fluorescens til at lokalisere den dynamiske signatur af G protein-koblede receptorer i levende celler. Her er vi særligt interesserede i beta-2 adrenergic receptorer. Sphingolipid receptorer primært give oplysninger om translationel diffusion dynamik og ved hjælp af fluorescens anisotropi også rotationsspredning.Ved at indføre en ekstra etiket, kan vi også pro-bindende eller endda kropslige ændringer, hvis fremme resonans energioverførsel mellem etiketterne som undersøgt. Kvantitativ tid løst fluorescens kræver omhyggelig justering af opsætning og kalibrering målinger. I de følgende minutter vil vi give en eksperimentel vejledning for livscelle fluorescens korrelation spektroskopi, krydskorrelation spektroskopi, og Forster resonans energioverførsel af G protein-koblede receptorer, ved hjælp af klon stand tags og syntetisk flow kraft.Celle siddende og transfixing skal udføres under sterile forhold. Placer en ren dæksel slip vægtstang på en seks godt kultur plade, og vask det ned med steril fosfat buffer saltvand tilføje to ml celle kultur medium med phenol rød suppleret med 10% føtalt kvæg serum, 100 mikrogram, per amin penicillin og 100 mikrogram per ml streptomycin til hver brønd, og holde det til side. Tag CHO-cellerne, der dyrkes i samme medium med phenolrød ved 37 grader celsius i fem procent CO2 og vask dem med fem mL PBS for at fjerne de døde celler.Tilsæt to mL trypsin og inkuber i to minutter ved stuetemperatur. Fortynd datacellerne med otte mL medium med phenolrød og bland forsigtigt ved pipettering. Tæl cellerne i et Neubauer kammer og sidde cellerne på en tæthed af 150.000 celler pr godt i de seks godt kultur plade, der indeholder dækslet slip.Lad cellerne vokse i en inkubator i 24 timer for at opnå omtrentlig 80% sammenløb. Fortynd to mikrogram af det ønskede vektor-DNA. For eksempel CT SNAP eller NT SNAP, og seks mikroliter af denne transfection reagens i to separate rør.Hver indeholder 500 mikroliter reduceret serum medium for hver brønd og inkubere dem i fem minutter ved stuetemperatur. Bland de to opløsninger sammen for at opnå transfectionblandingen og inkuber den i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden skal du vaske de siddende CHO-celler en gang med steril PBS.Udskift PBS med en ml pr. brønd af phenolrødt fri medium, suppleret med 10% fosterkvægsserum og ingen antibiotika. Tilsæt hele konstruktionsblandingen af en ml dråbe klogt til hver brønd og inkuber cellerne natten over ved 37 grader i fem procent CO2. Ved mærkning fortyndes det relevante SNAP-substrat i et ML-medium suppleret med 10% fosterkvægsserum for at opnå en endelig koncentration af en mikromolar.Vask de transfected celler én gang med PBS og tilsæt en mL pr. brønd af en mikromolar SNAP substratopløsning. Inkubere cellerne i 20 minutter ved 37 grader i fem procent CO2. Vask cellerne tre gange med phenol rød fri medium, og tilsæt to mL pr godt phenol rød fri medium.Inkubere cellerne i 30 minutter ved 37 grader celsius i fem procent CO2. Dækslet af alle prøver overføres efterfølgende til billedkammeret, og der vaskes med 500 Microliter-billedbuffer. Tilføj 500 microliter imaging buffer, før du går til FRED FCS setup.FRED FCS setup er udstyret med en konfokal mikroskopi vand mål, to laser linjer, en tid quilter enkelt udenlandsk tælle system, to hybrid BMTs, og to aktier til foton indsamling og dataindsamling software. Det er meget vigtigt at justere opsætningen hver gang før måling i levende celler. For at justere fokus, pinhole og farveposition, placere to nanomolar grøn kalibrering løsning på et glas dække slip og tænde 485 nanometer og 560 nanometer laser drives i bunker, interleaved excitation eller PI-tilstand.Fokuser på opløsningen og juster pinhole og krave ring position således, at den højeste tællehastighed og mindste konfokale volumen opnås for at få den maksimale molekylære lysstyrke. Gentag denne proces for de røde kanaler med 10 nanomolar rød kalibreringsopløsning og en blanding af begge dele. Placer 10 nanomolar DNA-løsning på glasdæksel slip, og justere fokus pinhole og krave ring position således, at krydse farver i mellem den grønne og røde detektion kanaler er højest.Det er kilden den højeste amplitude. Til målinger i levende celler skal du finde en passende celle ved at begrænse med markørlampen og observere gennem okulæren. Tænd begge lasere i PI-tilstand og fokuser på membranen ved at kigge efter de maksimale antal pr. Sekund.Bemærk, at lasereffekten muligvis skal reduceres for celleprøverne. Helst mindre end fem mikrowatt med det formål. Dette afhænger i høj grad af den anvendte blomster og opsætningen.Overhold auto og cross coll kurver af beta-2 AR bundet til EGP og snap tag sonder i online preview af dataindsamling software og indsamle flere sortering målinger med en erhvervelse tid mellem 60 til 180 sekunder. Eksporter korrelationskurset og kontrasten fra alle målinger. Vær opmærksom her for korrekt at definere prompt og forsinkelsestid vinduer og bruge nogle mikro tid at få mulighed i data korrelation software.I alt kræves der tre forskellige korrelationer. Automatisk korrelation af det grønne kanals prompttidsvindue. Automatisk korrelation mellem de røde kanaler og forsinkelsestidsvinduet.Og endelig krydskorrelationen af det grønne kanalsignal, og prompttidsvinduet var det røde kanalsignal i forsinkelsestidsvinduet. Her er den automatiske korrelationsfunktioner i den grønne og røde FRED for løsninger og passer dem til en 3 DT diffusionsmodel med en ekstra tredobbelt sigt, der kræves for at kalibrere formen og størrelsen af det konfokale detektionsvolumen for de to brugsfarvekanaler, hvor B er kurvens grundlinje og antallet af molekyler og fokus, TD diffusion tid og S, nul over omega nul formfaktoren af den konfokale volumen element. Triplet blinkende og fotofysik er beskrevet som amplitude AR og afslapning tid TR. Brug den kendte diffusionskoefficient til de grønne og røde kalibreringsudtag og opnå formfaktorer til at bestemme dimensionerne og volumenet af det infektiøse confocal volumenelement.Beregn spektret på tværs af som IFR, det grønne fluorescerende signal indsamlet på kanal nuller, og to i den rigtige detektionskanal, kanal et og tre, som et forhold mellem baggrunden indsamlede signaler. Bestem den direkte forventning om acceptorstrømmen af data af donor excitation bølgelængder ved forholdet mellem baggrunden indsamlet kontrast af den røde kalibrering målinger og prompt time window excitation af grøn laser til baggrunden korrekt konto lige i forsinkelsen tid vindue excitation af rød laser. Beregn den molekylære lysstyrke af B både den grønne og røde flow kraft baseret på baggrunden indsamlet kontrast, og at opnå antallet af molekyler og fokusere på 3 DT diffusion fit.Passer både ultra korrelationer fra den grønne og røde kanal, samt på tværs af korrelation fra den grønne prompt og rød forsinkelse af dobbelt niveau DNA til 3 DT diffusion model holder opnå formede faktorer konstant for auto korrelation funktioner. Figurfaktoren for krydskorrelationsfunktionerne er normalt mellem disse to værdier. Bestem amplituden ved nul korrelationstid baseret på skrifttypeværdierne for det tilsyneladende antal molekyler og fokus.Beregn amplitud forholdet for en prøve var en 100% co-diffusion af grøn og rød gulv kraft. Sæt celleprøverne i en passende model. Hvordan de er vist membran receptor diffusion ikke nysgerrig i en bi-modal måde var en kort, ingen lang diffusion tid.Derudover skal fotofysikken og blinke ud af gulvkraften overvejes. Her til TD1 og TD2, er de to, der kræves for at diffusion gange. Og en en er en brøkdel af den første diffusionstid I modsætning til kalibreringsmålingen, hvor de frie terninger og DNA-strenge diffusion, alle retninger, viser membranreceptorer kun 2D-diffusion langs cellemembranerne beregner koncentrationen af grønne eller røde etiketproteiner ud fra respekt for antal molekyler og fokus.Og mængden af det konfokale volumenelement ved hjælp af biasing masse. Passer til de to alt korrelationer af dobbelt-mærket prøve ved hjælp af den samme model som for det enkelte niveau konstruere og cross korrelation funktion ved hjælp af en bi-modal diffusion model, Note for en global beskrivelse af systemet. Alle tre afgrøder skal være i form i fællesskab.Diffusionsudsen er identisk for alle tre afgrøder. Og den eneste forskel er et omdømme tid falder, cross korrelation funktion. Beregn koncentrationen af grønne eller røde arbejdsproteiner ud fra det respektive antal molekyler og fokus og volumenet af det konfokale volumenelement.Skøn fraktionen eller koncentrationen af interagerende grønne og røde etiketproteiner fra celleprøverne ved hjælp af de korrektionsfaktorer, der er opnået fra DNA-prøverne, amplitudforholdet for celleprøven og de respektive opnåede koncentrationer. Sæt de to alterkorrelationer af FRED-prøven som en enkelt mærket prøver og den forreste krydskorrelation til en tomodal diffusionsmodel, der indeholder et antikorrelationsudtryk, hvor AF afspejler amplituden af den samlede antikorrelation og AR og TR den respektive amplitud og afslapningstid. I tilfælde af antikorreleret fluorescens kan der være behov for et eller flere antikorrelationsbegreber, hvilket resulterede i et dyk i Fred cross correlation-funktionen ved lave korrelationstider, der faldt sammen med en stigning i de to automatiske korrelationsfunktioner.Kalibreringsmålingerne af de grønne og røde blomsterløsninger til barberingsfaktorer på 6,5 og de grønne kanaler og 6,8 i de røde kanaler. Således har det konfokale volumen en størrelse på 1,4 og 1,9 femto senere på denne måledag, molekylets lysstyrke ligger på 12,5 kilohertz pr. molekyle og 2,6 kilohertz pr. molekyle. Vi har 15% af krydstale fra den grønne blomster til i de røde kanaler efter donor excitation og 38% af direkte undtagen excitation af den røde blomsterform af den grønne, fra vores DNA-måling, vi bestemmer korrektion faktorer for confocal overlapper volumen til 0,6 og 0,7 også, cellerne transfected med enkelt etiket konstruktion viser to-modal todimensionel diffusion på cellemembranen, hvor omkring halvdelen af molekylerne diffuse langsomt på tidsskalaen 50 til hundrede millisekunder og den anden halvdel relativt hurtigt omkring to millisekunder i begge konstruktioner.Derudover er triplet blinkende til stede. Men i det røde niveau snap konstruere en anden afslapning tid er erhvervet på 180 mikrosekunder, som kan stamme fra ubundet snap straight. Fra selve dobbeltmærket, omskåret med anti snap-konstruktionen, hvor de to etiketter på to forskellige sider af cellemembranen er to mindre målinger blevet indsamlet støjen og den røde frakke på korrelationen.Og PI cross korrelation er ret høj her. Her 70% af molekylerne, hvis du langsomt under hundrede millisekunder tidsskala, og kun 30% hurtigt omkring et millisekund, fraktionen af dobbelt frigøre molekyler er lav og ligger mellem 15 til 25%Dataene for CT snap ser bedre ud, og det er mindre støjende. Den forventede front dybeste antikorrelation kan imidlertid ikke ses og er sandsynligvis masse ved den store mængde krydstale, direkte acceptere excitation og triplet blinkende af både blomsterkraft, og når dataanalyseordninger, der udnytter den indsamlede fluorescensintensitet, kan DKS bidrage til at redde dette som vist for det simulerede datasæt.Fordelen ved Fred FCS teknik er, at vi sammen med mobilitet kan undersøge konferencedynamikken i GPCR'er. Men at udføre FRED FCs i laboratorier er udfordrende og anmoder om gode transfected celler, effektiv mærkning og en perfekt kalibreret opsætning. Bare en FRED par pro kraft er også meget afgørende.Kritiske eksperimentelle trin omfatter optimering af transfection optimering, minimering af baggrunden, og auto fluorescens. Derudover og Atomer analyse pipeline vil bidrage til at forstå de forskellige dynamikker af forskrifter i levende celler. Vi håber, at denne protokol vil være nyttig udføre FRED FCS tilgang i levende celler eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering af protein-protein interaktion i nukleare og Cytoplasmiske Brøker af Co-immunopræcipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligeringsassayet

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...