Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Ce projet a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, numéro de projet 374031971, projet INF) à J.B. et K.G.H.
Nous remercions le Centre Rudolf Virchow pour son soutien financier et l’imagerie par fluorescence de l’unité centrale pour son soutien technique. De plus, nous remercions Ashwin Balakrishnan pour sa relecture approfondie.

1. Protocole expérimental
<ol><li>Préparation des échantillons REMARQUE: Effectuer l’ensemencement cellulaire et la transfection dans des conditions stériles.<ol>
<li>Placez un couvercle nettoyé par puits dans une plaque de culture de 6 puits et lavez trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). REMARQUE: Le protocole de nettoyage du couvercle est détaillé dans la note supplémentaire 1.</li>
		<li>À chaque puits, ajouter 2 mL du milieu de culture cellulaire complet contenant du phénol rouge (complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 μg/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) et garder la plaque de côté.</li>
		<li>Culture des cellules CHO dans le même milieu contenant du rouge phénolique à 37 °C et 5 % de CO2. Lavez les cellules avec 5 mL de PBS pour éliminer les cellules mortes.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de trypsine et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Diluer les cellules détachées avec 8 mL de milieu contenant du rouge phénol et mélanger soigneusement par pipetage.</li>
		<li>Compter les cellules dans une chambre de Neubauer et les grainer à une densité de 1,5 x 105 cellules/puits dans la plaque de culture cellulaire à 6 puits contenant les couvercles (préparée à l’étape 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>Laissez les cellules se développer dans un incubateur (37 °C, 5% de CO2)pendant 24 h afin d’obtenir environ 80% de confluence.</li>
		<li>Diluer 2 μg de l’ADN vecteur désiré (p. ex. CT-SNAP ou NT-SNAP) et 6 μL du réactif de transfection dans deux tubes séparés, chacun contenant 500 μL du milieu sérique réduit pour chaque puits et incuber pendant 5 min à TA.</li>
		<li>Mélanger les deux solutions ensemble pour obtenir le mélange de transfection et l’incuber pendant 20 min à TA.</li>
		<li>En attendant, lavez les cellules CHO ensemencées une fois avec du PBS stérile.</li>
		<li>Remplacer le PBS par 1 mL/puits de milieu sans phénol sans rouge complété par 10% de FBS sans antibiotiques.</li>
		<li>Ajouter la totalité de 1 mL de mélange de transfection goutte à goutte à chaque puits et incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C, dans 5 % de CO2.</li>
		<li>Pour l’étiquetage de la construction SNAP, diluer la solution mère de substrat SNAP appropriée dans 1 mL du milieu complété par 10% fbS pour obtenir une concentration finale de 1 μM.</li>
		<li>Lavez les cellules transfectées une fois avec du PBS et ajoutez 1 mL par puits de solution de substrat SNAP de 1 μM. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 °C dans 5% de CO2.</li>
		<li>Lavez les cellules trois fois avec un milieu sans rouge phénol et ajoutez 2 mL par milieu sans phénol rouge. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 °C dans 5% de CO2.</li>
		<li>Transférez ensuite les couvercles de tous les échantillons dans la chambre d’imagerie et lavez-les avec un tampon d’imagerie de 500 μL. Ajoutez un tampon d’imagerie de 500 μL avant de passer à la configuration FRET-FCS.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesures d’étalonnage REMARQUE: La configuration FRET-FCS est équipée d’un objectif d’eau de microscope confocal, de deux lignes laser, d’un système tcSPC (Time-Correlated Single Photon Counting), de deux tubes photomultiplicateurs hybrides (PMT) et de deux photodiodes d’avalanche (APD) pour la collecte de photons et le logiciel de collecte de données. Il est très important d’aligner la configuration à chaque fois avant les mesures de cellules vivantes. La description détaillée de la configuration se trouve dans la note supplémentaire 2. Les lasers et tous les détecteurs (deux PMT et deux APM) sont toujours allumés pendant les mesures, car toutes les mesures doivent être effectuées dans des conditions identiques. Pour les mesures d’étalonnage, utilisez un couvercle du même lot sur lequel les cellules ont été ensemencées, ce qui diminue la variation de la correction de l’anneau du collier.<ol>
<li>Pour régler la position de la mise au point, du sténopé et de l’anneau de collier, placez la solution d’étalonnage verte 2 nM sur un couvercle en verre et allumez le laser 485 nm et 560 nm. Utiliser le laser en mode PIE (Pulsed Interleaved Excitation)16.</li>
		<li>Concentrez-vous sur la solution et ajustez la position du sténopé et de l’anneau du collier de manière à obtenir le taux de comptage le plus élevé et le plus petit volume confocal pour obtenir la luminosité moléculaire maximale.</li>
		<li>Répétez ce processus pour les canaux rouges avec une solution d’étalonnage rouge de 10 nM et un mélange des deux, la solution d’étalonnage verte et rouge.</li>
		<li>Placez la solution d’ADN de 10 nM sur un couvercle en verre et ajustez la position de la mise au point, du sténopé et de l’anneau de collier de manière à ce que la corrélation croisée entre les canaux de détection vert et rouge soit la plus élevée, c’est-à-dire qu’elle montre la plus grande amplitude. REMARQUE: Les étapes 1.2.1 et 1.2.4 peuvent devoir être répétées d’avant en arrière pour trouver l’alignement optimal. Prenez 3 à 5 mesures de chaque solution d’étalonnage pendant 30 à 120 s après que la position de la mise au point, du sténopé et de l’anneau du collier a été alignée de manière optimale pour les canaux de détection verts et rouges et le volume de chevauchement confocal.</li>
		<li>Mesurez une goutte de ddH2O, le milieu d’imagerie, et une cellule non transfectée 3 à 5 fois chacune pendant 30 s à 120 s pour déterminer les taux de comptage de fond.</li>
		<li>Collectez la fonction de réponse de l’instrument avec 3-5 mesures pendant 30 s - 120 s. Ceci est facultatif mais fortement recommandé.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesures de cellules vivantes<ol>
<li>Trouvez une cellule appropriée en éclairant avec la lampe au mercure et en observant à travers l’oculaire. REMARQUE: Les cellules appropriées sont vivantes montrant la morphologie typique de la lignée cellulaire adhérente respective. La fluorescence de la protéine d’intérêt, ici un récepteur de surface, est visible sur toute la surface. Les cellules moins brillantes conviennent mieux que les cellules plus brillantes en raison du meilleur contraste dans FCS lorsqu’un faible nombre de molécules sont au point.</li>
		<li>Allumez les deux lasers en mode PIE et concentrez-vous sur la membrane en regardant le nombre maximal par seconde. REMARQUE: La puissance du laser peut devoir être réduite pour les échantillons de cellules (moins de 5 μW à l’objectif). Cela dépend des fluorophores utilisés et de la configuration.</li>
		<li>Observez les courbes d’auto- et de corrélation croisée de l’eGFP ou de l’étiquette SNAP-tag attachée à la β2AR dans l’aperçu en ligne du logiciel de collecte de données et collectez plusieurs mesures courtes (~2 -10) avec un temps d’acquisition compris entre 60 et 180 s. REMARQUE: N’excitez pas les cellules pendant une longue période en continu car les fluorophores peuvent blanchir. Cependant, cela dépendra de la luminosité de chaque cellule, de la durée des mesures et du nombre total de mesures pouvant être effectuées.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse des données
<ol><li>Exportation de données<ol>
<li>Exportez les courbes de corrélation, G(tc), et les taux de comptage, CR, de toutes les mesures.</li>
		<li>Veillez à définir correctement les fenêtres de temps « invite » et « retard » et utilisez l’option « microtime gating » dans le logiciel de corrélation de données. REMARQUE: Au total, trois corrélations différentes sont requises: (1) autocorrélation du canal vert dans la fenêtre de temps d’invite (ACFgp), (2) autocorrélation des canaux rouges dans la fenêtre de temps de retard (ACFrd), et enfin (3) la corrélation croisée du signal de canal vert dans la fenêtre de temps d’invite avec le signal de canal rouge dans la fenêtre de temps de retard (CCFPIE). L’exportation des données est présentée étape par étape pour différents logiciels dans la note supplémentaire 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesures d’étalonnage<ol><li>Utilisez les fonctions d’autocorrélation des solutions de fluorophores vertes (ACFgp) et rouges(ACFrd),et adaptez-les à un modèle de diffusion 3D avec un terme triplet supplémentaire si nécessaire (eq. 1) pour calibrer la forme et la taille du volume de détection confocale pour les deux canaux de couleur utilisés: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 Ici, b est la ligne de base de la courbe, N le nombre de molécules focales, tD le temps de diffusion (en ms), et s = z0/w0 le facteur de forme de l’élément de volume confocal. Le triplet clignotant ou autre photophysique est décrit par son amplitude aR et son temps de relaxation tR. REMARQUE : Toutes les variables et tous les symboles utilisés dans le protocole sont répertoriés dans le tableau 1.</li>
		<li>Utilisez les coefficients de diffusion connus D pour l’étalon d’étalonnage vert26 et rouge27 et les facteurs de forme obtenus svert et srouge pour déterminer les dimensions (largeur w0 et hauteur z0) et volume Veff de l’élément de volume confocal (eq. 2a-c). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c REMARQUE: Les modèles de calcul du paramètre d’étalonnage sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires (S7).</li>
		<li>Calculer la diaphonie spectrale α du signal de fluorescence vert (collecté dans les canaux 0 et 2) dans les canaux de détection rouges (canaux numéros 1 et 3) en tant que rapport des signaux corrigés de fond (BG) (eq. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>Déterminer l’excitation directe du fluorophore accepteur δ par la longueur d’onde d’excitation du donneur par le rapport entre le taux de comptage corrigé du fond des mesures d’étalonnage rouge dans la fenêtre de temps « rapide » (excitation par laser vert) et le taux de comptage corrigé de fond dans la fenêtre de temps « retard » (excitation par laser rouge) (eq. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>Calculer la luminosité moléculaire B des fluorophores verts et rouges (eq. 5a-b) en fonction des taux de comptage corrigés du fond et du nombre obtenu de molécules en focus, N, à partir de l’ajustement de diffusion 3D (eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>Adapter à la fois ACFgp et ACFrd ainsi que CCFPIE de l’ADN double marqué au modèle de diffusion 3D (eq. 1). Gardez les facteurs de forme obtenus, svert et srouge,constants pour ACFgp et ACFrd, respectivement. Le facteur de forme pour le CCFPIE, sPIE, se situe généralement entre ces deux valeurs. REMARQUE: Dans une configuration idéale, Veff,vert et Veff, le rouge aurait la même taille et se chevaucherait parfaitement.</li>
		<li>Déterminer l’amplitude au temps de corrélation zéro, G0(tc),en fonction des valeurs trouvées du nombre apparent de molécules focales(Nvert, Nrouge et NPIE).</li>
		<li>Calculer le rapport d’amplitude rGR et rRG pour un échantillon avec une co-diffusion à 100% de fluorophores verts et rouges (eq. 6). Sachez que NPIE ne reflète pas le nombre de molécules à double marque focalisé mais ne reflète que le 1/G0(tc). <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">et <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Expériences sur des cellules vivantes<ol><li>Pour les constructions à étiquette unique, ajustez les échantillons de cellules à un modèle approprié. Pour le récepteur membranaire montré, la diffusion se produit de manière bimodale avec un temps de diffusion court et long. De plus, la photophysique et le clignotement des fluorophores doivent être pris en compte: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 Ici, td1 et td2 sont les deux temps de diffusion requis, et un1 est la fraction du premier temps de diffusion. REMARQUE: Contrairement aux mesures d’étalonnage, dans lesquelles les colorants libres et les brins d’ADN diffusent librement dans toutes les directions, le récepteur membranaire ne montre qu’une diffusion 2D le long des membranes cellulaires. Cette différence entre la diffusion 3D et la diffusion 2D est reflétée par le terme de diffusion modifié (comparer eq. 1), où tD dans le cas 2D ne dépend pas du facteur de forme s de l’élément de volume confocal.</li>
		<li>Calculer la concentration c de protéines vertes ou rouges à partir de l’eff N et V respectifs en utilisant les mathématiques de base (eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 où NA = nombre d’Avogadro</li>
		<li>Pour l’étiquette SNAP N-terminale et l’eGFP intracellulaire, ajuster les deux autocorrélations(ACFgp et ACFrd)de l’échantillon à double étiquette en utilisant le même modèle que pour les constructions à étiquette unique pour les ACF (eq. 7) et le CCFPIE en utilisant un modèle de diffusion bimodale (eq. 9): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 REMARQUE: Pour une description globale du système, les trois courbes doivent être ajustées conjointement: Le terme de diffusion est identique pour les trois courbes et la seule différence est le terme de relaxation pour le PIECCF. Comme la photophysique de deux fluorophores n’est généralement pas liée, aucun terme de corrélation n’est requis. Cette absence de termes de relaxation se traduit par un PIE CCF plat à des temps de corrélation courts. Cependant, la diaphonie et l’excitation directe de l’accepteur due au fluorophore donneur peuvent montrer des amplitudes faussement positives et doivent être soigneusement vérifiées pour l’utilisation des mesures d’étalonnage.</li>
		<li>Calculer la concentration c de protéines vertes ou rouges à partir des effets N et V respectifs à l’aide de l’équation 8.</li>
		<li>Estimer la fraction ou la concentration, cGR ou cRG,des protéines vertes et rouges en interaction à partir des échantillons cellulaires en utilisant les facteurs de correction obtenus à partir des échantillons d’ADN, les rapports d’amplitude rGR et rRG de l’échantillon cellulaire et leurs concentrations respectives obtenues (eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> et <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>Pour l’étiquette SNAP C-terminal et l’eGFP intracellulaire, adapter les deux autocorrélations(ACFgp et ACFrd)de l’échantillon FRET en tant qu’échantillons monomarqués (équation 7) et fret CCF à un modèle de diffusion bimodale contenant un terme anti-corrélation (équation 11) <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 où unf reflète l’amplitude de l’anti-corrélation totale et unR et tR l’amplitude et le temps de relaxation respectifs. REMARQUE: En cas de changements de fluorescence anti-corrélés dus au FRET, un ou plusieurs termes anti-corrélation peuvent être nécessaires (eq. 11), ce qui entraîne un « creux » de CCFFRET à des moments de faible corrélation coïncidant avec une augmentation des deux autocorrélations(ACFgp et ACFrd). Cependant, sachez que la photophysique telle que le clignotement des triplets peut masquer le terme anti-corrélation en atténuant l’anti-corrélation induite par FRET. Une analyse conjointe complétée par des méthodes FCS filtrées pourrait aider à démasquer le terme anti-corrélation. En outre, les artefacts techniques provenant de temps morts dans l’électronique de comptage dans la gamme des nanosecondes doivent être exclus16. Une procédure étape par étape plus détaillée sur la façon d’effectuer l’analyse dans ChiSurf28 et des modèles pour le calcul du volume confocal ou de la luminosité moléculaire sont fournis sur le référentiel Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) et sous forme de fichiers supplémentaires(Note supplémentaire 4 et Note supplémentaire 6). De plus, les scripts python pour l’exportation par lots des données acquises avec le logiciel Symphotime au format .ptu s’y trouvent.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

La spectroscopie de fluorescence est l’une des principales méthodes pour quantifier la dynamique des protéines et les interactions protéine-protéine avec une perturbation minimale dans un contexte cellulaire. La spectroscopie de corrélation de fluorescence confocale (FCS) est l’une des méthodes puissantes pour analyser la dynamique moléculaire car elle est sensible à une seule molécule, hautement sélective et compatible avec les cellules vivantes1. Par rapport à d’autres approches axées sur la dynamique, FCS a une plage de temps mesurable plus large allant de ~ ns à ~ s, couvrant surtout les échelles de temps rapides qui sont souvent inaccessibles par les méthodes basées sur l’imagerie. De plus, il fournit également une sélectivité spatiale de sorte que la dynamique moléculaire membranaire, cytoplasmique et du noyau peut être facilement distinguée 2. Ainsi, le clignotement moléculaire, la concentration locale moyenne et le coefficient de diffusion peuvent être analysés quantitativement avec FCS. Les dynamiques intermoléculaires telles que la liaison deviennent facilement accessibles lors de la sondation de la codiffusion de deux espèces moléculaires dans l’analyse fccS (fluorescence cross-correlation spectroscopy)3,4,5 dans une approche bicolore.
Le principal principe sous-jacent de la spectroscopie de corrélation est l’analyse statistique des fluctuations d’intensité émises par des biomolécules étiquetées par fluorescence diffusant dans et hors d’un foyer laser(Figure 1A). Les fonctions d’auto- ou de corrélation croisée qui en résultent peuvent ensuite être analysées plus en détail par ajustement de courbe pour éventuellement dériver les constantes de taux d’intérêt. En d’autres termes, les méthodes statistiques FCS et FCCS ne fournissent pas de traces de molécule unique comme dans le suivi de particules uniques, mais un motif dynamique ou une « empreinte digitale » d’un échantillon sondé avec une résolution temporelle élevée. Lorsqu’il est combiné avec le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET), la dynamique intramoléculaire telle que les changements conformationnels peut être surveillée en même temps dans une configuration confocale commune5,6. FRET sonde la distance de deux fluorophores et est souvent appelé un « nanorègleur » moléculaire. Le transfert d’énergie n’a lieu que lorsque les molécules sont à proximité (< 10 nm), que le spectre d’émission du donneur chevauche de manière significative le spectre d’absorption de la molécule accepteur et que l’orientation dipolaire du donneur et de l’accepteur est (suffisamment) parallèle. Ainsi, la combinaison de FRET et FCCS fournit une technique à très haute résolution spatio-temporelle. Lorsque la sélectivité spatiale, la sensibilité ainsi que la compatibilité des cellules vivantes sont requises, FRET-FCCS présente un avantage évident par rapport à d’autres méthodes telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC)7,la résonance plasmonique de surface (SPR)8ou la résonance magnétique nucléaire (RMN)9,10 pour mesurer la dynamique et les interactions des protéines.
Malgré les capacités et la promesse de la spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (dc-FCCS), l’exécution de dc-FCCS dans des cellules vivantes est techniquement difficile en raison du saignement spectral ou de la diaphonie entre les canaux3,4, de la différence dans les volumes confocaux due aux raies laser spectralement distinctes3,4,11, du signal de fond et du bruit ou de la photostabilité limitée des échantillons12, 13,14,15. L’introduction de l’excitation entrelacée par impulsions (PIE) au FCCS a été un ajustement important pour découpler temporellement les différentes excitations laser afin de réduire la diaphonie spectrale entre les canaux16. D’autres méthodes de correction pour contrer les purges spectrales17,18,19 et les corrections de fond ont également été bien acceptées17,18,19. Pour plus de détails et de bases sur FCS, PIE ou FRET, le lecteur est référé aux références suivantes2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Ici, toutes les expériences et analyses d’étalonnage nécessairesainsique les résultats expérimentaux d’un récepteur prototypique couplé à la protéine G, β récepteur 2-adrénergique (β 2 AR), pour trois scénarios différents sont présentés: (1) des molécules mono-étiquetées portant soit un fluorophore « vert » (eGFP) ou unfluorophore 25 « rouge » (marquage basé sur des étiquettes SNAP); (2) une construction à double marque, qui porte une étiquette SNAP N-terminale et une eGFP intracellulaire (NT-SNAP) [dans ce cas, les deux étiquettes sont à la même protéine. Ainsi, une co-diffusion à 100% est attendue]; et (3) un échantillon à double marque, où les deux fluorophores se trouvent du même côté de la membrane cellulaire (CT-SNAP). Il porte une étiquette SNAP C-terminal et un eGFP intracellulaire. Ici encore, les deux étiquettes sont à la même protéine avec à nouveau 100% de co-diffusion attendue. Comme les deux étiquettes sont très proches l’une de l’autre, du même côté de la membrane cellulaire, cela montre le potentiel d’observer le FRET et le comportement anticorrépendant. Toutes les constructions ont été transfectées dans des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) et plus tard étiquetées avec un substrat fluorescent rouge qui est imperméable à la membrane pour la construction NT-SNAP et perméable à la membrane pour la construction CT-SNAP. Enfin, les données simulées illustrent l’influence des paramètres expérimentaux sur l’anticorrélation induite par FRET et l’effet des interactions protéine-protéine sur l’amplitude de codiffusion.
Ainsi, ce protocole fournit un guide complet pour effectuer le FRET-FCCS combiné dans les cellules vivantes afin de comprendre la dynamique des protéines et les interactions protéine-protéine tout en prenant conscience des artefacts techniques / physiques, des défis et des solutions possibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Nous présentons un protocole et un flux de travail pour effectuer une spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (FCCS) de cellules vivantes combinée au transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) pour étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans les cellules vivantes à l’aide de techniques modernes de marquage par fluorescence. Dans le FCCS bicolore, où les fluctuations de l’intensité de fluorescence représentent l’empreinte dynamique de la biomolécule fluorescente respective, nous pouvons sonder la co-diffusion ou la liaison des récepteurs. FRET, avec sa haute sensibilité aux distances moléculaires, sert de « nanorègleur » bien connu pour surveiller les changements intramoléculaires. Pris ensemble, les changements conformationnels et les paramètres clés tels que les concentrations locales de récepteurs et les constantes de mobilité deviennent accessibles dans les environnements cellulaires.
Les approches quantitatives de fluorescence sont difficiles dans les cellules en raison des niveaux de bruit élevés et de la vulnérabilité de l’échantillon. Nous montrons ici comment effectuer cette expérience, y compris les étapes d’étalonnage à l’aide durécepteur 2-adrénergique (β 2 AR) marqué en bicolore marqué β2AR et marqué avec eGFP et SNAP-tag-TAMRA. Une procédure d’analyse de données étape par étape est fournie à l’aide de logiciels open source et de modèles faciles à personnaliser.
Notre ligne directrice permet aux chercheurs de démêler les interactions moléculaires des biomolécules dans les cellules vivantes in situ avec une grande fiabilité malgré les niveaux limités de signal en bruit dans les expériences sur cellules vivantes. La fenêtre opérationnelle du FRET et en particulier du FCCS à de faibles concentrations permet une analyse quantitative dans des conditions quasi physiologiques.

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Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Nous présentons un protocole expérimental et un flux de travail d’analyse de données pour effectuer une spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (FCCS) de cellules vivantes combinée à un transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) pour étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans les cellules vivantes à l’aide de techniques modernes de marquage par fluorescence.

Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore pour étudier l’interaction protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

La spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence est une méthode statistique qui utilise la fluorescence par résultat temporel pour identifier la signature dynamique des récepteurs couplés à la protéine G dans les cellules vivantes. Ici, nous nous intéressons particulièrement aux récepteurs bêta-2 adrénergiques. Les récepteurs sphingolipides fournissent principalement des informations sur la dynamique de diffusion translationnelle et, à l’aide de l’anisotropie de fluorescence, également sur la diffusion rotationnelle.En introduisant une étiquette supplémentaire, nous pouvons également favoriser les changements contraignants ou même conformationnels si nous favorisons le transfert d’énergie de résonance entre les étiquettes telles qu’elles ont été sondées. La fluorescence quantitative résolue dans le temps nécessite un alignement minutieux des mesures de configuration et d’étalonnage. Dans les minutes qui suivent, nous fournirons un guide expérimental pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence des cellules de vie, la spectroscopie de corrélation croisée et le transfert d’énergie de résonance forster des récepteurs couplés aux protéines G, en utilisant des balises clonables et une force d’écoulement synthétique.L’assise cellulaire et la transfixation doivent être effectuées dans des conditions stériles. Placez une barre de glissement de couverture propre sur une plaque de culture à six puits et lavez-la avec une solution saline tampon phosphate stérile, ajoutez deux mL de milieu de culture cellulaire avec du rouge phénolique complété par 10% de sérum bovin fœtal, 100 microgrammes, par amine pénicilline et 100 microgrammes par ml de streptomycine à chaque puits, et gardez-le de côté. Prenez les cellules CHO qui sont cultivées dans le même milieu avec du rouge phénolique à 37 degrés centigrades dans cinq pour cent de CO2 et lavez-les avec cinq mL de PBS pour éliminer les cellules mortes.Ajouter deux mL de trypsine et incuber pendant deux minutes à température ambiante. Diluer les cellules de données avec huit mL de milieu avec du rouge phénol et mélanger soigneusement par pipetage. Comptez les cellules dans une chambre de Neubauer et asseyez-les à une densité de 150 000 cellules par puits dans la plaque de culture à six puits contenant le glissement de couverture.Laissez les cellules se développer dans un incubateur pendant 24 heures afin d’atteindre une confluence d’environ 80%. Diluer deux microgrammes de l’ADN vecteur désiré. Par exemple, CT SNAP ou NT SNAP, et six microlitres de ce réactif de transfection dans deux tubes séparés.Chacun contenant 500 microlitres de milieu sérique réduit pour chaque puits et les incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Mélanger les deux solutions ensemble pour obtenir le mélange de transfection et l’incuber pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. En attendant, lavez les cellules CHO assises une fois avec du PBS stérile.Remplacer le PBS par un ml par puits de milieu sans phénol rouge, complété par 10% de sérum bovin fœtal et sans antibiotiques. Ajouter tout le mélange de construction d’une goutte d’un ml à chaque puits et incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés dans cinq pour cent de CO2. Pour le étiquetage, diluer le substrat SNAP approprié dans un milieu mL complété par du sérum bovin fœtal à 10 % pour obtenir une concentration finale d’un micromolaire.Lavez les cellules transfectées une fois avec du PBS et ajoutez un mL par puits d’une solution de substrat SNAP micromolaire. Incuber les cellules pendant 20 minutes à 37 degrés dans cinq pour cent de CO2. Lavez les cellules trois fois avec un milieu sans phénol et ajoutez deux mL par puits en milieu sans phénol rouge.Incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades dans cinq pour cent de CO2. Transférez ensuite le couvercle de tous les échantillons dans la chambre d’imagerie et lavez-le avec un tampon d’imagerie de 500 microlitres. Ajoutez un tampon d’imagerie de 500 microlitres avant de passer à la configuration FRED FCS.La configuration FRED FCS est équipée d’un objectif d’eau de microscopie confocale, de deux lignes laser, d’un système de comptage étranger unique quilter temporel, de deux BMT hybrides et de deux actions pour la collecte de photons et le logiciel de collecte de données. Il est très important d’aligner la configuration à chaque fois avant la mesure dans les cellules vivantes. Pour régler la mise au point, le sténopé et la position de coloration, placez deux solutions d’étalonnage vert nanomolaire sur un couvercle en verre et allumez le laser de 485 nanomètres et 560 nanomètres fonctionnant en piles, en excitation entrelacée ou en mode PI.Concentrez-vous sur la solution et ajustez la position du sténopé et de l’anneau du collier de manière à obtenir le taux de comptage le plus élevé et le plus petit volume confocal pour obtenir la luminosité moléculaire maximale. Répétez ce processus pour les canaux rouges avec une solution d’étalonnage rouge nanomolaire 10 et un mélange des deux. Placez 10 solutions d’ADN nanomolaire sur le glissement du couvercle en verre et ajustez la mise au point du sténopé et la position de l’anneau du collier de manière à ce que les couleurs croisées entre les canaux de détection vert et rouge soient les plus élevées.C’est la source de l’amplitude la plus élevée. Pour les mesures dans les cellules vivantes, trouvez une cellule appropriée en limitant avec la lampe marqueur et en observant à travers l’oculaire. Allumez les deux lasers en mode PI et concentrez-vous sur la membrane en recherchant le nombre maximal par seconde.Veuillez noter que la puissance du laser peut devoir être réduite pour les échantillons de cellules. De préférence moins de cinq microwatts à l’objectif. Cela dépend fortement de la fleur utilisée et de la configuration.Observez les courbes auto et cross coll de la bêta-2 AR liée à EGP et enclenchez les sondes d’étiquettes dans l’aperçu en ligne du logiciel de collecte de données et collectez plusieurs mesures de tri avec un temps d’acquisition compris entre 60 et 180 secondes. Exportez le cours de corrélation et le contraste de toutes les mesures. Veuillez prendre soin ici de définir correctement les fenêtres d’invite et de délai et d’utiliser une option d’obtention de micro-temps dans le logiciel de corrélation de données.Au total, trois corrélations différentes sont nécessaires. Corrélation automatique de la fenêtre de temps d’invite du canal vert. Corrélation automatique des canaux rouges et de la fenêtre de temps de retard.Et enfin, la corrélation croisée du signal du canal vert et de la fenêtre de temps d’invite était le signal du canal rouge dans la fenêtre de temps de retard. Voici les fonctions d’auto-corrélation du FRED vert et rouge pour les solutions et les adapter à un modèle de diffusion 3 DT avec un terme triplet supplémentaire de nécessaire pour calibrer la forme et la taille du volume de détection confocale pour les deux canaux de couleur d’utilisation, où B est la ligne de base de la courbe et le nombre de molécules et de mise au point, TD le temps de diffusion et S, le zéro sur oméga zéro le facteur de forme de l’élément de volume confocal. Le clignotement du triplet et la physique de la photo sont décrits comme amplitude AR et temps de relaxation TR. Utilisez le coefficient de diffusion connu pour les étalonnages vert et rouge et obtenez des facteurs de forme pour déterminer les dimensions et le volume de l’élément de volume confocal infectieux.Calculez le spectre comme IFR, le signal fluorescent vert collecté sur les canaux zéros, et deux dans le canal de détection droit, canal un et trois, en tant que rapport des signaux collectés en arrière-plan. Déterminer l’attente directe du flux de données de l’accepteur par les longueurs d’onde d’excitation du donneur par le rapport du contraste de fond collecté des mesures d’étalonnage rouge et l’excitation rapide de la fenêtre de temps par laser vert à l’arrière-plan compte correct directement dans l’excitation de la fenêtre de temps de retard par laser rouge. Calculer la luminosité moléculaire de B à la fois la force d’écoulement verte et rouge en fonction du contraste de fond collecté, et pour obtenir le nombre de molécules et se concentrer sur l’ajustement de diffusion 3 DT.L’ajustement des corrélations ultra du canal vert et rouge, ainsi que de la corrélation croisée de l’invite verte et du retard rouge de l’ADN à double niveau au modèle de diffusion 3 DT maintient les facteurs de forme obtenus constants pour les fonctions de corrélation automatique. Le facteur de forme des fonctions de corrélation croisée se situe généralement entre ces deux valeurs. Déterminez l’amplitude à zéro temps de corrélation en fonction des valeurs de police du nombre apparent de molécules et de la mise au point.Calculer le rapport d’amplitude pour un échantillon était une co-diffusion de 100% de la force du sol vert et rouge. Ajustez les échantillons de cellules à un modèle approprié. La façon dont on leur montre que la diffusion des récepteurs membranaires n’est pas curieuse de manière bimodale était un temps de diffusion court, pas long.De plus, la physique de la photo et le clignotement de la force du sol doivent être pris en compte. Ici à TD1 et TD2, sont les deux nécessaires aux temps de diffusion. Et un est une fraction du premier temps de diffusion Contrairement à la mesure d’étalonnage dans laquelle les dés libres et la diffusion des brins d’ADN, toutes directions, les récepteurs membranaires ne montrent que la diffusion 2D le long des membranes cellulaires calculent la concentration de protéines vertes ou rouges à partir du respect du nombre de molécules et de la mise au point.Et le volume de l’élément de volume confocal, en utilisant la masse de polarisation. Ajuster les deux corrélations alto de l’échantillon à double étiquette en utilisant le même modèle que pour la construction à un seul niveau et la fonction de corrélation croisée à l’aide d’un modèle de diffusion bimodale, Note pour une description globale du système. Les trois cultures doivent être adaptées conjointement.Le terme de diffusion est identique pour les trois cultures. Et la seule différence est une perte de temps de réputation, la fonction de corrélation croisée. Calculez la concentration de protéines de travail vertes ou rouges à partir du nombre respectif de molécules et de foyer et du volume de l’élément de volume confocal.Estimer la fraction ou la concentration de protéines vertes et rouges en interaction à partir des échantillons cellulaires en utilisant les facteurs de correction obtenus à partir des échantillons d’ADN, les rapports d’amplitude de l’échantillon cellulaire et les concentrations obtenues respectives. Ajuster les deux corrélations alter de l’échantillon FRED en tant qu’échantillons marqués uniques et la corrélation croisée avant à un modèle de diffusion bimodale contenant un terme anti-corrélation, où AF reflète l’amplitude de l’anticorré corrélation totale et AR et TR l’amplitude et le temps de relaxation respectifs. En cas de changements de fluorescence anti-corrélés dus à FRED, un ou plusieurs termes anti-corrélation peuvent être nécessaires, ce qui a entraîné une baisse de la fonction de corrélation croisée Fred à des moments de faible corrélation coïncidant avec une augmentation des deux fonctions d’autocorrulation.Les mesures d’étalonnage des solutions florales vertes et rouges pour raser des facteurs de 6,5 et les canaux verts, et 6,8 dans les canaux rouges. Ainsi, le volume confocal a la taille de 1,4 et 1,9 femto plus tard ce jour de mesure, la luminosité de la molécule se situe à 12,5 kilohertz par molécule, et 2,6 kilohertz par molécule. Nous avons 15% de diaphonie de la fleur verte vers les canaux rouges après excitation du donneur et 38% de l’excitation directe sauf de la forme florale rouge par le vert, à partir de notre mesure de l’ADN, nous déterminons les facteurs de correction pour le volume de chevauchement confocal à 0,6 et 0,7 aussi, les cellules transfectées avec une construction mono-étiquette montrent une diffusion bimodale bidimensionnelle sur la membrane cellulaire où environ la moitié des molécules diffusent lentement sur l’échelle de temps de 50 à cent millisecondes et l’autre moitié relativement rapide autour de deux millisecondes dans les deux constructions.De plus, le clignotement du triplet est présent. Cependant, dans la construction d’accrochage au niveau rouge, un autre temps de relaxation est acquis à 180 microsecondes, ce qui peut provenir d’un snap droit non lié. À partir de la double étiquette elle-même, transectée avec la construction anti-encliquetage où les deux étiquettes sur deux côtés différents de la membrane cellulaire, deux mesures de moins ont été collectées le bruit et la couche rouge sur la corrélation.Et la corrélation croisée PI est assez élevée ici. Ici 70% des molécules, si vous êtes lentement sous une échelle de temps de cent millisecondes, et seulement 30% rapide autour d’une milliseconde, la fraction de molécules à double libération est faible et se situe entre 15 et 25%Les données pour le snap CT semblent meilleures et moins bruyantes. Cependant, l’anti-corrélation frontale la plus profonde attendue ne peut pas être vue et est très probablement la masse par la quantité élevée de diaphonie, l’excitation d’acceptation directe et le clignotement triplet des deux forces florales, et une fois que les schémas d’analyse des données tirant parti de l’intensité de fluorescence collectée DKS pourrait aider à sauver cela comme indiqué pour l’ensemble de données simulé.L’avantage de la technique Fred FCS est qu’avec la mobilité, nous pouvons étudier la dynamique de conférence des RCPG. Cependant, l’exécution de FR FRED dans les laboratoires est difficile et demande de bonnes cellules transfectées, un étiquetage efficace et une configuration calibrée parfaite. Juste une paire FRED pro force est également très cruciale.Les étapes expérimentales critiques comprennent l’optimisation de l’optimisation de la transfection, la minimisation de l’arrière-plan et l’autofluorescence. De plus, le pipeline d’analyse Atoms aidera à comprendre les différentes dynamiques des précepteurs dans les cellules vivantes. Nous espérons que ce protocole sera utile pour réaliser l’approche FRED FCS dans des expériences sur des cellules vivantes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Recherche

Biochimie

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