Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Questo progetto è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, numero di progetto 374031971, progetto INF) a J.B. e K.G.H.
Ringraziamo il Rudolf Virchow Center per il supporto finanziario e core unit Fluorescence Imaging per il supporto tecnico. Inoltre, ringraziamo Ashwin Balakrishnan per l'accurata correzione di bozze.

1. Protocollo sperimentale
<ol><li>Preparazione del campione NOTA: Eseguire la semina e la trasfezione cellulare in condizioni sterili.<ol>
<li>Posizionare una coverslip pulita per pozzetti in una piastra di coltura a 6 pozzetti e lavare tre volte con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). NOTA: Il protocollo di pulizia del coverslip è dettagliato nella nota supplementare 1.</li>
		<li>A ciascun pozzetti, aggiungere 2 mL del terreno di coltura cellulare completo contenente rosso fenolo (integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 μg/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) e tenere la piastra da parte.</li>
		<li>Colturare le cellule CHO nello stesso mezzo contenente rosso fenolo a 37 °C e 5% di CO2. Lavare le cellule con 5 ml di PBS per rimuovere le cellule morte.</li>
		<li>Aggiungere 2 ml di tripsina e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Diluire le cellule staccate con 8 mL di mezzo contenente rosso fenolo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.</li>
		<li>Contare le cellule in una camera neubauer e seminare ad una densità di 1,5 x 105 cellule/pozzetti nella piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti contenente i coverslip (preparata al punto 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>Lasciare che le cellule crescano in un incubatore (37 °C, 5% CO2)per 24 ore al fine di ottenere circa l'80% di confluenza.</li>
		<li>Diluire 2 μg del DNA vettore desiderato (ad esempio, CT-SNAP o NT-SNAP) e 6 μL del reagente di trasfezione in due provette separate, ciascuna contenente 500 μL del mezzo sierico ridotto per ciascun pozzo e incubare per 5 minuti a RT.</li>
		<li>Mescolare le due soluzioni insieme per ottenere la miscela di trasfezione e incubarla per 20 minuti a RT.</li>
		<li>Nel frattempo, lavare le cellule CHO seminate una volta con PBS sterile.</li>
		<li>Sostituire il PBS con 1 ml / pozzed di mezzo privo di fenolo rosso integrato con FBS al 10% senza antibiotici.</li>
		<li>Aggiungere l'intero 1 mL di miscela di trasfezione a goccia a ciascun pozzo e incubare le cellule durante la notte a 37 °C, in 5% CO2.</li>
		<li>Per l'etichettatura del costrutto SNAP, diluire la soluzione stock di substrato SNAP appropriata in 1 mL del mezzo integrato con FBS al 10% per ottenere una concentrazione finale di 1 μM.</li>
		<li>Lavare le cellule trasfettate una volta con PBS e aggiungere 1 mL per pozzo di 1 μM di soluzione di substrato SNAP. Incubare le cellule per 20 min a 37 °C in 5% CO2.</li>
		<li>Lavare le cellule tre volte con un mezzo privo di fenolo rosso e aggiungere 2 ml per mezzo privo di fenolo fenolo. Incubare le cellule per 30 min a 37 °C in 5% CO2.</li>
		<li>Trasferire successivamente i coverslip di tutti i campioni nella camera di imaging e lavare con un buffer di imaging da 500 μL. Aggiungere un buffer di imaging da 500 μL prima di passare alla configurazione FRET-FCS.</li>
	</ol></li>
	<li>Misure di calibrazione NOTA: La configurazione FRET-FCS è dotata di un obiettivo ad acqua per microscopio confocale, due linee laser, un sistema TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting), due tubi fotomoltiplicatori ibridi (PMT) e due fotodiodi a valanga (APD) per la raccolta di fotoni e il software di raccolta dati. È molto importante allineare la configurazione ogni volta prima delle misurazioni delle cellule vive. La descrizione dettagliata dell'installazione è disponibile nella nota supplementare 2. Sia i laser che tutti i rivelatori (due PMT e due AFID) sono sempre ON durante le misurazioni, poiché tutte le misurazioni devono essere condotte in condizioni identiche. Per le misure di calibrazione, utilizzare un coverslip dello stesso lotto su cui sono state seminate le cellule, questo diminuisce la variazione nella correzione dell'anello del colletto.<ol>
<li>Per regolare la messa a fuoco, il foro stenopeico e la posizione dell'anello del collare, posizionare una soluzione di calibrazione verde da 2 nM su un coperchio di vetro e accendere il laser da 485 nm e 560 nm. Azionare il laser in modalità PIE (Pulsed Interleaved Excitation)16.</li>
		<li>Concentrati sulla soluzione e regola la posizione dell'anello stenopeico e collare in modo tale da ottenere il più alto tasso di conteggio e il più piccolo volume confocale per ottenere la massima luminosità molecolare.</li>
		<li>Ripetere questo processo per i canali rossi con una soluzione di calibrazione rossa da 10 nM e una miscela di entrambe, la soluzione di calibrazione verde e rossa.</li>
		<li>Posizionare la soluzione di DNA da 10 nM su un coperchio di vetro e regolare la messa a fuoco, il foro stenopeico e la posizione dell'anello del colletto in modo tale che la correlazione incrociata tra i canali di rilevamento verde e rosso sia più alta, cioè mostri l'ampiezza più alta. NOTA: i passaggi 1.2.1 e 1.2.4 potrebbero dover essere ripetuti avanti e indietro per trovare l'allineamento ottimale. Effettuare 3-5 misurazioni da ciascuna soluzione di calibrazione per 30 s - 120 s dopo che la posizione di messa a fuoco, foro stenopeico e anello del collare sono stati allineati in modo ottimale per i canali di rilevamento verde e rosso e il volume di sovrapposizione confocale.</li>
		<li>Misurare una goccia di ddH2O, il mezzo di imaging, e una cellula non trasfetta 3-5 volte ciascuno per 30 s - 120 s per determinare i tassi di conteggio in background.</li>
		<li>Raccogliere la funzione di risposta dello strumento con 3-5 misurazioni per 30 s - 120 s. Questo è facoltativo ma altamente raccomandato.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazioni di cellule vive<ol>
<li>Trova una cella adatta illuminando con la lampada al mercurio e osservando attraverso l'oculare. NOTA: Le cellule adatte sono vive mostrando la morfologia tipica della rispettiva linea cellulare aderente. La fluorescenza della proteina di interesse, qui un recettore di superficie, è visibile su tutta la superficie. Le cellule meno luminose sono più adatte di quelle più luminose a causa del migliore contrasto in FCS quando un basso numero di molecole sono a fuoco.</li>
		<li>Accendere entrambi i laser in modalità PIE e concentrarsi sulla membrana osservando i conteggi massimi al secondo. NOTA: potrebbe essere necessario ridurre la potenza del laser per i campioni di cella (meno di 5 μW all'obiettivo). Questo dipende dai fluorofori utilizzati e dalla configurazione.</li>
		<li>Osserva le curve di correlazione automatica e incrociata dell'eGFP o del tag SNAP etichettato attaccato al β2AR nell'anteprima online del software di raccolta dati e raccogli diverse brevi misurazioni (~ 2 -10) con un tempo di acquisizione compreso tra 60 -180 s. NOTA: Non eccitare le cellule per lungo tempo continuamente poiché i fluorofori potrebbero sbiancare. Tuttavia, dipenderà dalla luminosità di ciascuna cella, da quanto possono essere lunghe le misurazioni e da quante misurazioni in totale possono essere eseguite.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analisi dei dati
<ol><li>Esportazione dati<ol>
<li>Esporta le curve di correlazione, G (tc), e i tassi di conteggio, CR, da tutte le misurazioni.</li>
		<li>Fare attenzione a definire correttamente le finestre temporali "prompt" e "delay" e utilizzare l'opzione "microtime gating" nel software di correlazione dei dati. NOTA: In totale, sono necessarie tre diverse correlazioni: (1) autocorrelazione del canale verde nella finestra temporale del prompt (ACFgp), (2) autocorrelazione dei canali rossi nella finestra temporale di ritardo (ACFrd), e infine (3) la correlazione incrociata del segnale del canale verde nella finestra temporale del prompt con il segnale del canale rosso nella finestra temporale del ritardo (CCFPIE). L'esportazione dei dati viene mostrata passo dopo passo per diversi software nella nota supplementare 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Misure di calibrazione<ol><li>Utilizzare le funzioni di autocorrelazione delle soluzioni fluoroforiche verde (ACFgp) e rosso (ACFrd) e adattarle a un modello di diffusione 3D con un termine tripletto aggiuntivo, se necessario (eq. 1) per calibrare la forma e le dimensioni del volume di rilevamento confocale per i due canali di colore utilizzati: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 Qui, b è la linea di base della curva, N il numero di molecole a fuoco, tD il tempo di diffusione (in ms) e s = z0/w0 il fattore di forma dell'elemento volume confocale. La tripletta lampeggiante o altra fotofisica è descritta dalla sua ampiezza aR e dal tempo di rilassamento tR. NOTA: tutte le variabili e i simboli utilizzati all'interno del protocollo sono elencati nella Tabella 1.</li>
		<li>Utilizzare i coefficienti di diffusione noti D per lo standard di calibrazione verde26 e rosso27 e i fattori di forma ottenuti sverde e srosso per determinare le dimensioni (larghezza w0 e altezza z0) e il volume Veff dell'elemento volumetrico confocale (eq. 2a-c). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c NOTA: i modelli per il calcolo del parametro di calibrazione sono forniti come file supplementari (S7).</li>
		<li>Calcolare la diafonia spettrale α del segnale di fluorescenza verde (raccolto nei canali 0 e 2) nei canali di rilevamento rossi (canale numero 1 e 3) come rapporto tra i segnali corretti in background (BG) (eq. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>Determinare l'eccitazione diretta del fluoroforo dell'accettore δ dalla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore dal rapporto tra il tasso di conteggio corretto in background delle misurazioni di calibrazione rossa nella finestra temporale "rapida" (eccitazione da laser verde) e il tasso di conteggio corretto in background nella finestra temporale "ritardo" (eccitazione da laser rosso) (eq. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>Calcola la luminosità molecolare B dei fluorofori verdi e rossi (eq. 5a-b) in base ai tassi di conteggio corretti sullo sfondo e al numero ottenuto di molecole a fuoco, N, dal 3D diffusion fit (eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>Adattare sia ACFgp e ACFrd che CCFPIE del DNA a doppia etichetta al modello di diffusione 3D (eq. 1). Mantenere i fattori di forma ottenuti, sverde e srosso, costanti per ACFgp e ACFrd, rispettivamente. Il fattore di forma per il CCFPIE, sPIE, è di solito tra questi due valori. NOTA: in una configurazione ideale, sia Veff,verde e Veff, il rosso avrebbero le stesse dimensioni e si sovrapporrebbero perfettamente.</li>
		<li>Determinare l'ampiezza al tempo di correlazione zero, G0(tc), in base ai valori trovati del numero apparente di molecole a fuoco (Nverde, Nrosso e NPIE).</li>
		<li>Calcolare il rapporto di ampiezza rGR e rRG per un campione con co-diffusione al 100% di fluorofori verdi e rossi (eq. 6). Tieni presente che NPIE non riflette il numero di molecole a doppia etichetta a fuoco ma riflette solo 1 /G0(tc). <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">e <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Esperimenti sulle cellule vive<ol><li>Per i costrutti con etichetta singola, adattare i campioni di cella a un modello appropriato. Per il recettore di membrana mostrato, la diffusione avviene in modo bimodale con un tempo di diffusione breve e lungo. Inoltre, la fotofisica e il lampeggiamento dei fluorofori devono essere considerati: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 Qui, td1 e td2 sono i due tempi di diffusione richiesti, e un1 è la frazione del primo tempo di diffusione. NOTA: A differenza delle misurazioni di calibrazione, in cui i coloranti liberi e i filamenti di DNA si diffondono liberamente in tutte le direzioni, il recettore di membrana mostra solo una diffusione 2D lungo le membrane cellulari. Questa differenza tra diffusione 3D e 2D si riflette nel termine di diffusione modificato (confronta eq. 1), dove tD nel caso 2D non dipende dai fattori di forma s dell'elemento di volume confocale.</li>
		<li>Calcola la concentrazione c di proteine etichettate verdi o rosse dai rispettivi Eff N e V usando la matematica di base (eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 dove NA = numero di Avogadro</li>
		<li>Per l'etichetta SNAP N-terminale e l'eGFP intracellulare, montare le due autocorrelazioni (ACFgp e ACFrd) del campione a doppia etichetta utilizzando lo stesso modello dei costrutti a etichetta singola per gli ACF (eq. 7) e il CCFPIE utilizzando un modello di diffusione bimodale (eq. 9): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 NOTA: Per una descrizione globale del sistema, tutte e tre le curve devono essere adattate congiuntamente: il termine di diffusione è identico per tutte e tre le curve e l'unica differenza è il termine di rilassamento per il CCFPIE. Poiché la fotofisica di due fluorofori è solitamente non correlata, non è richiesto alcun termine di correlazione. Questa assenza di termini di rilassamento si traduce in un PIE CCF piatto a brevi tempi di correlazione. Tuttavia, la diafonia e l'eccitazione diretta dell'accettore a causa del fluoroforo del donatore potrebbero mostrare ampiezze false positive e devono essere attentamente controllate per l'utilizzo delle misurazioni di calibrazione.</li>
		<li>Calcola la concentrazione c di proteine etichettate verdi o rosse dai rispettivi Eff N e V usando l'equazione 8.</li>
		<li>Stimare la frazione o la concentrazione, cGR o cRG, di proteine interagenti etichettate verde e rosso dai campioni cellulari utilizzando i fattori di correzione ottenuti dai campioni di DNA, i rapporti di ampiezza rGR e rRG del campione cellulare e le rispettive concentrazioni ottenute (eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> e <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>Per l'etichetta SNAP C-terminale e l'eGFP intracellulare, adattare le due autocorrelazioni (ACFgp e ACFrd) del campione FRET come campioni a singola etichetta (equazione 7) e CCFFRET a un modello di diffusione bimodale contenente un termine anti-correlazione (equazione 11) <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 dove af riflette l'ampiezza dell'anti-correlazione totale e aR e tR la rispettiva ampiezza e tempo di rilassamento. NOTA: In caso di variazioni di fluorescenza anti-correlate dovute a FRET, potrebbero essere necessari uno o più termini anti-correlazione (eq. 11), con conseguente "dip" di CCFFRET a bassi tempi di correlazione coincidenti con un aumento delle due autocorrelazioni (ACFgp e ACFrd). Tuttavia, tieni presente che la fotofisica come il battito delle palpebre triplette potrebbe mascherare il termine anti-correlazione smorzando l'anti-correlazione indotta da FRET. Un'analisi congiunta integrata con metodi FCS filtrati potrebbe aiutare a smascherare il termine anti-correlazione. Inoltre, gli artefatti tecnici derivanti da tempi morti nell'elettronica di conteggio nell'intervallo dei nanosecondi dovrebbero essere esclusi16. Una procedura passo-passo più dettagliata su come eseguire l'analisi in ChiSurf28 e modelli per il calcolo del volume confocale o della luminosità molecolare sono forniti sul repository Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) e come file supplementari (Nota supplementare 4 e Nota supplementare 6). Inoltre, gli script python per l'esportazione batch dei dati acquisiti con il software Symphotime in formato .ptu possono essere trovati lì.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.

La spettroscopia di fluorescenza è uno dei principali metodi per quantificare la dinamica proteica e le interazioni proteina-proteina con minima perturbazione in un contesto cellulare. La spettroscopia di correlazione a fluorescenza confocale (FCS) è uno dei potenti metodi per analizzare la dinamica molecolare in quanto è sensibile a singola molecola, altamente selettiva e compatibile con le cellule vive1. Rispetto ad altri approcci orientati alla dinamica, FCS ha un intervallo di tempo misurabile più ampio che va da ~ ns a ~ s, soprattutto coprendo le scale temporali veloci che sono spesso inaccessibili con metodi basati sull'imaging. Inoltre, fornisce anche selettività spaziale in modo che la dinamica molecolare di membrana, citoplasmatica e nucleo possa essere facilmente distinta 2. Pertanto, il lampeggiamento molecolare, la concentrazione locale media e il coefficiente di diffusione possono essere analizzati quantitativamente con FCS. Le dinamiche intermolecolari come il legame diventano facilmente accessibili quando si sonda la co-diffusione di due specie molecolari nella spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza (FCCS) analisi3,4,5 in un approccio a doppio colore.
Il principale principio alla base della spettroscopia di correlazione è l'analisi statistica delle fluttuazioni di intensità emesse da biomolecole etichettate fluorescentemente che si diffondono dentro e fuori da un fuoco laser (Figura 1A). Le funzioni di correlazione automatica o incrociata risultanti possono quindi essere ulteriormente analizzate mediante adattamento della curva per derivare eventualmente le costanti di tasso di interesse. In altre parole, i metodi statistici FCS e FCCS non forniscono tracce di singole molecole come nel tracciamento di singole particelle, ma un modello dinamico o "impronta digitale" di un campione sondato ad alta risoluzione temporale. Se combinato con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET), la dinamica intramolecolare come i cambiamenti conformazionali può essere monitorata contemporaneamente in una configurazione confocale comune5,6. FRET sonda la distanza di due fluorofori ed è spesso indicato come un "nanoruler" molecolare. Il trasferimento di energia avviene solo quando le molecole si trovano nelle immediate vicinanze (< 10 nm), lo spettro di emissione del donatore si sovrappone significativamente allo spettro di assorbimento della molecola accettore e l'orientamento del dipolo del donatore e dell'accettore è (sufficientemente) parallelo. Pertanto, la combinazione di FRET e FCCS fornisce una tecnica con una risoluzione spazio-temporale molto elevata. Quando è richiesta la selettività spaziale, la sensibilità e la compatibilità delle cellule vive, FRET-FCCS ha evidenti vantaggi rispetto ad altri metodi come la calorimetria di titolazione isotermica (ITC)7,la risonanza plasmonica di superficie (SPR)8o la risonanza magnetica nucleare (NMR)9,10 per misurare la dinamica e le interazioni proteiche.
Nonostante le capacità e la promessa della spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (dc-FCCS), l'esecuzione di dc-FCCS in cellule vive è tecnicamente impegnativa a causa del sanguinamento spettrale o della diafonia tra i canali3,4,della differenza nei volumi confocali dovuta alle linee laser spettralmente distinte3,4,11,del segnale di fondo e del rumore o della limitata fotostabilità dei campioni12, 13,14,15. L'introduzione dell'eccitazione interlacciata a impulsi (PIE) in FCCS è stata una modifica importante per disaccoppiare temporalmente le diverse eccitazioni laser per ridurre la diafonia spettrale tra i canali16. Altri metodi di correzione per contrastare il sanguinamento spettraleattraverso 17,18,19 e correzioni di fondo sono stati anche ben accettati17,18,19. Per dettagli e nozioni di base su FCS, PIE o FRET si rimanda al lettore ai seguenti riferimenti2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Qui, vengono presentati tutti gli esperimenti e le analisi di calibrazione necessari insieme ai risultati sperimentali di un prototipo di recettore accoppiato alla proteina G, β recettore 2-adrenergico (β2AR), per tre diversi scenari: (1) molecole monomarcizzate che trasportano un fluoroforo25 "verde" (eGFP) o "rosso" (etichettatura basata su TAG SNAP); (2) un costrutto a doppia etichetta, che porta un SNAP-tag N-terminale e un eGFP intracellulare (NT-SNAP) [in questo caso, entrambe le etichette sono alla stessa proteina. Quindi si prevede una co-diffusione al 100%]; e (3) un campione a doppia etichetta, in cui entrambi i fluorofori si trovano sullo stesso lato della membrana cellulare (CT-SNAP). Trasporta un tag SNAP C-terminale e un eGFP intracellulare. Qui, ancora una volta entrambe le etichette sono alla stessa proteina con di nuovo prevista una co-diffusione al 100%. Poiché entrambe le etichette sono molto vicine l'una all'altra, sullo stesso lato della membrana cellulare, mostra il potenziale per osservare FRET e il comportamento anticor correlato. Tutti i costrutti sono stati trasfettate in cellule dell'ovaio di criceto cinese (CHO) e successivamente etichettati con un substrato fluorescente rosso che è impermeabile alla membrana per il costrutto NT-SNAP e permeabile alla membrana per il costrutto CT-SNAP. Infine, i dati simulati esemplificano l'influenza dei parametri sperimentali sull'anticorrelazione indotta da FRET e l'effetto delle interazioni proteina-proteina sull'ampiezza di co-diffusione.
Pertanto, questo protocollo fornisce una guida completa all'esecuzione del FRET-FCCS combinato nelle cellule viventi per comprendere le dinamiche proteiche e le interazioni proteina-proteina, rendendo consapevoli degli artefatti tecnici / fisici, delle sfide e delle possibili soluzioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Presentiamo un protocollo e un flusso di lavoro per eseguire la spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (FCCS) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare la dinamica dei recettori di membrana nelle cellule vive utilizzando le moderne tecniche di etichettatura a fluorescenza. Nella FCCS bicolore, dove le fluttuazioni dell'intensità di fluorescenza rappresentano l'"impronta digitale" dinamica della rispettiva biomolecola fluorescente, possiamo sondare la co-diffusione o il legame dei recettori. FRET, con la sua elevata sensibilità alle distanze molecolari, funge da noto "nanoruler" per monitorare i cambiamenti intramolecolari. Nel loro insieme, i cambiamenti conformazionali e i parametri chiave come le concentrazioni dei recettori locali e le costanti di mobilità diventano accessibili in contesti cellulari.
Gli approcci quantitativi di fluorescenza sono impegnativi nelle cellule a causa degli elevati livelli di rumore e della vulnerabilità del campione. Qui mostriamo come eseguire questo esperimento, comprese le fasi di calibrazione utilizzando il recettore β2-adrenergico (β2AR) etichettato con eGFP e SNAP-tag-TAMRA. Una procedura di analisi dei dati passo-passo viene fornita utilizzando software open source e modelli facili da personalizzare.
La nostra linea guida consente ai ricercatori di svelare le interazioni molecolari delle biomolecole nelle cellule vive in situ con elevata affidabilità nonostante i limitati livelli di segnale-rumore negli esperimenti sulle cellule vive. La finestra operativa di FRET e in particolare FCCS a basse concentrazioni consente l'analisi quantitativa in condizioni quasi fisiologiche.

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Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Presentiamo un protocollo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per eseguire la spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (FCCS) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare la dinamica del recettore di membrana nelle cellule vive utilizzando le moderne tecniche di etichettatura a fluorescenza.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

La spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza è un metodo statistico che utilizza la fluorescenza del risultato temporale per individuare la firma dinamica dei recettori accoppiati alla proteina G nelle cellule viventi. Qui, siamo particolarmente interessati, ai recettori adrenergici beta-2. I recettori sfingolipidici forniscono principalmente informazioni sulla dinamica di diffusione traslazionale e con l'aiuto dell'anisotropia a fluorescenza anche sulla diffusione rotazionale.Introducendo un'etichetta aggiuntiva, possiamo anche pro-binding o addirittura modifiche conformazionali se promuovono il trasferimento di energia di risonanza tra le etichette come sondato. La fluorescenza quantitativa risolta nel tempo richiede un attento allineamento delle misure di configurazione e calibrazione. Nei minuti seguenti, forniremo una guida sperimentale per la spettroscopia di correlazione di fluorescenza delle cellule di vita, la spettroscopia di correlazione incrociata e il trasferimento di energia di risonanza Forster di recettori accoppiati a proteine G, utilizzando tag clonabile e forza di flusso sintetica.La seduta cellulare e il trasfisso devono essere eseguiti in condizioni sterili. Posizionare un bilanciere di copertura pulito su una piastra di coltura a sei pozzetti e lavarlo con soluzione salina tampone fosfato sterile aggiungere due ml di terreno di coltura cellulare con rosso fenolo integrato con siero bovino fetale al 10%, 100 microgrammi, penicillina amminica e 100 microgrammi per ml di streptomicina a ciascun pozzetto e tenerlo da parte. Prendi le cellule CHO che vengono coltivate nello stesso mezzo con rosso fenolo a 37 gradi centigradi nel cinque percento di CO2 e lavale con cinque ml di PBS per rimuovere le cellule morte.Aggiungere due ml di tripsina e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Diluire le cellule di dati con otto ml di mezzo con rosso fenolo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio. Contare le cellule in una camera Neubauer e far sedere le cellule ad una densità di 150.000 cellule per pozzetto nella piastra di coltura a sei pozzi contenente lo slittamento di copertura.Lasciare che le cellule crescano in un'incubatrice per 24 ore al fine di ottenere una confluenza approssimativa dell'80%. Diluire due microgrammi del DNA vettore desiderato. Ad esempio, CT SNAP o NT SNAP e sei microlitro di quel reagente di trasfezione in due tubi separati.Ciascuno contenente 500 microlitro ridotto mezzo sierico per ogni pozzo e incubarli per cinque minuti a temperatura ambiente. Mescolare le due soluzioni insieme per ottenere la miscela di trasfezione e incubarla per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, lavare le cellule CHO sedute una volta con PBS sterile.Sostituire il PBS con un ml per pozzedo di mezzo libero dal rosso fenolo, integrato con siero bovino fetale al 10% e senza antibiotici. Aggiungere l'intera miscela di costruzione di un ml di goccia per ogni pozzo e incubare le cellule durante la notte a 37 gradi nel cinque percento di CO2. Per l'etichettatura, diluire il substrato SNAP appropriato in un mezzo mL integrato con siero bovino fetale al 10% per ottenere una concentrazione finale di un micromolare.Lavare le cellule trasfettate una volta con PBS e aggiungere un mL per pozzo di una soluzione di substrato SNAP micromolare. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 gradi in cinque per cento di CO2. Lavare le cellule tre volte con un mezzo libero dal rosso fenolo e aggiungere due ml per mezzo libero dal rosso fenolo.Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi centigradi in cinque per cento di CO2. Trasferire successivamente lo slittamento di copertura di tutti i campioni nella camera di imaging e lavare con il buffer di imaging a 500 microlitteri. Aggiungere il buffer di imaging a 500 microliti prima di passare alla configurazione FRED FCS.La configurazione FRED FCS è dotata di un obiettivo ad acqua al microscopio confocale, due linee laser, un sistema di conteggio straniero singolo trapuntato nel tempo, due BMT ibridi e due azioni per la raccolta dei fotoni e il software di raccolta dati. È molto importante allineare la configurazione ogni volta prima della misurazione nelle cellule vive. Per regolare la messa a fuoco, il foro stenopeico e la posizione di colorazione, posizionare due soluzioni di calibrazione verde nanomolare su una slitta di copertura in vetro e accendere il laser a 485 nanometri e 560 nanometri azionato in pile, eccitazione interlacciata o modalità PI.Concentrati sulla soluzione e regola la posizione dell'anello stenopeico e collare in modo tale da ottenere il più alto tasso di conteggio e il più piccolo volume confocale per ottenere la massima luminosità molecolare. Ripetere questo processo per i canali rossi con 10 nanomolari soluzione di calibrazione rossa e una miscela di entrambi. Posizionare 10 soluzione di DNA nanomolare sullo slittamento del coperchio di vetro e regolare la messa a fuoco del foro stenopeico e la posizione dell'anello del colletto in modo tale che i colori incrociati tra i canali di rilevamento verde e rosso siano più alti.Questa è la fonte della più alta ampiezza. Per le misurazioni in cellule vive, trovare una cellula adatta limitando con la lampada di marcatura e osservando attraverso l'oculare. Accendi entrambi i laser in modalità PI e concentrati sulla membrana cercando il conteggio massimo al secondo.Si prega di notare che potrebbe essere necessario ridurre la potenza del laser per i campioni di cellule. Preferibilmente meno di cinque microwatt all'obiettivo. Questo dipende molto dal floreale utilizzato e dalla configurazione.Osserva le curve auto e cross coll dell'AR beta-2 legato alle sonde EGP e snap tag nell'anteprima online del software di raccolta dati e raccogli diverse misurazioni di ordinamento con un tempo di acquisizione compreso tra 60 e 180 secondi. Esporta il corso di correlazione e il contrasto da tutte le misurazioni. Si prega di fare attenzione qui a definire correttamente le finestre temporali di prompt e ritardo e utilizzare alcune opzioni di micro time getting nel software di correlazione dei dati.In totale, sono necessarie tre diverse correlazioni. Correlazione automatica della finestra temporale del prompt del canale verde. Correlazione automatica dei canali rossi e della finestra temporale di ritardo.E infine la correlazione incrociata del segnale del canale verde e della finestra temporale del prompt era il segnale del canale rosso nella finestra temporale del ritardo. Ecco le funzioni di correlazione automatica del FRED verde e rosso per le soluzioni e adattarle a un modello di diffusione 3 DT con un termine tripletto aggiuntivo necessario per calibrare la forma e la dimensione del volume di rilevamento confocale per i canali di colore a due usi, dove B è la linea di base della curva e il numero di molecole e messa a fuoco, TD il tempo di diffusione e S, lo zero su omega zero il fattore di forma dell'elemento volume confocale. La tripletta lampeggiante e la fisica fotografica sono descritte come ampiezza AR e tempo di rilassamento TR. Utilizzare il coefficiente di diffusione noto per i punti di calibrazione verde e rosso e ottenere fattori di forma per determinare le dimensioni e il volume dell'elemento di volume confocale infettivo.Calcola lo spettro attraverso come IFR, il segnale fluorescente verde raccolto sui canali zero, e due nel canale di rilevamento giusto, canale uno e tre, come rapporto tra i segnali raccolti in background. Determinare l'aspettativa diretta del flusso di dati dell'accettore da parte delle lunghezze d'onda di eccitazione del donatore in base al rapporto tra il contrasto di fondo raccolto delle misurazioni di calibrazione rossa e l'eccitazione della finestra temporale rapida da parte del laser verde al conto corretto di sfondo proprio nell'eccitazione della finestra temporale di ritardo da parte del laser rosso. Calcola la luminosità molecolare di B sia la forza di flusso verde che rossa in base al contrasto raccolto sullo sfondo e per ottenere il numero di molecole e concentrati sull'adattamento di diffusione 3 DT.Adatta sia le correlazioni ultra dal canale verde e rosso, sia attraverso la correlazione dal prompt verde e dal ritardo rosso del DNA a doppio livello al modello di diffusione 3 DT mantiene costanti i fattori di forma ottenuti per le funzioni di correlazione automatica. Il fattore di forma per le funzioni di correlazione incrociata è solitamente compreso tra questi due valori. Determinare l'ampiezza al tempo di correlazione zero in base ai valori del carattere del numero apparente di molecole e messa a fuoco.Calcolare il rapporto di ampiezza per un campione era una co-diffusione al 100% della forza del pavimento verde e rosso. Adattare i campioni di cella a un modello appropriato. Il modo in cui viene mostrata la diffusione del recettore di membrana non curioso in modo bimodale è stato un tempo di diffusione breve, non lungo.Inoltre, la fisica fotografica e il lampeggiamento della forza del pavimento devono essere considerati. Qui a TD1 e TD2, sono i due necessari ai tempi di diffusione. E uno è una frazione del primo tempo di diffusione In contrasto con la misurazione della calibrazione in cui i dadi liberi e la diffusione dei filamenti di DNA, tutte le direzioni, i recettori di membrana mostrano solo la diffusione 2D lungo le membrane cellulari calcolano la concentrazione di proteine con etichetta verde o rossa dal rispetto del numero di molecole e messa a fuoco.E il volume dell'elemento volume confocale, usando la massa polare. Adatta le due correlazioni contralto del campione a doppia etichetta usando lo stesso modello del costrutto a livello singolo e della funzione di correlazione incrociata usando un modello di diffusione bimodale, Nota per una descrizione globale del sistema. Tutte e tre le colture devono essere adattate congiuntamente.Il termine di diffusione è identico per tutte e tre le colture. E l'unica differenza è che il tempo di reputazione cade, la funzione di correlazione incrociata. Calcola la concentrazione di proteine del lavoro verdi o rosse dal rispettivo numero di molecole e focus e dal volume dell'elemento volume confocale.Stimare la frazione o la concentrazione di proteine dell'etichetta verde e rossa interagenti dai campioni cellulari utilizzando i fattori di correzione ottenuti dai campioni di DNA, i rapporti di ampiezza del campione cellulare e le rispettive concentrazioni ottenute. Adattare le due correlazioni alter del campione FRED come un singolo campione etichettato e la correlazione incrociata anteriore a un modello di diffusione bimodale contenente un termine anti correlazione, in cui AF riflette l'ampiezza dell'anti correlazione totale e AR e TR la rispettiva ampiezza e tempo di rilassamento. In caso di cambiamenti di fluorescenza anti-correlati dovuti a FRED potrebbero essere necessari uno o più termini di correlazione anti, che hanno comportato un calo della funzione di correlazione incrociata di Fred in tempi di correlazione bassi in coincidenza con un aumento delle due funzioni di correlazione automatica.Le misure di calibrazione delle soluzioni floreali verdi e rosse per i fattori di rasatura di 6,5 e i canali verdi e 6,8 nei canali rossi. Pertanto, il volume confocale ha le dimensioni di 1,4 e 1,9 femto più tardi in questo giorno di misurazione, la luminosità della molecola si trova a 12,5 kilohertz per molecola e 2,6 kilohertz per molecola. Abbiamo il 15% di diafonia dal floreale verde per nei canali rossi dopo l'eccitazione del donatore e il 38% di diretto tranne l'eccitazione della forma floreale rossa dal verde, dalla nostra misurazione del DNA, determiniamo i fattori di correzione per il volume di sovrapposizione confocale a 0,6 e 0,7 anche, le cellule trasfettate con costrutto a etichetta singola mostrano una diffusione bimodale bidimensionale sulla membrana cellulare dove circa la metà delle molecole si diffondono lentamente su la scala temporale da 50 a cento millisecondi e l'altra metà relativamente veloce intorno ai due millisecondi in entrambi i costrutti.Inoltre, è presente la tripletta lampeggiante. Tuttavia, nel costrutto di snap di livello rosso viene acquisito un altro tempo di rilassamento a 180 microsecondi, che potrebbe derivare da Unbound snap straight. Dalla doppia etichetta stessa, transected con il costrutto anti snap in cui le due etichette su due lati diversi della membrana cellulare, sono state raccolte due misurazioni in meno del rumore e il mantello rosso sulla correlazione.E la correlazione incrociata PI è piuttosto alta qui. Qui il 70% delle molecole, se si è lentamente sotto una scala temporale di cento millisecondi, e solo il 30% veloce intorno a un millisecondo, la frazione di molecole a doppia liberazione è bassa e si trova tra il 15 e il 25% I dati per lo snap CT sembrano migliori ed è meno rumoroso. Tuttavia, l'anti correlazione anteriore più profonda prevista non può essere vista ed è molto probabilmente la massa dall'elevata quantità di diafonia, l'eccitazione diretta e il battito triplicante di entrambe le forze floreali, e una volta che gli schemi di analisi dei dati che sfruttano l'intensità di fluorescenza raccolta DKS potrebbero aiutare a salvare questo come mostrato per il set di dati simulato.Il vantaggio della tecnica Fred FCS è che insieme alla mobilità, possiamo studiare le dinamiche di conferenza dei GPCR. Tuttavia, eseguire FRED FAC nei laboratori è impegnativo e richiede buone celle trasfettate, un'etichettatura efficiente e una perfetta configurazione calibrata. Solo una coppia FRED pro force è anche molto cruciale.Le fasi sperimentali critiche includono l'ottimizzazione dell'ottimizzazione della trasfezione, la minimizzazione dello sfondo e l'autofluorescenza. Inoltre e la pipeline di analisi degli atomi aiuterà a comprendere le varie dinamiche dei precettori nelle cellule vive. Speriamo che questo protocollo possa essere utile per eseguire l'approccio FRED FCS negli esperimenti sulle cellule vive.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Ricerca

Biochimica

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura

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Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

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Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...