Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dette prosjektet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, prosjektnummer 374031971, Project INF) til J.B. og K.G.H.
Vi takker Rudolf Virchow Center for økonomisk støtte og Core Unit Fluorescence Imaging for teknisk støtte. I tillegg takker vi Ashwin Balakrishnan for grundig korrekturlesing.

1. Eksperimentell protokoll
<ol><li>Prøvepreparering MERK: Utfør cellesåing og transfeksjon under sterile forhold.<ol>
<li>Legg en rengjort deksler per brønn i en 6-brønns kulturplate og vask tre ganger med steril fosfatbufret saltvann (PBS). MERK: Coverlip-rengjøringsprotokollen er beskrevet i Tilleggsmerknad 1.</li>
		<li>Til hver brønn, tilsett 2 ml av hele cellekulturmediet som inneholder fenolrødt (supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 100 μg / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) og hold platen til side.</li>
		<li>Kultur CHO-cellene i samme medium som inneholder fenolrød ved 37 °C og 5 % CO2. Vask cellene med 5 ml PBS for å fjerne de døde cellene.</li>
		<li>Tilsett 2 ml trypsin og inkuber i 2 min ved romtemperatur (RT).</li>
		<li>Fortynn de frittliggende cellene med 8 ml medium som inneholder fenolrød og bland forsiktig ved pipettering.</li>
		<li>Tell cellene i et Neubauer-kammer og frø med en tetthet på 1,5 x 105 celler/brønn i den 6-brønns cellekulturplaten som inneholder dekslene (utarbeidet i trinn 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>La cellene vokse i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 24 timer for å oppnå ca. 80 % samløp.</li>
		<li>Fortynn 2 μg av ønsket vektor-DNA (f.eks. CT-SNAP eller NT-SNAP) og 6 μL av transfeksjonsreagenset i to separate rør, som hver inneholder 500 μL av det reduserte serummediet for hver brønn og inkuberer i 5 min ved RT.</li>
		<li>Bland de to løsningene sammen for å oppnå transfeksjonsblandingen og inkubere den i 20 minutter ved RT.</li>
		<li>I mellomtiden vasker du frø CHO-cellene en gang med steril PBS.</li>
		<li>Bytt ut PBS med 1 ml/brønn fenol rødfritt medium supplert med 10% FBS uten antibiotika.</li>
		<li>Tilsett hele 1 ml transfeksjonsblanding dråpevis til hver brønn og inkuber cellene over natten ved 37 °C, i 5 % CO2.</li>
		<li>For merking av SNAP-konstruksjonen, fortynn den aktuelle SNAP-substratbestandsløsningen i 1 ml av mediet supplert med 10% FBS for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 μM.</li>
		<li>Vask de transfekterte cellene en gang med PBS og tilsett 1 ml per brønn med 1 μM SNAP-substratløsning. Inkuber cellene i 20 min ved 37 °C i 5 % CO2.</li>
		<li>Vask cellene tre ganger med fenol rødfritt medium og tilsett 2 ml per brønn fenol rødfritt medium. Inkuber cellene i 30 min ved 37 °C i 5 % CO2.</li>
		<li>Overfør dekslene til alle prøvene senere inn i bildekammeret og vask med 500 μL bildebuffer. Tilsett 500 μL bildebuffer før du går til FRET-FCS-oppsettet.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibreringsmålinger MERK: FRET-FCS-oppsettet er utstyrt med et konfokalt mikroskopvannmål, to laserlinjer, et tidkorrelert TCSPC-system (Single Photon Counting), to hybride fotomultiplierrør (PMT) og to skredfotodioder (APD) for fotoninnsamling og datainnsamlingsprogramvaren. Det er svært viktig å justere oppsettet hver gang før live cellemålinger. Du finner den detaljerte oppsettbeskrivelsen i Tilleggsmerknad 2. Både lasere og alle detektorer (to PMT-er og to APDer) er alltid PÅ under målingene, da alle målinger må utføres under identiske forhold. For kalibreringsmålingene, bruk en dekslelip fra samme tomt som cellene ble sådd på, dette reduserer variasjonen i krageringkorrigering.<ol>
<li>For å justere fokus-, pinhole- og krageringsposisjonen, plasser 2 nM grønn kalibreringsløsning på en glassdeksleslip og slå på 485 nm og 560 nm laser. Bruk laser i Pulsed Interleaved Excitation (PIE)-modus16.</li>
		<li>Fokuser på løsningen og juster pinhole- og krageringsposisjonen slik at den høyeste tellehastigheten og det minste konfektvolumet oppnås for å få maksimal molekylær lysstyrke.</li>
		<li>Gjenta denne prosessen for de røde kanalene med 10 nM rød kalibreringsløsning og en blanding av både grønn og rød kalibreringsløsning.</li>
		<li>Plasser 10 nM DNA-løsningen på et glassdeksler og juster fokus-, pinhole- og krageringsposisjonen slik at krysskorrelasjonen mellom de grønne og røde deteksjonskanalene er høyest, det vil si viser den høyeste amplituden. MERK: Trinn 1.2.1 og 1.2.4 må kanskje gjentas frem og tilbake for å finne den optimale justeringen. Ta 3-5 målinger fra hver kalibreringsløsning i 30 s - 120 s etter at fokus, hull og krageringposisjon er justert optimalt for de grønne og røde deteksjonskanalene og det konfiske overlappingsvolumet.</li>
		<li>Mål en dråpe ddH2O, bildemediet og en ikke-transfektert celle 3-5 ganger hver i 30 s - 120 s for å bestemme antall bakgrunnsfrekvenser.</li>
		<li>Samle instrumentets responsfunksjon med 3-5 målinger for 30 s - 120 s. Dette er valgfritt, men anbefales på det sterkeste.</li>
	</ol></li>
	<li>Måling av aktive celler<ol>
<li>Finn en passende celle ved å belyse med kvikksølvlampen og observere gjennom okulæren. MERK: Egnede celler er i live og viser den typiske morfologien til den respektive tilhengercellelinjen. Fluorescensen av proteinet av interesse, her en overflatereseptor, er synlig over hele overflaten. Mindre lyse celler er mer egnet enn lysere på grunn av bedre kontrast i FCS når et lavt antall molekyler er i fokus.</li>
		<li>Slå på begge laserne i PIE-modus og fokuser på membranen ved å se på maksimalt antall per sekund. MERK: Lasereffekten må kanskje reduseres for celleprøvene (mindre enn 5 μW på målet). Dette avhenger av de brukte fluoroforene og oppsettet.</li>
		<li>Følg auto- og krysskorrelasjonskurvene til eGFP eller merket SNAP-tag festet til β2AR i den elektroniske forhåndsvisningen av datainnsamlingsprogramvaren og samle inn flere korte målinger (~ 2 -10) med en anskaffelsestid mellom 60 -180 s. MERK: Ikke opphisse cellene i lang tid kontinuerlig, da fluoroforene kan bleke. Det vil imidlertid avhenge av lysstyrken til hver celle, hvor lenge målingene kan være, og hvor mange målinger totalt kan utføres.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dataanalyse
<ol><li>Eksport av data<ol>
<li>Eksporter korrelasjonskurvene G(tc) og tellehastighetene, CR, fra alle målinger.</li>
		<li>Pass på at du definerer tidsvinduene "rask" og "forsinkelse" riktig og bruker alternativet "microtime gating" i datakorrelasjonsprogramvaren. MERK: Totalt kreves det tre forskjellige korrelasjoner: (1) autokorrelasjon av den grønne kanalen i ledetekstvinduet (ACFgp), (2) autokorrelasjon av de røde kanalene i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd), og til slutt (3) krysskorrelasjonen til det grønne kanalsignalet i ledetekstvinduet med det røde kanalsignalet i forsinkelsestidsvinduet (CCFPIE). Dataeksporten vises trinn for trinn for annen programvare i Tilleggsmerknad 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibreringsmålinger<ol><li>Bruk autokorrelasjonsfunksjonene til de grønne (ACFgp) og røde (ACFrd) fluoroforløsningene, og monter dem til en 3D-diffusjonsmodell med et ekstra trillingsbegrep om nødvendig (eq. 1) for å kalibrere formen og størrelsen på det konfokale deteksjonsvolumet for de to brukte fargekanalene: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 Her er b kurvens grunnlinje, N antall molekyler i fokus, tD diffusjonstiden (i ms) og s = z0/w0 formfaktoren til det kondokale volumelementet. Trilling blinking eller annen fotofysikk er beskrevet av sin amplitude enR og avslapningstid tR. MERK: Alle variabler og symboler som brukes i protokollen er oppført i tabell 1.</li>
		<li>Bruk de kjente diffusjonskoeffisientene D for den grønne26 og røde kalibreringsstandarden 27 og de oppnådde formfaktorene grønt og rødt for å bestemme dimensjonene (bredde w0 og høyde z0) og volum Veff av det konfokale volumelementet (eq. 2a-c). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c MERK: Maler for beregning av kalibreringsparameteren leveres som tilleggsfiler (S7).</li>
		<li>Beregn den spektrale krysstale α av det grønne fluorescenssignalet (samlet inn i kanal 0 og 2) i de røde deteksjonskanalene (kanal nummer 1 og 3) som et forhold mellom bakgrunnskorrigerte (BG) signaler (eq. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>Bestem den direkte eksitasjonen av akseptorfluoreore δ av donoreksitasjonsbølgelengden ved forholdet mellom bakgrunnskorrigert tellehastighet for de røde kalibreringsmålingene i "ledetekst" tidsvinduet (eksitasjon med grønn laser) til bakgrunnskorrigert tellehastighet i "forsinkelse" tidsvinduet (eksitasjon med rød laser) (eq. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>Beregn den molekylære lysstyrken B for både de grønne og røde fluoroforene (eq. 5a-b) basert på bakgrunnskorrigerte tellehastigheter og det oppnådde antall molekyler i fokus, N, fra 3D diffusjonspasning (eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>Monter både ACFgp og ACFrd samt CCFPIE av dobbeltmerket DNA til 3D diffusjonsmodellen (eq. 1). Hold de oppnådde formfaktorene, sgrønne og srøde, konstante for henholdsvis ACFgp og ACFrd. Figurfaktoren for CCFPIE, sPIE, er vanligvis mellom disse to verdiene. MERK: I et ideelt oppsett, både Veff,grønn og Veff, ville rødt ha samme størrelse og overlappe perfekt.</li>
		<li>Bestem amplituden ved null korrelasjonstid, G0(tc), basert på de funnet verdiene til det tilsynelatende antallet molekyler i fokus (Ngrønn, Nrød og NPIE).</li>
		<li>Beregn amplitudeforholdet rGR og rRG for en prøve med 100 % kodiffusjon av grønne og røde fluoroforer (eq. 6). Vær oppmerksom på at NPIE ikke gjenspeiler antall dobbeltmerkede molekyler i fokus, men gjenspeiler bare 1 /G0(tc). <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">og <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Eksperimenter med levende celler<ol><li>For konstruksjoner med én etikett tilpasser du celleeksemplene til en passende modell. For den viste membranreseptoren oppstår diffusjon på en bimodal måte med kort og lang diffusjonstid. I tillegg må fotofysikk og blinking av fluoroforene vurderes: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 Her er td1 og td2 de to nødvendige diffusjonstidene, og en1 er brøkdelen av den første diffusjonstiden. MERK: I motsetning til kalibreringsmålingene, der frie fargestoffer og DNA-tråder fritt diffuserer i alle retninger, viser membranreseptoren bare 2D-diffusjon langs cellemembranene. Denne forskjellen mellom 3D- og 2D-spredning gjenspeiles av den modifiserte diffusjonsbetingelsen (sammenlign eq. 1), der tD i 2D-tilfellet ikke avhenger av formfaktoren til det konfiske volumelementet.</li>
		<li>Beregn konsentrasjonen c av grønne eller rødmerkede proteiner fra den respektive N- og V-eff ved hjelp av grunnleggende matematikk (eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 der NA = Avokopos nummer</li>
		<li>For N-terminal SNAP-etikett og intracellulær eGFP passer de to autokorrelasjonene (ACFgp og ACFrd) til den dobbeltmerkede prøven med samme modell som for enkeltmerkede konstruksjoner for ACF-ene (eq. 7) og CCFPIE ved hjelp av en bimodal diffusjonsmodell (eq. 9): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 MERK: For en global beskrivelse av systemet må alle tre kurvene passe sammen: Diffusjonsbegrepet er identisk for alle tre kurvene, og den eneste forskjellen er avslapningsbegrepet for CCFPIE. Siden fotofysikk av to fluoroforer vanligvis ikke er relatert, er det ikke nødvendig med korrelasjonsbegrep. Dette fraværet av avslapningsbetingelser resulterer i en flat CCFPIE på korte korrelasjonstider. Imidlertid kan krysstale og direkte eksitasjon av akseptoren på grunn av donorfluofor vise falske positive amplituder og bør kontrolleres nøye for bruk av kalibreringsmålingene.</li>
		<li>Beregn konsentrasjonen c av grønne eller rødmerkede proteiner fra den respektive N- og V-eff ved hjelp av ligning 8.</li>
		<li>Beregn brøkdelen eller konsentrasjonen, cGR eller cRG, for interaksjon av grønne og røde merkede proteiner fra celleprøvene ved hjelp av korreksjonsfaktorene hentet fra DNA-prøvene, amplitudeforholdene rGR og rRG i celleprøven og deres respektive oppnådde konsentrasjoner (eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> og <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>For SNAP-etikett og intracellulær eGFP passer de to autokorrelasjonene (ACFgp og ACFrd) til FRET-prøven som enkeltmerkede prøver (formel 7) og CCFFRET til en bimodal diffusjonsmodell som inneholder et antikorrelasjonsbegrep (ligning 11) <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 der enf reflekterer amplituden til den totale antikorrelasjonen og enR og tR den respektive amplituden og avslapningstiden. MERK: Ved antikorrelerte fluorescensendringer på grunn av FRET, kan det være nødvendig med ett eller flere antikorrelasjonsvilkår (eq. 11), noe som resulterer i en "dukkert" av CCFFRET ved lave korrelasjonstider sammenfallende med en økning i de to autokorrelasjonene (ACFgp og ACFrd). Vær imidlertid oppmerksom på at fotofysikk som trilling blinker kan maskere antikorrelasjonsbegrepet ved å dempe fret-indusert antikorrelasjon. En felles analyse supplert med filtrerte FCS-metoder kan bidra til å avdekke antikorrelasjonsbegrepet. I tillegg bør tekniske gjenstander som stammer fra døde tider i telleelektronikken i nanoseconds-serien utelukkes16. En mer detaljert trinnvis prosedyre for hvordan du utfører analysen i ChiSurf28 og maler for beregning av konfokalt volum eller molekylær lysstyrke er gitt på Github-repositoriet (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) og som tilleggsfiler (Tillegg Note 4 og Supplementary Note 6). I tillegg kan python-skriptene for batcheksport av data som er samlet inn med Symphotime-programvaren i .ptu-format, bli funnet der.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne har ingen konflikter å deklarere.

Fluorescensspektroskopi er en av de viktigste metodene for å kvantifisere proteindynamikk og proteinproteininteraksjoner med minimal perturbasjon i en cellulær kontekst. Confocal fluorescence correlation spectroscopy (FCS) er en av de kraftige metodene for å analysere molekylær dynamikk, da den er enkeltmolekylssensitiv, svært selektiv og levende cellekompatibel1. Sammenlignet med andre dynamikkorienterte tilnærminger, har FCS et bredere målbart tidsområde som spenner fra ~ ns til ~ s, viktigst dekker de raske tidsskalaene som ofte er utilgjengelige ved avbildningsbaserte metoder. Videre gir det også romlig selektivitet slik at membran, cytoplasmatisk og kjernemolekylær dynamikk lett kan skille 2. Dermed kan molekylær blinking, den gjennomsnittlige lokale konsentrasjonen og diffusjonskoeffisienten analyseres kvantitativt med FCS. Intermolekylær dynamikk som binding blir lett tilgjengelig ved probing co-diffusjon av to molekylære arter i fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS) analyse3,4,5 i en dual-color tilnærming.
Det viktigste underliggende prinsippet i korrelasjonsspektroskopi er den statistiske analysen av intensitetssvingninger som slippes ut av fluorescerende merkede biomolekyler som sprer seg inn og ut av laserfokus (Figur 1A). De resulterende auto- eller krysskorrelasjonsfunksjonene kan deretter analyseres ytterligere ved kurvetilpasning for til slutt å utlede rentekonstantene av interesse. Med andre ord gir de statistiske metodene FCS og FCCS ikke enkeltmolekylspor som i enkeltpartikkelsporing, men et dynamisk mønster eller "fingeravtrykk" av en probed specimen med høy temporal oppløsning. Når den kombineres med Förster resonansenergioverføring (FRET), kan intramolekylær dynamikk som konformasjonsendringer overvåkes samtidig i et felles konfokalt oppsett5,6. FRET sonderer avstanden til to fluoroforer og blir ofte referert til som en molekylær "nanoruler". Energioverføring skjer bare når molekylene er i nærheten (< 10 nm), utslippsspekteret til donoren overlapper betydelig med absorpsjonsspekteret til akseptormolekylet, og dipolorretningen til donoren og akseptoren er (tilstrekkelig) parallell. Dermed gir kombinasjonen av FRET og FCCS en teknikk med svært høy romlig-temporal oppløsning. Når romlig selektivitet, følsomhet så vel som live-celle kompatibilitet er nødvendig, FRET-FCCS har åpenbar fordelaktig i forhold til andre metoder som Isotermisk titrering Calorimetry (ITC)7, Surface Plasmon Resonance (SPR)8, eller Nuclear Magnetic Resonance (NMR)9,10 for måling av proteindynamikk og interaksjoner.
Til tross for evnene og løftet om tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (dc-FCCS), er det teknisk utfordrende å utføre dc-FCCS i levende celler på grunn av spektralblødning eller krysstale mellom kanalene3,4, forskjellen i kondokale volumer på grunn av de spektralt distinkte laserlinjene3,4,11, bakgrunnssignal og støy eller begrenset fotostabilitet av prøvene12, 13,14,15. Innføringen av puls sammenflettet eksitasjon (PIE) til FCCS var en viktig justering for å midlertidig koble de forskjellige lasereksitasjonene for å redusere spektral krysstale mellom kanalene16. Andre korrigeringsmetoder for å motvirke spektralblødning17,18,19 og bakgrunnskorreksjoner har også blitt godt akseptert17,18,19. Hvis du vil ha mer informasjon og grunnleggende informasjon om FCS, PIE eller FRET, refereres leseren til følgende referanser2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Her presenteres alle nødvendige kalibreringseksperimenter og analyser sammen med de eksperimentelle resultatene av en prototypisk G-protein koblet reseptor, β2-adrenergereseptor(β 2 AR), for tre forskjellige scenarier: (1) enkeltmerkede molekyler som bærer enten en "grønn" (eGFP) eller en "rød" (SNAP-tag-basert merking)25 fluorofor; (2) en dobbeltmerket konstruksjon, som bærer en N-terminal SNAP-tag og intracellulær eGFP (NT-SNAP) [i dette tilfellet er begge etikettene på samme protein. Dermed forventes 100% ko-diffusjon]; og (3) en dobbeltmerket prøve, der begge fluoroforene er på samme side av cellemembranen (CT-SNAP). Den har en C-terminal SNAP-tag og en intracellulær eGFP. Her er begge etikettene igjen på samme protein med igjen 100% ko-diffusjon forventet. Siden begge etikettene er svært nær hverandre, på samme side av cellemembranen, viser det potensialet til å observere FRET og antikorrelert oppførsel. Alle konstruksjoner ble transfektert i kinesiske Hamster Ovary (CHO)-celler og senere merket med et rødt fluorescerende substrat som er membran-ugjennomtrengelig for NT-SNAP-konstruksjonen og membrangjennomtrengelig for CT-SNAP-konstruksjonen. Til slutt eksemplifiserer simulerte data påvirkningen av eksperimentelle parametere på fret-indusert antikorrelasjon, og effekten av proteinproteininteraksjoner på ko-diffusjonsamplituden.
Dermed gir denne protokollen en komplett veiledning for å utføre den kombinerte FRET-FCCS i levende celler for å forstå proteindynamikk og proteinproteininteraksjoner mens du gjør deg oppmerksom på tekniske / fysiske artefakter, utfordringer og mulige løsninger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Vi presenterer en protokoll og arbeidsflyt for å utføre levende celle tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS) kombinert med Förster Resonance Energy transfer (FRET) for å studere membranreseptordynamikk i levende celler ved hjelp av moderne fluorescensmerkingsteknikker. I dual-color FCCS, hvor svingningene i fluorescensintensiteten representerer det dynamiske "fingeravtrykket" til den respektive fluorescerende biomolekylen, kan vi sondere ko-diffusjon eller binding av reseptorene. FRET, med sin høye følsomhet for molekylære avstander, fungerer som en kjent "nanoruler" for å overvåke intramolekylære endringer. Samlet sett blir konformasjonsendringer og nøkkelparametere som lokale reseptorkonsentrasjoner og mobilitetskonstanter tilgjengelige i cellulære innstillinger.
Kvantitativ fluorescens tilnærminger er utfordrende i celler på grunn av høye støynivåer og sårbarheten i prøven. Her viser vi hvordan du utfører dette eksperimentet, inkludert kalibreringstrinnene ved hjelp av tofarget merket β2-adrenergereseptor(β2AR) merket med eGFP og SNAP-tag-TAMRA. En trinnvis dataanalyseprosedyre tilbys ved hjelp av programvare og maler med åpen kildekode som er enkle å tilpasse.
Vår retningslinje gjør det mulig for forskere å avdekke molekylære interaksjoner av biomolekyler i levende celler in situ med høy pålitelighet til tross for de begrensede signal-til-støy-nivåene i levende celleeksperimenter. Det operative vinduet til FRET og spesielt FCCS ved lave konsentrasjoner tillater kvantitativ analyse ved nesten fysiologiske forhold.

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Vi presenterer en eksperimentell protokoll- og dataanalysearbeidsflyt for å utføre live celle dual-color fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS) kombinert med Förster Resonance Energy transfer (FRET) for å studere membranreseptordynamikk i levende celler ved hjelp av moderne fluorescensmerkingsteknikker.

Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi er en statistisk metode som bruker tidsresultatfluorescens for å finne den dynamiske signaturen til G-proteinkoblede reseptorer i levende celler. Her er vi spesielt interessert, i beta-2 adrenerge reseptorer. Sphingolipid reseptorer gir hovedsakelig informasjon om translasjonell diffusjonsdynamikk og ved hjelp av fluorescens anisotropi også rotasjonsdiffusjon.Ved å introdusere en ekstra etikett, kan vi også pro-bindende eller til og med konformasjonsendringer hvis foster resonans energioverføring mellom etikettene som probed. Kvantitativ tid løst fluorescens krever nøye justering av oppsett- og kalibreringsmålingene. I de følgende minuttene vil vi gi en eksperimentell guide for livscellefluorescenskorrelasjonsspektroskopi, krysskorrelasjonsspektroskopi og Forster-resonansenergioverføring av G proteinkoblede reseptorer, ved hjelp av klone-i stand-koder og syntetisk strømningskraft.Cellesitting og transfixing må utføres under sterile forhold. Legg en ren deksel slip barbell på en seks brønn kultur plate, og vask den ned med steril fosfat buffer saltvann legge til to ml cellekultur medium med fenol rød supplert med 10% foster bovint serum, 100 mikrogram, per amin penicillin og 100 mikrogram per ml streptomycin til hver brønn, og hold den til side. Ta CHO-cellene som dyrkes i samme medium med fenolrød ved 37 grader celsius i fem prosent CO2 og vask dem med fem ml PBS for å fjerne de døde cellene.Tilsett to ml trypsin og inkuber i to minutter ved romtemperatur. Fortynn datacellene med åtte ml medium med fenolrød og bland forsiktig ved pipettering. Tell cellene i et Neubauer-kammer og sitt cellene med en tetthet på 150 000 celler per brønn i de seks brønnkulturplatene som inneholder dekkslippet.La cellene vokse i en inkubator i 24 timer for å oppnå omtrent 80% samløp. Fortynn to mikrogram av ønsket vektor-DNA. For eksempel CT SNAP eller NT SNAP, og seks mikroliter av transfeksjonsreagenset i to separate rør.Hver inneholder 500 mikroliter redusert serum medium for hver brønn og inkuberer dem i fem minutter ved romtemperatur. Bland de to løsningene sammen for å oppnå transfeksjonsblandingen og inkuber den i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden vasker du de sittende CHO-cellene en gang med steril PBS.Erstatt PBS med en ml per brønn av fenolrødt fritt medium, supplert med 10% foster bovint serum og ingen antibiotika. Tilsett hele konstruksjonsblandingen av en ml dråpe klok til hver brønn og inkuber cellene over natten på 37 grader i fem prosent CO2. For merking, fortynn det aktuelle SNAP-substratet i ett ml medium supplert med 10% foster bovint serum for å oppnå en endelig konsentrasjon på ett mikromolar.Vask de transfekterte cellene en gang med PBS og tilsett en ml per brønn av en mikromolar SNAP-substratløsning. Inkuber cellene i 20 minutter ved 37 grader i fem prosent CO2. Vask cellene tre ganger med fenol rødt fritt medium, og tilsett to ml per brønn fenol rødt fritt medium.Inkuber cellene i 30 minutter ved 37 grader celsius i fem prosent CO2. Overfør dekselslippet til alle prøver deretter inn i bildekammeret og vask med 500 Microliter bildebuffer. Tilsett 500 mikroliteravbildningsbuffer før du går til FRED FCS-oppsettet.FRED FCS-oppsettet er utstyrt med et konfokalt mikroskopivannmål, to laserlinjer, et tidsdylter enkelt utenlandsk tellesystem, to hybride BMTer og to aksjer for fotoninnsamling og datainnsamlingsprogramvaren. Det er svært viktig å justere oppsettet hver gang før måling i levende celler. For å justere fokus, pinhole og fargeposisjon, plasser to nanomolar grønn kalibreringsløsning på en glassdekselglidning og slå på 485 nanometer og 560 nanometerlaser som drives i hauger, sammenflettet eksitasjon eller PI-modus.Fokuser på løsningen og juster pinhole- og krageringsposisjonen slik at den høyeste tellehastigheten og det minste konfektvolumet oppnås for å få maksimal molekylær lysstyrke. Gjenta denne prosessen for de røde kanalene med 10 nanomolar rød kalibreringsløsning og en blanding av begge deler. Plasser 10 nanomolar DNA-løsning på glassdekselglidning, og juster fokuset på pinhole og krageringsposisjonen slik at kryssfargene mellom de grønne og røde deteksjonskanalene er høyest.Det er kilden til den høyeste amplituden. For målinger i levende celler, finn en passende celle ved å begrense med markørlampen og observere gjennom okulær. Slå på begge laserne i PI-modus og fokuser på membranen ved å se etter maksimalt antall per sekund.Vær oppmerksom på at laserkraften kanskje må reduseres for celleprøvene. Helst mindre enn fem mikrowatt på målet. Dette avhenger sterkt av den brukte blomster og oppsettet.Vær oppmerksom på auto- og krysskoll-kurvene til beta-2 AR bundet til EGP- og snap-tag-sonder i den elektroniske forhåndsvisningen av datainnsamlingsprogramvaren og samle inn flere sorteringsmålinger med en anskaffelsestid mellom 60 og 180 sekunder. Eksporter korrelasjonskurset og kontrasten fra alle målinger. Vær forsiktig her for å definere hurtig- og forsinkelsestidsvinduene riktig og bruke litt mikrotid for å få alternativ i datakorrelasjonsprogramvaren.Totalt kreves det tre forskjellige korrelasjoner. Automatisk korrelasjon av tidsvinduet for den grønne kanalledeteksten. Automatisk korrelasjon mellom de røde kanalene og forsinkelsestidsvinduet.Og til slutt krysskorrelasjonen til det grønne kanalsignalet, og det raske tidsvinduet var det røde kanalsignalet i forsinkelsestidsvinduet. Her er de automatiske korrelasjonsfunksjonene til den grønne og røde FRED for løsninger og passer dem til en 3 DT diffusjonsmodell med en ekstra trillingsbetingelse som kreves for å kalibrere formen og størrelsen på det konfokale deteksjonsvolumet for de to bruksfargekanalene, der B er kurvens grunnlinje og antall molekyler og fokus, TD diffusjonstiden og S, nullen over omega null formfaktoren til det konfekale volumelementet. Trilling blinker og fotofysikk er beskrevet som amplitude AR og avslapningstid TR. Bruk den kjente diffusjonskoeffisienten for den grønne og røde kalibreringen skiller seg ut og oppnå formfaktorer for å bestemme dimensjonene og volumet til det infektive konfektiske volumelementet.Beregn spekteret på tvers av som IFR, det grønne fluorescerende signalet samlet på kanal nuller, og to inn i høyre deteksjonskanal, kanal en og tre, som et forhold mellom de innsamlede bakgrunnssignalene. Bestem den direkte forventningen til akseptorflyten av data av donoreksitasjonsbølgelengdene ved forholdet mellom bakgrunnsinnsamlet kontrast for de røde kalibreringsmålingene og den raske tidsvinduet som eksitasjon med grønn laser til bakgrunnen riktig konto rett i forsinkelsestidsvinduet excitation av rød laser. Beregn den molekylære lysstyrken til B både den grønne og røde strømningskraften basert på bakgrunnen samlet kontrast, og for å oppnå antall molekyler og fokus på 3 DT diffusjonsform.Passer både ultrakorrelasjoner fra den grønne og røde kanalen, samt på tvers av korrelasjon fra den grønne ledeteksten og den røde forsinkelsen av det doble DNA-et til 3 DT-diffusjonsmodellen holder de oppnådde formede faktorene konstante for de automatiske korrelasjonsfunksjonene. Figurfaktoren for krysskorrelasjonsfunksjonene er vanligvis mellom disse to verdiene. Bestem amplituden ved null korrelasjonstid basert på skriftverdiene til det tilsynelatende antallet molekyler og fokus.Beregn amplitudeforholdet for en prøve var en 100% ko-diffusjon av grønn og rød gulvkraft. Tilpass celleeksemplene til en passende modell. Hvordan de blir vist membranreseptor diffusjon ikke nysgjerrig på en bi-modal måte var en kort, ingen lang diffusjonstid.I tillegg må fotofysikken og blinke ut gulvkraften vurderes. Her til TD1 og TD2, er de to som kreves for diffusjonstider. Og en er en brøkdel av den første diffusjonstiden I motsetning til kalibreringsmålingen der de frie terningene og DNA-trådene diffusjon, alle retninger, viser membranreseptorer bare 2D-diffusjon langs cellemembranene beregner konsentrasjonen av grønne eller røde etikettproteiner fra antall molekyler og fokus.Og volumet av det konfiske volumelementet, ved hjelp av biasing masse. Tilpass de to altokorrelasjonene i den dobbeltmerkede prøven ved hjelp av samme modell som for enkeltnivåkonstruksjonen og krysskorrelasjonsfunksjonen ved hjelp av en to-modal diffusjonsmodell, Merknad for en global beskrivelse av systemet. Alle tre avlingene må passe sammen.Diffusjonsbegrepet er identisk for alle tre avlingene. Og den eneste forskjellen er et omdømmetid faller, krysskorrelasjonsfunksjonen. Beregn konsentrasjonen av grønne eller røde arbeidsproteiner fra det respektive antall molekyler og fokus og volumet av det konfiske volumelementet.Beregn fraksjonen eller konsentrasjonen av interagerende grønne og røde etikettproteiner fra celleprøvene ved hjelp av korreksjonsfaktorene hentet fra DNA-prøvene, amplitudeforholdene til celleprøven og de respektive oppnådde konsentrasjonene. Monter de to alterkorrelasjonene i FRED-prøven som en enkelt merket prøve og frontkorrelasjonen til en bi-modal diffusjonsmodell som inneholder et antikorrelasjonsbegrep, der AF gjenspeiler amplituden til den totale antikorrelasjonen og AR og TR den respektive amplituden og avslapningstiden. Ved antikorrelerte fluorescensendringer på grunn av FRED kan det være nødvendig med ett eller flere antikorrelasjonsvilkår, noe som resulterte i en dukkert av Fred cross korrelasjonsfunksjonen ved lave korrelasjonstider sammenfallende med en økning i de to autokorrelasjonsfunksjonene.Kalibreringsmålingene av de grønne og røde blomsterløsningene til barberingsfaktorer på 6,5 og de grønne kanalene, og 6,8 i de røde kanalene. Dermed har det konfiske volumet størrelsen på 1,4 og 1,9 femto senere på denne måledagen, molekylets lysstyrke ligger på 12,5 kilohertz per molekyl og 2,6 kilohertz per molekyl. Vi har 15% av krysstale fra den grønne blomster for inn i de røde kanalene etter donoreksitasjon og 38% av direkte unntatt eksitasjon av den røde blomsterformen av greenen, fra vår DNA-måling, bestemmer vi korreksjonsfaktorene for det kondokale overlappingsvolumet til 0,6 og 0,7 også, cellene transfektert med enkeltetikettkonstruksjon viser to-modal todimensjonal diffusjon på cellemembranen der omtrent halvparten av molekylene diffuserer sakte på tidsskalaen på 50 til hundre millisekunder og den andre halvparten relativt rask rundt to millisekunder i begge konstruksjonene.I tillegg er trilling blinker til stede. Men i det røde nivået snap konstruere en annen avslapningstid er anskaffet på 180 mikroseconds, som kan stamme fra Unbound snap rett. Fra selve dobbeltetiketten, transektert med anti-snap-konstruksjonen der de to etikettene på to forskjellige sider av cellemembranen, er to mindre målinger samlet opp støyen og den røde kappen til korrelasjon.Og PI-krysskorrelasjonen er ganske høy her. Her 70% av molekylene, hvis du sakte under hundre millisekunder tidsskala, og bare 30% rask rundt ett millisekund, er brøkdelen av doble frigjørende molekyler lav og ligger mellom 15 og 25%Dataene for CT-snap ser bedre ut og det er mindre støyende. Imidlertid kan den forventede frontens dypeste antikorrelasjon ikke sees og er mest sannsynlig masse av den høye mengden krysstale, direkte aksept eksitasjon og trilling blinking av både blomsterkraft, og når dataanalyseordninger som drar nytte av den innsamlede fluorescensintensiteten, kan DKS bidra til å redde dette som vist for det simulerte datasettet.Fordelen med Fred FCS-teknikken er at vi sammen med mobilitet kan undersøke konferansedynamikken til GPCRs. Det er imidlertid utfordrende å utføre FRED FCs i laboratorier og be om gode transfekterte celler, effektiv merking og et perfekt kalibrert oppsett. Bare en FRED par pro force er også veldig avgjørende.Kritiske eksperimentelle trinn inkluderer optimalisering av transfeksjonsoptimalisering, minimering av bakgrunn og automatisk fluorescens. I tillegg vil Atoms analyserørledning bidra til å forstå de ulike dynamikkene i veiledere i levende celler. Vi håper at denne protokollen vil være nyttig for å utføre FRED FCS-tilnærmingen i live celleeksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av Protein-protein Interaksjon i Kjerne- og cytoplasmatiske Fraksjoner av Co-immunoprecipitation og<em&gt; In Situ</em&gt; Nærhet hemorroider Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...