Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Este projeto foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, número do projeto 374031971, Project INF) para J.B. e K.G.H.
Agradecemos ao Centro Rudolf Virchow pelo apoio financeiro e à Unidade Central de Fluorescência de Imagem pelo suporte técnico. Além disso, agradecemos a Ashwin Balakrishnan pela leitura completa da prova.

1. Protocolo Experimental
<ol><li>Preparação da amostra NOTA: Realizar semeadura e transfecção celular em condições estéreis.<ol>
<li>Coloque uma tampa limpa por poço em uma placa de cultura de 6 poços e lave três vezes com soro fisiológico estéril tamponado (PBS). NOTA: O protocolo de limpeza do deslizamento de tampas está detalhado na Nota Complementar 1.</li>
		<li>A cada poço, adicione 2 mL do meio de cultura celular completa contendo fenol vermelho (suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 μg/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina) e mantenha a placa de lado.</li>
		<li>Cultugem as células CHO no mesmo meio contendo fenol vermelho a 37 °C e 5% DE CO2. Lave as células com 5 mL de PBS para remover as células mortas.</li>
		<li>Adicione 2 mL de trippsina e incubar por 2 min em temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Diluir as células destacadas com 8 mL de médio contendo fenol vermelho e misturar cuidadosamente por pipetação.</li>
		<li>Conte as células em uma câmara de Neubauer e sementes a uma densidade de 1,5 x 105 células/poço na placa de cultura celular de 6 poços contendo as manchas (preparadas na etapa 1.1.1-1.1.2).</li>
		<li>Deixe as células crescerem em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO2) por 24 h, a fim de alcançar aproximadamente 80% de confluência.</li>
		<li>Diluir 2 μg do DNA vetorial desejado (por exemplo, CT-SNAP ou NT-SNAP) e 6 μL do reagente de transfecção em dois tubos separados, cada um contendo 500 μL do meio de soro reduzido para cada poço e incubar por 5 min em RT.</li>
		<li>Misture as duas soluções para obter a mistura de transfecção e incuba-la por 20 minutos na RT.</li>
		<li>Enquanto isso, lave as células CHO semeadas uma vez com PBS estéreis.</li>
		<li>Substitua o PBS por 1 mL/poço de meio livre de fenol complementado com 10% de FBS sem antibióticos.</li>
		<li>Adicione toda a mistura de 1 mL de transfecção em cada poço e incubar as células durante a noite a 37 °C, em 5% de CO2.</li>
		<li>Para rotulagem da construção SNAP, diluir a solução de estoque de substrato SNAP apropriada em 1 mL do meio complementado com 10% de FBS para obter uma concentração final de 1 μM.</li>
		<li>Lave as células transfeminadas uma vez com PBS e adicione 1 mL por poço de solução de substrato SNAP de 1 μM. Incubar as células por 20 min a 37 °C em 5% de CO2.</li>
		<li>Lave as células três vezes com meio livre de fenol e adicione 2 mL por meio bem livre de fenol. Incubar as células por 30 min a 37 °C em 5% de CO2.</li>
		<li>Transfira as tampas de todas as amostras posteriormente para a câmara de imagem e lave com 500 μL de tampão de imagem. Adicione 500 μL de tampão de imagem antes de passar para a configuração FRET-FCS.</li>
	</ol></li>
	<li>Medições de calibração NOTA: A configuração FRET-FCS é equipada com um objetivo de água de microscópio confocal, duas linhas laser, um sistema de contagem de fótons único (TCSPC) correlacionados por tempo, dois tubos fotomultiplier híbridos (PMT) e dois fotodiodos de avalanche (APD) para coleta de fótons e o software de coleta de dados. É muito importante alinhar a configuração sempre antes das medições de células vivas. A descrição detalhada da configuração pode ser encontrada no Note 2 Suplementar. Tanto os lasers quanto todos os detectores (dois PMTs e dois APDs) estão sempre ligados durante as medições, pois todas as medições precisam ser conduzidas em condições idênticas. Para as medidas de calibração, use uma mancha de cobertura do mesmo lote em que as células foram semeadas, isso diminui a variação na correção do anel de colarinho.<ol>
<li>Para ajustar o foco, a posição do anel do pinhole e da coleira, coloque a solução de calibração verde de 2 nM em um deslizamento de tampa de vidro e ligue o laser de 485 nm e 560 nm. Operar laser no modo Excitação Intercalada Pulsada (PIE)16.</li>
		<li>Concentre-se na solução e ajuste a posição do anel de pinhole e do colarinho de modo que a maior taxa de contagem e o menor volume confocal sejam obtidos para obter o brilho molecular máximo.</li>
		<li>Repita este processo para os canais vermelhos com solução de calibração vermelha de 10 nM e uma mistura de ambos, a solução de calibração verde e vermelha.</li>
		<li>Coloque a solução de DNA de 10 nM em uma mancha de vidro e ajuste a posição do anel de foco, pinhole e colarinho de modo que a correlação cruzada entre os canais de detecção verde e vermelho seja maior, ou seja, mostra a maior amplitude. NOTA: As etapas 1.2.1 e 1.2.4 podem ter que ser repetidas para frente e para trás para encontrar o alinhamento ideal. Tome 3-5 medidas de cada solução de calibração para 30 s - 120 s após a posição do anel de foco, pinhole e colarinho ter sido alinhado idealmente para os canais de detecção verde e vermelho e o volume de sobreposição confocal.</li>
		<li>Meça uma gota de ddH2O, o meio de imagem e uma célula não transfeinada 3-5 vezes cada para 30 s - 120 s para determinar as taxas de contagem de fundo.</li>
		<li>Colete a função de resposta do instrumento com medidas de 3-5 para 30 s - 120 s. Isso é opcional, mas altamente recomendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Medições de células vivas<ol>
<li>Encontre uma célula adequada iluminando com a lâmpada de mercúrio e observando através do ocular. NOTA: As células adequadas estão vivas mostrando a morfologia típica da respectiva linha celular aderente. A fluorescência da proteína de interesse, aqui um receptor de superfície, é visível por toda a superfície. Células menos brilhantes são mais adequadas do que as mais brilhantes devido ao melhor contraste na FCS quando um baixo número de moléculas estão em foco.</li>
		<li>Ligue ambos os lasers no modo PIE e foque na membrana olhando para as contagens máximas por segundo. NOTA: A potência do laser pode precisar ser reduzida para as amostras de células (menos de 5 μW no objetivo). Isso depende dos fluoroforos usados e da configuração.</li>
		<li>Observe as curvas de correlação automática e cruzada do eGFP ou etiquetagem SNAP anexada ao β2AR na pré-visualização on-line do software de coleta de dados e colete várias medidas curtas (~2 -10) com um tempo de aquisição entre 60 -180 s. NOTA: Não excite as células por muito tempo continuamente, pois os fluoroforos podem clarear. No entanto, dependerá do brilho de cada célula, quanto tempo as medidas podem ser, e quantas medidas no total podem ser realizadas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Análise de dados
<ol><li>Exportação de dados<ol>
<li>Exporte as curvas de correlação, G(tc),e taxas de contagem, CR, de todas as medidas.</li>
		<li>Tenha o cuidado de definir corretamente as janelas de tempo "prompt" e "delay" e use a opção "microtime gating" no software de correlação de dados. NOTA: No total, são necessárias três correlações diferentes: (1) correção automática do canal verde na janela de tempo imediata(ACFgp),(2) correção automática dos canais vermelhos na janela de tempo de atraso(ACFrd),e finalmente (3) a correlação cruzada do sinal do canal verde na janela de tempo imediata com o sinal do canal vermelho na janela de tempo de atraso(CCFPIE). A exportação de dados é mostrada passo a passo para diferentes softwares na Nota Suplementar 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Medições de calibração<ol><li>Use as funções de autocorrelação das soluções fluoróforas verdes(ACFgp) e vermelhas(ACFrd)e encaixe-as em um modelo de difusão 3D com um termo de trigêmeo adicional, se necessário (eq. 1) para calibrar a forma e o tamanho do volume de detecção confocal para os dois canais de cor usados: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 Aqui, b é a linha de base da curva, N o número de moléculas em foco, tD o tempo de difusão (em ms), e s = z0/w0 o fator de forma do elemento de volume confocal. O piscar trigêmeo ou outra fotofísica é descrito por sua amplitude aR e tempo de relaxamento tR. NOTA: Todas as variáveis e símbolos utilizados dentro do protocolo estão listados na Tabela 1.</li>
		<li>Use os coeficientes de difusão conhecidos D para o padrão verde26 e vermelho de calibração27 e os fatores de forma obtidos sãoverdes e vermelhos para determinar as dimensões (largura w0 e altura z0) e volume Veff do elemento de volume confocal (eq. 2a-c). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c NOTA: Os modelos para cálculo do parâmetro de calibração são fornecidos como arquivos complementares (S7).</li>
		<li>Calcule o crosstalk espectral α do sinal de fluorescência verde (coletado nos canais 0 e 2) nos canais de detecção vermelho (canal número 1 e 3) como uma razão dos sinais corrigidos por fundo (BG) (eq. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>Determine a excitação direta do fluoroforeiro aceitador δ pelo comprimento de onda de excitação do doador pela razão da taxa de contagem corrigida em segundo plano das medidas de calibração vermelha na janela de tempo "prompt" (excitação por laser verde) para a taxa de contagem corrigida por fundo na janela de tempo "delay" (excitação por laser vermelho) (eq. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>Calcule o brilho molecular B dos fluoroforos verdes e vermelhos (eq. 5a-b) com base nas taxas de contagem corrigidas por fundo e no número obtido de moléculas em foco, N, do ajuste de difusão 3D (eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>Coloque tanto oGP ACF quanto o ACFrd, bem como o CCFPIE do DNA de dupla rotulagem no modelo de difusão 3D (eq. 1). Mantenha os fatores de forma obtidos, s verde e vermelho,constante para ACFgp e ACFrd,respectivamente. O fator de forma para o CCFPIE, sPIE, geralmente está entre esses dois valores. NOTA: Em uma configuração ideal, tanto V eff,verde e Veff, vermelho teria o mesmo tamanho e se sobreporia perfeitamente.</li>
		<li>Determine a amplitude em tempo zero de correlação, G0(tc),com base nos valores encontrados do número aparente de moléculas em foco(Nverde, Nvermelho e NPIE).</li>
		<li>Calcule a razão de amplitude rGR e rRG para uma amostra com co-difusão de fluoroforos verdes e vermelhos (eq. 6). Esteja ciente de que o NPIE não reflete o número de moléculas duplamente rotuladas em foco, mas reflete apenas o 1/G0(tc). <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg"><img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg">eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos com células vivas<ol><li>Para construtos de rótulo único, coloque as amostras de células em um modelo apropriado. Para o receptor de membrana mostrado, a difusão ocorre de forma bimodal com um curto e longo tempo de difusão. Além disso, a fotofísica e o piscar dos fluoroforos devem ser considerados: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 Aqui, td1 e td2 são os dois tempos de difusão necessários, e um1 é a fração do primeiro tempo de difusão. NOTA: Em contraste com as medidas de calibração, nas quais os corantes livres e os fios de DNA se difundem livremente em todas as direções, o receptor de membrana mostra apenas difusão 2D ao longo das membranas celulares. Essa diferença entre difusão 3D e 2D é refletida pelo termo de difusão modificada (compare eq. 1), onde tD no caso 2D não depende do fator de forma do elemento volume confocal.</li>
		<li>Calcular a concentração c de proteínas rotuladas verdes ou vermelhas do respectivo N e Veff utilizando matemática básica (eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 onde NA = número de Avogadro</li>
		<li>Para o selo SNAP n-terminal e eGFP intracelular, ajuste as duas autocorrelações (ACFgp e ACFrd) da amostra de dupla rotulagem usando o mesmo modelo dos construtos de marca única para os ACFs (eq. 7) e o CCFPIE usando um modelo de difusão bimodal (eq 9): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 NOTA: Para uma descrição global do sistema, todas as três curvas devem estar em forma conjunta: O termo de difusão é idêntico para todas as três curvas e a única diferença é o termo de relaxamento para o CCFPIE. Como a fotofísica de dois fluoroforos geralmente não está relacionada, nenhum termo de correlação é necessário. Esta ausência de termos de relaxamento resulta em um CCFPIE plano em curtos períodos de correlação. No entanto, o crosstalk e a excitação direta do aceitador devido ao fluoróforo doador podem apresentar amplitudes falsas positivas e devem ser cuidadosamente verificados para o uso das medidas de calibração.</li>
		<li>Calcule a concentração c de proteínas rotuladas verdes ou vermelhas do respectivo eff N e V utilizando a equação 8.</li>
		<li>Estimar a fração ou concentração, cGR ou cRG,de proteínas rotuladas verdes e vermelhas interativas das amostras de células utilizando os fatores de correção obtidos a partir das amostras de DNA, as razões de amplitude rGR e rRG da amostra celular e suas respectivas concentrações obtidas (eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"><img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg">eq. 10</li>
		<li>Para o selo SNAP terminal C e eGFP intracelular, ajuste as duas autocorrelações (ACFgp e ACFrd) da amostra FRET como as amostras de etiqueta única (equação 7) e o CCFFRET a um modelo de difusão bimodal contendo um termo anti-correlação (equação 11) <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 onde af reflete a amplitude da anti-correlação total e umR e tR a respectiva amplitude e tempo de relaxamento. NOTA: No caso de alterações de fluorescência anti-correlacionada devido ao TRAS, pode-se exigir um ou vários termos anti-correlação (eq. 11), resultando em um "mergulho" de CCFFRET em tempos de baixa correlação coincidindo com um aumento nas duas autocorrelações(ACFgp e ACFrd). No entanto, esteja ciente de que a fotofísica, como piscar trigêmeos, pode mascarar o termo anti-correlação, amortecendo a anti-correlação induzida pelo FRET. Uma análise conjunta complementada com métodos FCS filtrados pode ajudar a desmascarar o termo anti-correlação. Além disso, artefatos técnicos decorrentes de tempos mortos na contagem eletrônica na faixa de nanossegundos devem ser excluídos16. Um procedimento passo a passo mais detalhado sobre como realizar a análise no ChiSurf28 e modelos para o cálculo do volume confocal ou brilho molecular são fornecidos no repositório do Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) e como arquivos complementares(Nota Suplementar 4 e Nota Suplementar 6). Além disso, os scripts python para exportação em lote de dados adquiridos com o software Symphotime em formato .ptu podem ser encontrados lá.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm conflitos para declarar.

A espectroscopia de fluorescência é um dos principais métodos para quantificar a dinâmica proteica e as interações proteína-proteína com perturbação mínima em um contexto celular. A espectroscopia de correlação de fluorescência confocal (FCS) é um dos métodos poderosos para analisar a dinâmica molecular, pois é sensível a molécula única, altamente seletiva e compatível com células vivas1. Em comparação com outras abordagens orientadas à dinâmica, a FCS tem uma faixa de tempo mensurável mais ampla que abrange de ~ ns a ~ s, o mais importante, cobrindo as escalas de tempo rápido que muitas vezes são inacessíveis por métodos baseados em imagem. Além disso, também fornece seletividade espacial para que a dinâmica molecular da membrana, citoplasmática e núcleo possa ser facilmente distinguida 2. Assim, o piscar molecular, a concentração local média e o coeficiente de difusão podem ser analisados quantitativamente com FCS. Dinâmicas intermoleculares como a vinculação tornam-se facilmente acessíveis ao sondar a co-difusão de duas espécies moleculares na análise de espectroscopia de correlação transversal de fluorescência (FCCS)3,4,5 em uma abordagem de dupla cor.
O principal princípio subjacente na espectroscopia de correlação é a análise estatística das flutuações de intensidade emitidas por biomoléculas fluorescentes rotuladas de difusão dentro e fora de um foco laser(Figura 1A). As funções de correlação automática ou cruzada resultantes podem então ser analisadas por encaixe de curva para eventualmente derivar as constantes de juros da taxa. Em outras palavras, os métodos estatísticos FCS e FCCS não fornecem traços de molécula única, como no rastreamento de partículas únicas, mas um padrão dinâmico ou "impressão digital" de um espécime sondado com alta resolução temporal. Quando combinada com a transferência de energia de ressonância Förster (FRET), a dinâmica intramolecular, como alterações conformais, pode ser monitorada ao mesmo tempo em uma configuração confocal comum5,6. O FRET sonda a distância de dois fluoroforos e é frequentemente referido como um "nanoruler" molecular. A transferência de energia ocorre somente quando as moléculas estão próximas (< 10 nm), o espectro de emissão do doador se sobrepõe significativamente ao espectro de absorção da molécula aceitadora, e a orientação do dipolo do doador e do aceitador é (suficientemente) paralela. Assim, a combinação de FRET e FCCS fornece uma técnica com resolução espátula-temporal muito alta. Quando a seletividade espacial, a sensibilidade e a compatibilidade com células vivas são necessárias, o FRET-FCCS tem uma vantagem óbvia sobre outros métodos como a Calorimetria de Titrção Isotérmica (ITC)7,a Ressonância de Plasmon superficial (SPR)8ou a Ressonância Magnética Nuclear (NMR)9,10 para medir a dinâmica e as interações proteicas.
Apesar das capacidades e promessas de espectroscopia de fluorescência de duas cores (dc-FCCS), realizar dc-FCCS em células vivas é tecnicamente desafiador devido ao sangramento espectral ou crosstalk entre os canais3,4, a diferença nos volumes confocal devido às linhas laser espectralmente distintas3,4,11,sinal de fundo e ruído ou fotoestabilidade limitada das12amostras, 13,14,15. A introdução da excitação intercalada de pulso (PIE) para a FCCS foi um ajuste importante para desacoplar temporalmente as diferentes excitações de laser para reduzir o crosstalk espectral entre os canais16. Outros métodos de correção para combater a sangria espectral17,18,19 e correções de fundo também foram bem aceitos17,18,19. Para detalhes e fundamentos em FCS, PIE ou FRET, o leitor é encaminhado para as seguintes referências2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Aqui, todos os experimentos e análises de calibração necessárias juntamente com os resultados experimentais de um receptor prototípico de proteína G acoplado, β receptor 2-adrenérgico (β2AR), para três cenários diferentes são apresentados: (1) moléculas de rótulo único carregando um "verde" (eGFP) ou um "vermelho" (rotulagem baseada em SNAP)25 fluorophore; (2) uma construção de dupla rotulagem, que carrega uma tag SNAP n-terminal e eGFP intracelular (NT-SNAP) [neste caso, ambos os rótulos estão na mesma proteína. Assim, é esperado 100% de co-difusão]; e (3) uma amostra duplamente rotulada, onde ambos os fluoroforos estão do mesmo lado da membrana celular (CT-SNAP). Ele carrega uma tag SNAP terminal C e um eGFP intracelular. Aqui, novamente ambos os rótulos estão na mesma proteína com novamente 100% de co-difusão esperada. Como ambos os rótulos são muito próximos um do outro, no mesmo lado da membrana celular, ele mostra o potencial de observar FRET e comportamento anticorarado. Todas as construções foram transfectadas em células chinesas de ovário hamster (CHO) e posteriormente rotuladas com um substrato fluorescente vermelho que é imune à membrana impermeável para a construção NT-SNAP e permeável à membrana para a construção CT-SNAP. Finalmente, os dados simulados exemplificam a influência dos parâmetros experimentais na anticorrelação induzida pelo FRET e o efeito das interações proteína-proteína na amplitude de co-difusão.
Assim, este protocolo fornece um guia completo para a realização do FRET-FCCS combinado em células vivas para entender a dinâmica proteica e as interações proteína-proteína, ao mesmo tempo em que conscientizam artefatos técnicos/físicos, desafios e possíveis soluções.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Apresentamos um protocolo e fluxo de trabalho para realizar espectroscopia de fluorescência de fluorescência de células vivas (FCCS) combinada com a transferência de energia de ressonância förster (FRET) para estudar a dinâmica do receptor de membrana em células vivas usando técnicas modernas de rotulagem de fluorescência. Em FCCS de dupla cor, onde as flutuações na intensidade da fluorescência representam a "impressão digital" dinâmica da respectiva biomolécula fluorescente, podemos sondar a co-difusão ou a vinculação dos receptores. O FRET, com sua alta sensibilidade às distâncias moleculares, serve como um conhecido "nanoruler" para monitorar alterações intramoleculares. Juntas, mudanças conformais e parâmetros-chave, como concentrações de receptores locais e constantes de mobilidade, tornam-se acessíveis em ambientes celulares.
As abordagens quantitativas de fluorescência são desafiadoras nas células devido aos altos níveis de ruído e à vulnerabilidade da amostra. Aqui mostramos como realizar este experimento, incluindo as etapas de calibração usando βreceptor 2-adrenérgico deduplacor (β2AR) rotulado com eGFP e SNAP-tag-TAMRA. Um procedimento de análise de dados passo a passo é fornecido usando software de código aberto e modelos fáceis de personalizar.
Nossa diretriz permite que os pesquisadores desvendem interações moleculares de biomoléculas em células vivas in situ com alta confiabilidade, apesar dos níveis limitados de sinal a ruído em experimentos de células vivas. A janela operacional do FRET e particularmente da FCCS em baixas concentrações permite a análise quantitativa em condições quase fisiológicas.

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Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Apresentamos um protocolo experimental e um fluxo de trabalho de análise de dados para realizar espectroscopia de correlação transversal de fluorescência de células vivas (FCCS) combinada com a transferência de energia de ressonância förster (FRET) para estudar a dinâmica do receptor de membrana em células vivas usando técnicas modernas de rotulagem de fluorescência.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

A espectroscopia de correlação transversal de fluorescência é um método estatístico que usa fluorescência de resultado do tempo para identificar a assinatura dinâmica de receptores acoplados à proteína G em células vivas. Aqui, estamos particularmente interessados.em receptores beta-2 adrenérgicos. Os receptores sphingolipid fornecem principalmente informações sobre a dinâmica de difusão translacional e com a ajuda da anisotropia fluorescência também difusão rotacional.Ao introduzir um rótulo adicional, também podemos promover alterações pró-vinculação ou até mesmo conformacionais se promover a transferência de energia de ressonância entre os rótulos conforme sondado. Fluorescência de tempo quantitativo requer um alinhamento cuidadoso das medidas de configuração e calibração. Nos minutos seguintes, forneceremos um guia experimental para espectroscopia de correlação de fluorescência de células de vida, espectroscopia de correlação cruzada e transferência de energia de ressonância forster de receptores acoplados à proteína G, usando etiquetas clones e força de fluxo sintético.A sessão celular e a transfixação precisam ser realizadas em condições estéreis. Coloque uma barra de deslizamento de tampa limpa em uma placa de seis poços, e lave-a com soro salino tampão de fosfato estéril adicione dois mL de cultura celular com vermelho fenol suplementado com soro bovino 10% fetal, 100 microgramas, per amina penicilina e 100 microgramas por ml streptomicina para cada poço, e mantê-lo de lado. Pegue as células CHO que são cultivadas no mesmo meio com vermelho fenol a 37 graus centígrados em 5% de CO2 e lave-as com cinco mL PBS para remover as células mortas.Adicione dois mL de trippsina e incubar por dois minutos em temperatura ambiente. Diluir as células de dados com oito mL de meio com fenol vermelho e misturar cuidadosamente por pipetação. Conte as células em uma câmara de Neubauer e sente as células a uma densidade de 150.000 células por poço na placa de seis poços contendo o deslizamento de cobertura.Deixe as células crescerem em uma incubadora por 24 horas, a fim de alcançar aproximadamente 80% de confluência. Diluir dois microgramas do DNA vetorial desejado. Por exemplo, CT SNAP ou NT SNAP, e seis microliteres desse reagente de transfecção em dois tubos separados.Cada um contendo 500 microliter reduziu o meio sérico para cada poço e incuba-os por cinco minutos em temperatura ambiente. Misture as duas soluções para obter a mistura de transfecção e incuba-la por mais 20 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, lave as células CHO sentadas uma vez com PBS estéril.Substitua o PBS por um ml por poço de meio livre de fenol vermelho, suplementado com soro bovino 10% fetal e sem antibióticos. Adicione toda a mistura de construção de uma ml gota sábia a cada poço e incubar as células durante a noite a 37 graus em 5% de CO2. Para rotulagem, dilui o substrato SNAP apropriado em um mL médio suplementado com soro bovino fetal de 10% para obter uma concentração final de um micromolar.Lave as células transfeminadas uma vez com PBS e adicione um mL por poço de uma solução de substrato SNAP micromolar. Incubar as células por 20 minutos a 37 graus em 5% de CO2. Lave as células três vezes com o meio livre de fenol vermelho, e adicione dois mL por meio livre de fenol.Incubar as células por 30 minutos a 37 graus centígrados em 5% de CO2. Transfira o deslizamento de cobertura de todas as amostras posteriormente para a câmara de imagem e lave com 500 tampão de imagem Microliter. Adicione 500 tampão de imagem de microliter antes de passar para a configuração FRED FCS.A configuração FRED FCS é equipada com um objetivo de água de microscopia confocal, duas linhas laser, um sistema de contagem estrangeira única de quilter, dois BMTs híbridos e duas ações para coleta de fótons e o software de coleta de dados. É muito crucial alinhar a configuração toda vez antes da medição em células vivas. Para ajustar o foco, o orifício e a posição de coloração, coloque duas soluções de calibração verde nanomolar em um deslizamento de tampa de vidro e ligue o laser de 485 nanômetros e 560 nanômetros operados em estacas, excitação intercalada ou modo PI.Concentre-se na solução e ajuste a posição do anel de pinhole e do colarinho de modo que a maior taxa de contagem e o menor volume confocal sejam obtidos para obter o brilho molecular máximo. Repita este processo para os canais vermelhos com 10 soluçãos de calibração vermelha nanomolar e uma mistura de ambos. Coloque 10 solução de DNA nanomolar no deslizamento de tampa de vidro e ajuste o foco do orifício e a posição do anel da gola de modo que as cores cruzadas entre os canais de detecção verde e vermelho seja mais alta.Essa é a fonte da maior amplitude. Para medições em células vivas, encontre uma célula adequada limitando-se com a lâmpada marcadora e observando através do ocular. Ligue os lasers no modo PI e foque na membrana procurando as contagens máximas por segundo.Por favor, note, a potência do laser pode precisar ser reduzida para as amostras de células. De preferência menos de cinco microwatts no objetivo. Isso depende muito do floral usado e da configuração.Observe as curvas auto e cross coll do AR beta-2 vinculado ao EGP e snap tag probes na pré-visualização on-line do software de coleta de dados e colete várias medidas de classificação com um tempo de aquisição entre 60 e 180 segundos. Exporte o curso de correlação e contraste de todas as medidas. Tome cuidado aqui para definir corretamente as janelas de tempo de solicitação e atraso e use alguma opção de obtenção de micro tempo no software de correlação de dados.No total, são necessárias três correlações diferentes. Correlação automática da janela de tempo do canal verde. Correlação automática dos canais vermelhos e da janela de tempo de atraso.E finalmente a correlação cruzada do sinal do canal verde, e a janela de tempo imediata foi o sinal do canal vermelho na janela de tempo de atraso. Aqui estão as funções de correlação automática do FRED verde e vermelho para soluções e encaixá-las a um modelo de difusão de 3 DT com um termo trigêmeo adicional necessário para calibrar a forma e o tamanho do volume de detecção confocal para os dois canais de cores de uso, onde B é a linha de base da curva e o número de moléculas e foco, TD o tempo de difusão e S, o zero sobre ômega zero o fator de forma do elemento de volume confocal. O piscar trigêmeo e a física fotográfica é descrito como amplitude AR e tempo de relaxamento TR. Use o coeficiente de difusão conhecido para os destaques de calibração verde e vermelho e obtenha fatores de forma para determinar as dimensões e o volume do elemento de volume confocal infeccioso.Calcule o espectro como IFR, o sinal fluorescente verde coletado nos canais zeros, e dois no canal de detecção certo, canal um e três, como uma razão do fundo coletado sinais. Determine a expectativa direta do fluxo de dados aceitadores pelos comprimentos de onda de excitação do doador pela razão do contraste coletado do fundo das medidas de calibração vermelha e a excitação da janela de tempo imediata pelo laser verde para a conta correta de fundo diretamente na excitação da janela de tempo de atraso pelo laser vermelho. Calcule o brilho molecular de B tanto a força de fluxo verde e vermelho com base no contraste coletado em segundo plano, quanto para obter o número de moléculas e foque no ajuste de difusão de 3 DT.Encaixar ambas as correlações ultra do canal verde e vermelho, bem como através da correlação do prompt verde e do atraso vermelho do DNA de nível duplo para o modelo de difusão de 3 DT mantém os fatores em forma de obtenção constantes para as funções de correlação automática. O fator de forma para as funções de correlação cruzada é geralmente entre esses dois valores. Determine a amplitude em tempo de correlação zero com base nos valores da fonte do número aparente de moléculas e foco.Calcular a razão de amplitude para uma amostra foi uma co-difusão de 100% da força do piso verde e vermelho. Coloque as amostras de células em um modelo apropriado. Como eles são mostrados difusão receptor de membrana não é curioso de uma forma bi-modal foi um curto, sem tempo de difusão longa.Além disso, a física fotográfica e piscando para fora da força do chão devem ser considerados. Aqui para TD1 e TD2, estão os dois necessários para os tempos de difusão. E uma é uma fração do primeiro tempo de difusão Em contraste com a medição de calibração em que os dados livres e fios de DNA se difundem, em todas as direções, os receptores de membrana mostram apenas a difusão 2D ao longo das membranas celulares calcula a concentração de proteínas de rótulo verde ou vermelho a partir do respeito do número de moléculas e foco.E o volume do elemento de volume confocal, usando massa tendenciosa. Ajuste as duas correlações de alto da amostra dupla rotulada usando o mesmo modelo do construto de nível único e a função de correlação cruzada usando um modelo de difusão bimodal, Nota para uma descrição global do sistema. Todas as três culturas têm que estar em forma em conjunto.O termo de difusão é idêntico para as três culturas. E a única diferença é que o tempo de reputação cai, a função de correlação cruzada. Calcule a concentração de proteínas de trabalho verde ou vermelho a partir do respectivo número de moléculas e foco e o volume do elemento volume confocal.Estimar a fração ou concentração de proteínas de rótulo verde e vermelho interagindo das amostras de células utilizando os fatores de correção obtidos a partir das amostras de DNA, as razões de amplitude da amostra celular e as respectivas concentrações obtidas. Ajuste as duas correlações alteradas da amostra FRED como uma única amostra rotulada e a correlação frontal com um modelo de difusão bimodal contendo um termo anti correlação, onde a AF reflete a amplitude da correlação total e AR e TR o respectivo tempo de amplitude e relaxamento. No caso de alterações de fluorescência anti-correlacionada devido a fred um ou vários termos anti correlação podem ser necessários, o que resultou em um mergulho da função de correlação cruzada fred em tempos de baixa correlação coincidindo com um aumento nas duas funções de correlação automática.As medidas de calibração das soluções florais verdes e vermelhas para barbear fatores de 6,5 e os canais verdes, e 6,8 nos canais vermelhos. Assim, o volume confocal tem o tamanho de 1,4 e 1,9 femto mais tarde neste dia de medição, o brilho da molécula está em 12,5 quilohertz por molécula, e 2,6 quilohertz por molécula. Temos 15% de crosstalk do floral verde para os canais vermelhos após excitação de doadores e 38% de excitação direta, exceto excitação da forma floral vermelha pelo verde, a partir de nossa medição de DNA, determinamos os fatores de correção para o volume de sobreposição confocal para 0,6 e 0,7 também, as células transfeinadas com um único rótulo construto mostram difusão bimodal bi-modal bidimensional na membrana celular onde cerca de metade das moléculas se difundem lentamente em a escala de tempo de 50 a 100 milissegundos e a outra metade relativamente rápida em torno de dois milissegundos em ambas as construções.Além disso, o piscar trigêmeo está presente. No entanto, no snap de nível vermelho, construa outro tempo de relaxamento é adquirido em 180 microsegundos, o que pode decorrer de unbound snap straight. A partir do rótulo duplo em si, transectado com a construção anti snap onde os dois rótulos em dois lados diferentes da membrana celular, duas medidas a menos foram coletadas o ruído e a camada vermelha sobre a correlação.E a correlação da cruz pi é bastante alta aqui. Aqui 70% das moléculas, se você lentamente abaixo de cem milissegundos de escala de tempo, e apenas 30% rápido em torno de um milissegundo, a fração de moléculas duplas liberadas é baixa e fica entre 15 a 25% Os dados para o snap ct parecem melhores e menos barulhentos. No entanto, a aproximação anti mais profunda esperada não pode ser vista e é provavelmente massa pela alta quantidade de crosstalk, aceitação direta excitação e piscar trigêmeos de força floral, e uma vez que os esquemas de análise de dados aproveitando a intensidade de fluorescência coletada DKS podem ajudar a resgatá-lo como mostrado para o conjunto de dados simulados.A vantagem da técnica Fred FCS é que, juntamente com a mobilidade, podemos investigar a dinâmica da conferência dos GPCRs. No entanto, realizar FCs FRED em laboratórios é desafiador e solicitar boas células transfetaturadas, rotulagem eficiente e uma configuração calibrada perfeita. Apenas um par FRED pro force também é muito crucial.As etapas experimentais críticas incluem a otimização da otimização da transfecção, a minimização do plano de fundo e a fluorescência automática. Além disso, o pipeline de análise de Átomos ajudará a entender a dinâmica de várias dinâmicas dos preceptores em células vivas. Esperamos que este protocolo seja útil para executar a abordagem FRED FCS em experimentos de células vivas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...