Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Этот проект был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, номер проекта 374031971, проект INF) для J.B. и K.G.H.
Мы благодарим Центр Рудольфа Вирхова за финансовую поддержку и Core Unit Fluorescence Imaging за техническую поддержку. Кроме того, мы благодарим Ашвина Балакришнана за тщательную корректуру.

У авторов нет конфликтов, которые можно было бы декларировать.

Флуоресцентная спектроскопия является одним из основных методов количественной оценки динамики белка и белково-белковых взаимодействий с минимальным возмущением в клеточном контексте. Конфокальная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) является одним из мощных методов анализа молекулярной динамики, поскольку она чувствительна к одной молекуле, очень селективна и совместима с живыми клетками1. По сравнению с другими подходами, ориентированными на динамику, FCS имеет более широкий измеримый диапазон времени, охватывающий от ~ ns до ~ s, что наиболее важно для охвата быстрых временных масштабов, которые часто недоступны методами на основе визуализации. Кроме того, он также обеспечивает пространственную селективность, так что мембранная, цитоплазматическая и молекулярная динамика ядра могут быть легко различимы 2. Таким образом, молекулярное моргание, средняя локальная концентрация и коэффициент диффузии могут быть количественно проанализированы с помощью FCS. Межмолекулярная динамика, такая как связывание, становится легко доступной при прозондировании кодиффузии двух молекулярных видов в флуоресцентной перекрестно-корреляционной спектроскопии (FCCS) анализ3,4,5 в двухцветном подходе.
Основным основополагающим принципом корреляционной спектроскопии является статистический анализ флуктуаций интенсивности, излучаемых флуоресцентно мечеными биомолекулами, диффузными в лазерном фокусе и из него(рисунок 1А). Полученные авто- или кросс-корреляционные функции затем могут быть дополнительно проанализированы путем подгонки кривой, чтобы в конечном итоге получить процентные константы скорости. Другими словами, статистические методы FCS и FCCS обеспечивают не следы одной молекулы, как при отслеживании одной частицы, а динамический паттерн или «отпечаток пальца» исследуемого образца с высоким временным разрешением. В сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) внутримолекулярная динамика, такая как конформационные изменения, может контролироваться одновременно в общей конфокальной установке5,6. FRET исследует расстояние двух флуорофоров и часто упоминается как молекулярный «нанорулер». Передача энергии происходит только тогда, когда молекулы находятся в непосредственной близости (< 10 нм), спектр излучения донора значительно перекрывается со спектром поглощения молекулы-акцептора, а дипольная ориентация донора и акцептора (достаточно) параллельна. Таким образом, комбинация FRET и FCCS обеспечивает технику с очень высоким пространственно-временным разрешением. Когда требуется пространственная селективность, чувствительность, а также совместимость с живыми клетками, FRET-FCCS имеет очевидное преимущество перед другими методами, такими как изотермическая титрационная калориметрия (ITC)7,поверхностный плазмонный резонанс (SPR)8или ядерный магнитный резонанс (ЯМР)9,10 для измерения динамики и взаимодействий белков.
Несмотря на возможности и перспективность двухцветной флуоресцентной перекрестно-корреляционной спектроскопии (dc-FCCS), выполнение dc-FCCS в живых клетках технически сложно из-за спектрального кровотечения или перекрестных помех между каналами3,4,разницы в конфокальных объемах из-за спектрально четких лазерных линий3,4,11,фонового сигнала и шума или ограниченной фотостабильности образцов12, 13,14,15. Введение импульсного чередующегося возбуждения (PIE) в FCCS было важной настройкой для временного разъежевания различных лазерных возбуждений для уменьшения спектральных перекрестных помех между каналами16. Другие методы коррекции для противодействия спектральному кровотечению17,18,19 и фоновым коррекциям также были хорошо приняты17,18,19. Для получения подробной информации и основ о FCS, PIE или FRET читатель обращается к следующим ссылкам2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Здесь представлены все необходимые калибровочные эксперименты и анализ вместе с экспериментальными результатами прототипа рецептора, связанного с G-белком, β 2-адренергического рецептора (β2AR), для трех различных сценариев: (1) одномаркированные молекулы, несущие либо «зеленый» (eGFP), либо «красный» (маркировка на основе SNAP-метки)25 флуорофор; (2) двойная маркировка, которая несет N-концевую SNAP-метку и внутриклеточный eGFP (NT-SNAP) [в этом случае обе метки находятся на одном и том же белке. Таким образом, ожидается 100% кодиффузия]; и (3) образец с двойной маркировкой, где оба флуорофора находятся на одной стороне клеточной мембраны (CT-SNAP). Он несет C-терминал SNAP-метку и внутриклеточный eGFP. Здесь, опять же, обе метки находятся на одном и том же белке с ожидаемой 100% кодиффузией. Поскольку обе метки находятся очень близко друг к другу, на одной стороне клеточной мембраны, это показывает потенциал для наблюдения FRET и антикоррелированного поведения. Все конструкции были трансфектированы в клетки китайского хомячка (CHO), а затем помечены красной флуоресцентной подложкой, которая является мембранопроницаемой для конструкции NT-SNAP и мембранопроницаемой для конструкции CT-SNAP. Наконец, смоделированные данные иллюстрируют влияние экспериментальных параметров на антикоррелацию, индуцированную FRET, и влияние белково-белковых взаимодействий на амплитуду кодиффузии.
Таким образом, этот протокол предоставляет полное руководство по выполнению комбинированного FRET-FCCS в живых клетках для понимания динамики белка и белково-белковых взаимодействий, а также для ознакомления с техническими / физическими артефактами, проблемами и возможными решениями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Мы представляем протокол и рабочий процесс для выполнения двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с переносом резонансной энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки. В двухцветной FCCS, где колебания интенсивности флуоресценции представляют собой динамический «отпечаток» соответствующей флуоресцентной биомолекулы, мы можем исследовать кодиффузию или связывание рецепторов. FRET, с его высокой чувствительностью к молекулярным расстояниям, служит известным «нанорулером» для мониторинга внутримолекулярных изменений. Взятые вместе, конформационные изменения и ключевые параметры, такие как концентрации местных рецепторов и константы подвижности, становятся доступными в клеточных условиях.
Количественные флуоресцентные подходы являются сложными в клетках из-за высокого уровня шума и уязвимости образца. Здесь мы покажем, как выполнить этот эксперимент, включая этапы калибровки с использованием двухцветного меченого β2-адренергического рецептора (β2AR), помеченного eGFP и SNAP-tag-TAMRA. Пошаговая процедура анализа данных предоставляется с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом и шаблонов, которые легко настроить.
Наше руководство позволяет исследователям разгадывать молекулярные взаимодействия биомолекул в живых клетках in situ с высокой надежностью, несмотря на ограниченные уровни сигнал-шум в экспериментах с живыми клетками. Рабочее окно FRET и особенно FCCS при низких концентрациях позволяет проводить количественный анализ в почти физиологических условиях.

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Мы представляем экспериментальный протокол и рабочий процесс анализа данных для выполнения двухцветной флуоресцентной перекрестной корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки.

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Визуализация белокбелковых взаимодействия в ядерной и цитоплазматических фракций Co-иммунопреципитации и<em&gt; В Ситу</em&gt; Пробирной Расстояние Лигирование

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...