Name: dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Bu proje Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, proje numarası 374031971, Project INF) tarafından J.B. ve K.G.H.
Rudolf Virchow Center'a finansal destek için ve Çekirdek Birim Floresan Görüntüleme'ye teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca, Ashwin Balakrishnan'a kapsamlı kanıt okuması için teşekkür ederiz.

1. Deneysel Protokol
<ol><li>Numune hazırlama NOT: Steril koşullarda hücre tohumlama ve transfeksiyonunu gerçekleştirin.<ol>
<li>6 kuyulu bir kültür tabağına kuyu başına temizlenmiş bir kapak yerleştirin ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın. NOT: Kapak temizleme protokolü Ek Not 1'deayrıntılı olarak yer lanır.</li>
		<li>Her kuyuya, fenol kırmızısı içeren tam hücre kültürü ortamının 2 mL'sini ekleyin (%10 fetal sığır serumu (FBS), 100 μg/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiştir) ve plakayı bir kenara bırakın.</li>
		<li>CHO hücrelerini 37 °C ve%5 CO2'de fenol kırmızısı içeren aynı ortamda kültüre edin. Ölü hücreleri çıkarmak için hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>2 mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 2 dakika kuluçkaya yaslayın.</li>
		<li>Müstakil hücreleri fenol kırmızısı içeren 8 mL orta ile seyreltin ve pipetleme ile dikkatlice karıştırın.</li>
		<li>Neubauer odasındaki hücreleri sayın ve kapak örtülerini içeren 6 kuyulu hücre kültürü plakasında (adım 1.1.1-1.1.2'de hazırlanan) 1.5 x 105 hücre / kuyu yoğunluğunda tohum.</li>
		<li>Hücrelerin yaklaşık% 80 izdiah elde etmek için24saat boyunca bir inkübatörde (37 °C, % 5 CO 2) büyümesine izin verin.</li>
		<li>İstenen vektör DNA'sının 2 μg'sını (örneğin, CT-SNAP veya NT-SNAP) ve transfeksiyon reaktifinin 6 μL'sini her kuyu için azaltılmış serum ortamının 500 μL'si içeren iki ayrı tüpte seyreltin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Transfeksiyon karışımını elde etmek için iki çözeltiyi karıştırın ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bu arada, tohumlu CHO hücrelerini steril PBS ile bir kez yıkayın.</li>
		<li>PBS'i antibiyotiksiz %10 FBS ile desteklenmiş 1 mL/kuyu fenol kırmızı içermeyen ortamla değiştirin.</li>
		<li>1 mL transfeksiyon karışımının tamamını her kuyuya damla yönünde ekleyin ve hücreleri bir gecede 37 °C'de% 5 CO2'dekuluçkaya bırakın.</li>
		<li>SNAP yapının etiketlenerek, uygun SNAP substrat stok çözeltisini% 10 FBS ile desteklenmiş ortamın 1 mL'sinde seyrelterek 1 μM'lik son bir konsantrasyon elde edin.</li>
		<li>Transfected hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve 1 μM SNAP substrat çözeltisinin kuyusu başına 1 mL ekleyin. Hücreleri% 5 CO 2'de 37 ° C'de20dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücreleri fenol kırmızı içermeyen ortamla üç kez yıkayın ve kuyu başına 2 mL fenol kırmızı içermeyen ortam ekleyin. Hücreleri% 5 CO2'de37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Tüm numunelerin kapaklarını daha sonra görüntüleme odasına aktarın ve 500 μL görüntüleme tamponu ile yıkayın. FRET-FCS kurulumuna geçmeden önce 500 μL görüntüleme tamponu ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrasyon Ölçümleri NOT: FRET-FCS kurulumu bir konfokal mikroskop su hedefi, iki lazer hattı, bir Time-Korelated Tek Foton Sayma (TCSPC) sistemi, iki hibrit fotomultiplier tüp (PMT) ve foton toplama ve veri toplama yazılımı için iki çığ fotodiyot (APD) ile donatılmıştır. Canlı hücre ölçümlerinden önce kurulumu her seferinde hizalamak çok önemlidir. Ayrıntılı kurulum açıklaması Ek Not 2'de bulunabilir. Tüm ölçümlerin aynı koşullarda yapılması gerektiğinden, ölçümler sırasında hem lazerler hem de tüm dedektörler (iki PMT ve iki APD) her zaman AÇıKTıR. Kalibrasyon ölçümleri için, hücrelerin tohumladığı aynı lottan bir kapak kip kullanın, bu yaka halkası düzeltmeslerindeki varyasyonu azaltır.<ol>
<li>Odak, iğne deliği ve yaka halkası konumunu ayarlamak için, cam bir kapak ucuna 2 nM yeşil kalibrasyon çözeltisi yerleştirin ve 485 nm ve 560 nm lazeri kapatın. Lazeri Pulsed Interleaved Excitation (PIE) modunda çalıştırın16.</li>
		<li>Çözeltiye odaklanın ve iğne deliği ve yaka halkası konumunu, maksimum moleküler parlaklığı elde etmek için en yüksek sayım oranı ve en küçük konfokal hacim elde olacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>10 nM kırmızı kalibrasyon çözeltisi ve her ikisinin de yeşil ve kırmızı kalibrasyon çözeltisinin bir karışımı ile kırmızı kanallar için bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>10 nM DNA çözeltisini bir cam kapak ucuna yerleştirin ve odak, iğne deliği ve yaka halkası konumunu yeşil ve kırmızı algılama kanalları arasındaki çapraz korelasyonun en yüksek olduğu, yani en yüksek genliği gösteren şekilde ayarlayın. NOT: En uygun hizalamayı bulmak için adım 1.2.1 ve 1.2.4'ün ileri geri tekrarlanması gerekebilir. Odak, iğne deliği ve yaka halkası konumu yeşil ve kırmızı algılama kanalları ve konfokal örtüşme hacmi için en uygun şekilde hizalandıktan sonra 30 s - 120 s için her kalibrasyon çözümünden 3-5 ölçüm alın.</li>
		<li>Arka plan sayım oranlarını belirlemek için 30 s -120s için ddH 2 O, görüntüleme ortamı ve transfected olmayan bir hücrenin her biri 3-5 kez ölçün.</li>
		<li>30 s - 120 s için 3-5 ölçümle cihaz tepki işlevini toplayın. Bu isteğe bağlıdır, ancak şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücre ölçümleri<ol>
<li>Cıva lambası ile aydınlatarak ve oküler gözleyerek uygun bir hücre bulun. NOT: İlgili yapışan hücre hattının tipik morfolojisini gösteren uygun hücreler canlıdır. İlgi proteininin floresan, burada bir yüzey reseptörü, yüzeyin her yerinde görülebilir. Daha az parlak hücreler, düşük sayıda molekül odakta olduğunda FCS'deki daha iyi kontrast nedeniyle daha parlak olanlardan daha uygundur.</li>
		<li>PIE modunda her iki lazeri de aç ve saniyede maksimum sayıya bakarak zara odaklan. NOT: Hücre örnekleri için lazer gücünün azaltılması gerekebilir (objektif olarak 5 μW'tan az). Bu, kullanılan floroforlara ve kuruluma bağlıdır.</li>
		<li>Veri toplama yazılımının çevrimiçi önizlemesinde eGFP'nin otomatik ve çapraz korelasyon eğrilerini veya β2AR'ye bağlı ETIKETLi SNAP etiketini gözlemleyin ve 60-180 s arasında bir alım süresine sahip birkaç kısa ölçüm (~2 -10) toplayın. NOT: Floroforlar ağartabileceği için hücreleri sürekli olarak uzun süre heyecanlandırmayın. Bununla birlikte, her hücrenin parlaklığına, ölçümlerin ne kadar süre olabileceğine ve toplamda kaç ölçüm yapılabildiğine bağlı olacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Veri analizi
<ol><li>Veri Verme<ol>
<li>Korelasyon eğrilerini, G(tc) ve sayım oranlarını, CR'yi tüm ölçümlerden dışa aktarın.</li>
		<li>"İstem" ve "gecikme" zaman pencerelerini doğru tanımlamaya ve veri korelasyon yazılımında "microtime gating" seçeneğini kullanmaya özenin. NOT: Toplamda üç farklı korelasyon gereklidir: (1) yeşil kanalın istemi zaman penceresinde otomatik korelasyonu(ACFgp),(2) gecikme süresi penceresindeki kırmızı kanalların otomatik korelasyonu (ACFrd) ve son olarak (3) yeşil kanal sinyalinin gecikme süresi penceresindeki kırmızı kanal sinyaliyle çapraz korelasyonu(CCFPIE). Veri dışa aktarma, Tamamlayıcı Not 3'te farklı yazılımlar için adım adım gösterilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrasyon ölçümleri<ol><li>Yeşil (ACFgp) ve kırmızı (ACFrd) florofor çözeltilerinin otomatik algılama işlevlerini kullanın ve kullanılan iki renk kanalı için konfokal algılama hacminin şeklini ve boyutunu kalibre etmek için gerekirse (örneğin 1) ek bir üçüz terimli bir 3D difüzyon modeline takın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png"> eq. 1 Burada, b eğrinin temeli, N odaktaki molekül sayısı, tD difüzyon süresi (ms içinde) ve s = z0/w0 konfokal hacim öğesinin şekil faktörüdür. Üçüz yanıp sönen veya diğer fotofizik, genliği birR ve gevşeme süresi tRile tanımlanır. NOT: Protokol içinde kullanılan tüm değişkenler ve semboller Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
		<li>Konfokal hacim elemanının (eq. 2a-c) boyutlarını (genişlik w0 ve yükseklikz 0) ve hacim Veff'ini belirlemek için yeşil 26 ve kırmızı kalibrasyon standardı27için bilinen D difüzyon katsayılarını ve elde edilen şekil faktörlerini yeşil ve skırmızı olarak kullanın. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg">eq. 2a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg">eq. 2b <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg">eq. 2c NOT: Kalibrasyon parametresinin hesaplanması için şablonlar ek dosyalar (S7) olarak sağlanır.</li>
		<li>Yeşil floresan sinyalinin (0 ve 2 kanallarında toplanan) kırmızı algılama kanallarına (kanal numarası 1 ve 3) arka planda düzeltilmiş (BG) sinyallerin bir oranı olarak α spektral çapraz konuşma α hesaplayın (eq. 3). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg"> eq. 3</li>
		<li>Bağışçının heyecan verici dalga boyu tarafından δ kabul eden floroforun doğrudan heyecanlanması, "prompt" zaman penceresindeki kırmızı kalibrasyon ölçümlerinin arka planda düzeltilen sayım oranının (yeşil lazerle heyecanlanma) "gecikme" zaman penceresindeki (kırmızı lazerle heyecanlanma) arka planda düzeltilen sayım oranına oranına göre belirlenir (eq. 4). <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png"> eq. 4</li>
		<li>Hem yeşil hem de kırmızı floroforların (eq. 5a-b) moleküler parlaklığını, arka planda düzeltilmiş sayım oranlarına ve odaktaki elde edilen molekül sayısına göre hesaplayın, N, 3D difüzyon uyumundan (eq. 1): <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg">eq. 5a <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg">eq. 5b</li>
		<li>3D difüzyon modeline hem ACF gp hem de ACFrd hem de çift etiketli DNA'nın CCFPIE'ını takın (eq. 1). Elde edilen şekil faktörlerini, syeşil ve skırmızı, ACFgp ve ACFrdiçin sabit tutun. CCFPIE, sPIE için şekil faktörü genellikle bu iki değer arasındadır. NOT: İdeal bir kurulumda, hem Veff,hem yeşil hem de Veff, kırmızı aynı boyuta sahip olur ve mükemmel bir şekilde üst üste binar.</li>
		<li>Odaktaki molekül sayısının bulunan değerlerine (Nyeşil , N kırmızı ve NPIE)bağlı olarak, sıfır korelasyon süresi olan G0(tc) genliğini belirleyin. </li>
		<li>Yeşil ve kırmızı floroforların %100 birlikte yayılmasına sahip bir numune için genlik oranı rGR ve rRG'yi hesaplayın (eq. 6). NPIE'ın odaktaki çift etiketli molekül sayısını yansıtmadığını, sadece 1/G0(tc)yansıttığını unutmayın. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg">ve <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg"> eq. 6</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücre denemeleri<ol><li>Tek etiketli yapılar için hücre örneklerini uygun bir modele sığdırın. Gösterilen membran reseptörü için difüzyon, kısa ve uzun bir difüzyon süresi ile bimodal bir şekilde gerçekleşir. Ek olarak, fotofizik ve floroforların yanıp sönme göz önünde bulundurulmalıdır: <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png"> eq. 7 Burada, td1 ve td2 gerekli iki difüzyon süresidir ve 1 ilk difüzyon süresinin kesirleridir. NOT: Serbest boyaların ve DNA iplikçiklerinin her yöne serbestçe dağıldığı kalibrasyon ölçümlerinin aksine, membran reseptörü hücre zarları boyunca sadece 2D difüzyon gösterir. 3D ve 2D difüzyon arasındaki bu fark, 2D durumda tD'nin konfokal hacim öğesinin şekil faktörü s'lere bağlı olmadığı değiştirilmiş difüzyon terimi (eşlem 1 ile karşılaştırın) tarafından yansıtılır.</li>
		<li>Temel matematiği kullanarak ilgili N ve V eff'den yeşil veya kırmızı etiketli proteinlerin c konsantrasyonunun hesaplayın (eq. 8): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg">eq. 8 burada NA = Avogadro'nun numarası</li>
		<li>N-terminal SNAP etiketi ve hücre içi eGFP için, IKI taraflı örneklemlerin iki otomatik tutarlılığına (ACFgp ve ACFrd) acf'ler için tek etiketli yapılar (örneğin 7) ve CCFPIE için bimodal difüzyon modeli (eq. 9) kullanarak aynı modeli kullanarak sığdırın: <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg">eq. 9 NOT: Sistemin genel bir açıklaması için, üç eğrinin de ortaklaşa sığdırılması gerekir: Difüzyon terimi her üç eğri için de aynıdır ve tek fark CCFPIEiçin gevşeme terimidir. İki floroforun fotofizikleri genellikle ilgisiz olduğundan, korelasyon terimi gerekmez. Gevşeme terimlerinin bu yokluğu, kısa korelasyon sürelerinde düz bir CCFPIE ile sonuçlanır. Bununla birlikte, donör floroforu nedeniyle alıcının çapraz konuşma ve doğrudan çıkarılması yanlış-pozitif genlikler gösterebilir ve kalibrasyon ölçümlerini kullanmak için dikkatlice kontrol edilmelidir.</li>
		<li>Denklem 8 kullanarak ilgili N ve Veff'den yeşil veya kırmızı etiketli proteinlerin c konsantrasyonunun hesaplayın.</li>
		<li>DNA örneklerinden elde edilen düzeltme faktörlerini, hücre örneğinin genlik oranlarını r GR ve r RG'yive ilgili elde edilen konsantrasyonlarını kullanarak hücre örneklerinden yeşil ve kırmızı etiketli proteinlerin etkileşime girmesinin c GR veya c RG olan fraksiyonunu veya konsantrasyonunu tahmin edin (eq. 10). <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg"> ve <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg"> eq. 10</li>
		<li>C-terminal SNAP etiketi ve hücre içi eGFP için, FRET örneğinin iki otomatik korelasyonunu (ACFgp ve ACFrd) tek etiketli örnekler (denklem 7) ve CCFFRET'i korelasyon önleyici terim içeren bir bimodal difüzyon modeline (denklem 11) sığdırın <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png"> eq. 11 burada birf, toplam anti-korelasyonun genliğini ve ilgili genlik ve gevşeme süresininR ve tR'sını yansıtır. NOT: FRET'e bağlı anti-korelasyonlu floresan değişiklikleri durumunda, bir veya birkaç korelasyon karşıtı terim gerekebilir (eq. 11), iki otomatik korelasyonda(ACFgp ve ACFrd)bir yükselişle çakışan düşük korelasyon zamanlarında CCFFRET'in "düşüşü" ile sonuçlanır. Bununla birlikte, üçlü yanıp sönme gibi fotofiziklerin FRET kaynaklı anti-korelasyonu sönümleyerek anti-korelasyon terimini maskeleyebileceğini unutmayın. Filtrelenmiş FCS yöntemleriyle desteklenmiş bir ortak analiz, korelasyon önleyici terimin maskesini düşürmeye yardımcı olabilir. Ayrıca, nanosaniye aralığındaki sayım elektroniğindeki ölü zamanlardan kaynaklanan teknik eserler hariç tutulmalıdır16. ChiSurf28'de analizin nasıl gerçekleştirildiğine dair daha ayrıntılı bir adım adım prosedür ve konfokal hacim veya moleküler parlaklığın hesaplanması için şablonlar Github deposunda (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) ve ek dosyalar olarak sağlanmaktadır (Tamamlayıcı Not 4 ve Tamamlayıcı Not 6). Ayrıca, .ptu biçiminde Symphotime yazılımıyla elde edilen verilerin toplu olarak dışa aktarılması için python komut dosyaları burada bulunabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çakışma yoktur.

Floresan spektroskopi, hücresel bağlamda minimum pertürbasyon ile protein dinamiklerini ve protein-protein etkileşimlerini ölçmek için ana yöntemlerden biridir. Konfokal floresan korelasyon spektroskopisi (FCS), tek moleküllü duyarlı, son derece seçici ve canlı hücre uyumlu olduğu için moleküler dinamikleri analiz etmek için güçlü yöntemlerden biridir1. Diğer dinamik yönelimli yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, FCS ~ ns'den ~ s'ye kadar uzanan daha geniş bir ölçülebilir zaman aralığına sahiptir ve en önemlisi görüntüleme tabanlı yöntemlerle erişilemeyen hızlı zaman ölçeklerini kapsar. Ayrıca, membran, sitoplazmik ve çekirdek moleküler dinamiklerinin kolayca ayırt edilebilmesi için mekansal seçicilik sağlar 2. Böylece, moleküler yanıp sönme, ortalama lokal konsantrasyon ve difüzyon katsayısı FCS ile nicel olarak analiz edilebilir. Floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) analizi3,4,5'te iki moleküler türün eş difüzyonunu çift renkli bir yaklaşımla yoklarken bağlama gibi intermoleküler dinamiklere kolayca erişilebilir hale gelir.
Korelasyon spektroskopisinde temel prensip, lazer odağının içinde ve dışında yayılan floresan etiketli biyomoleküllerin yaydığı yoğunluk dalgalanmalarının istatistiksel analizidir (Şekil 1A). Elde edilen otomatik veya çapraz korelasyon işlevleri daha sonra sonunda faiz oranı sabitlerini türetmek için eğri uydurma ile daha fazla analiz edilebilir. Başka bir deyişle, istatistiksel yöntemler FCS ve FCCS, tek parçacık izlemede olduğu gibi tek molekül izleri sağlamaz, ancak yüksek zamansal çözünürlüğe sahip bir problanmış numunenin dinamik bir deseni veya "parmak izi" sağlar. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ile birleştirildiğinde, konformasyon değişiklikleri gibi intramoleküler dinamikler aynı anda ortak bir konfokal kurulumda izlenebilir5,6. FRET iki floroforun mesafesini araştırır ve genellikle moleküler "nanoruler" olarak adlandırılır. Enerji transferi sadece moleküller yakın çevredeyken (< 10 nm) gerçekleşir, donörün emisyon spektrumu, alıcı molekülün emilim spektrumu ile önemli ölçüde örtüşir ve donörün ve alıcının dipol yönelimi (yeterince) paraleldir. Böylece, FRET ve FCCS kombinasyonu çok yüksek mekansal-zamansal çözünürlüğe sahip bir teknik sağlar. Mekansal seçicilik, hassasiyet ve canlı hücre uyumluluğu gerektiğinde, FRET-FCCS protein dinamiklerini ve etkileşimlerini ölçmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetresi (ITC)7, Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR)8veya Nükleer Manyetik Rezonans (NMR)9,10 gibi diğer yöntemlere göre belirgin avantajlıdır.
Çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (dc-FCCS) yeteneklerine ve sözüne rağmen, canlı hücrelerde DC-FCCS gerçekleştirmek,3,4, kanallar arasındaki spektral kanama veya çapraz konuşma nedeniyle teknik olarakzordur,spektral olarak farklı lazer çizgileri nedeniyle konfokal hacimlerdeki fark3,4,11, arka plan sinyali, ve gürültü veya örneklerin sınırlı fototability12, 13,14,15. Nabız aralanmış eksitasyonun (PIE) FCCS'ye tanıtılması, kanallar arasındaki spektral çapraz sapını azaltmak için farklı lazer eksitasyonlarını zamansal olarak ayırmak için önemli bir inceayardı 16. Spektral kanamaya karşı koymak için diğer düzeltme yöntemleri17,18,19 ve arka plan düzeltmeleri de iyi kabul edilmiştir17,18,19. FCS, PIE veya FRET ile ilgili ayrıntılar ve temel bilgiler için okuyucu aşağıdaki referanslara atıfta bulunulmaktadır2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Burada, üç farklı senaryo için prototipik G-protein bağlantılı reseptörün β2-adrenerjik reseptörün (β2AR) deneysel sonuçlarıyla birlikte gerekli tüm kalibrasyon deneyleri ve analizleri sunulmaktadır: (1) "yeşil" (eGFP) veya "kırmızı" (SNAP etiket tabanlı etiketleme) taşıyan tek etiketli moleküller25 fluorophore; (2) N-terminal SNAP etiketi ve hücre içi eGFP (NT-SNAP) taşıyan çift etiketli bir yapı [bu durumda, her iki etiket de aynı proteindedir. Böylece %100 ortak difüzyon beklenir]; ve (3) her iki floroforun hücre zarının (CT-SNAP) aynı tarafında olduğu çift etiketli bir örnek. C-terminal SNAP etiketi ve hücre içi eGFP taşır. Burada, yine her iki etiket de aynı proteindedir ve yine% 100 ko-difüzyon beklenir. Her iki etiket de birbirine çok yakın olduğundan, hücre zarının aynı tarafında, FRET ve antikor ilişkili davranışı gözlemleme potansiyelini gösterir. Tüm yapılar Çin Hamster Yumurtalık (CHO) hücrelerine transktriye edildi ve daha sonra NT-SNAP yapısı için membran geçirimsiz ve CT-SNAP yapısı için membran geçirgen olan kırmızı bir floresan substrat ile etiketlendi. Son olarak, simüle edilmiş veriler, deneysel parametrelerin FRET kaynaklı antikorrelasyon üzerindeki etkisini ve protein-protein etkileşimlerinin ko-difüzyon genliği üzerindeki etkisini örneklemektedir.
Bu nedenle, bu protokol, teknik / fiziksel eserlerden, zorluklardan ve olası çözümlerden haberdar olurken protein dinamiklerini ve protein-protein etkileşimlerini anlamak için canlı hücrelerde birleşik FRET-FCCS'yi gerçekleştirmek için eksiksiz bir kılavuz sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Telescope in 4f configuration with five lenses</td>
			<td>Qioptiq, Rhyl, UK</td>
			<td>G063126000</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Band pass filters Brightline</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC 525/50 and HC 600/52</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Dichroic beam splitter</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>HC BS F38-573</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate Nunc</td>
			<td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td>140675</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A20003</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASI stage PZ-2000 XYZ</td>
			<td>Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany</td>
			<td>WK-XYB-PZ-IX71</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for&#160; 25 mm round coverslips</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Glass coverslip holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)</td>
			<td>Laser Components GmbH, Olching, Germany</td>
			<td>SPCM-AQR-14</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamsplitter</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>10FC16PB.3</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender (Software)</td>
			<td>Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)</td>
			<td>---</td>
			<td>Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese hamster ovary (CHO) cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td>Cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChiSurf (Data analysis Software)</td>
			<td>Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA</td>
			<td>---</td>
			<td>tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf 
			Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&#38;t=2s 
			Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>472476-2.5L</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA strand (40 bp fluorophore distance)</td>
			<td>IBA Lifesciences GmbH (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>---</td>
			<td>Reagent, 5&#8217; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&#8217;, 3&#8217; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>P04-41250, P04-41650</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>34852-1L-M</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrosin B,Dye content &#62;=95 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>200964-5G</td>
			<td>Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom&#160; (Berlin, Germany)</td>
			<td>S 0615</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q</td>
			<td>Excelitas Technologies, Ontario, Canada</td>
			<td>XI120-Q-5060</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9105S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549</td>
			<td>New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)</td>
			<td>S9112S</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>111640</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Controller</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>910020 (PDL 828-S &#34;SEPIA II&#34;)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser lines (480 nm and 560 nm)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFD suite (Software)</td>
			<td>AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>Second part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)</td>
			<td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640110</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 stand</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>IX2-ILL100</td>
			<td>Microscope Parts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>049M4857V</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinhole (50 &#181;M)</td>
			<td>Newport, Darmstadt, Germany</td>
			<td>PNH-50</td>
			<td>Pinhole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Hybrid-40</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>932200 (PMA Hybrid 40)</td>
			<td>Single photon counting detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python scripts (Software)</td>
			<td>Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany</td>
			<td>---</td>
			<td>Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)</td>
			<td>AHF, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td>F73-421PH</td>
			<td>Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>02126</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>931073 (SPT64-1+2 single user )</td>
			<td>Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400</td>
			<td>Picoquant, Berlin, Germany</td>
			<td>930010 (Hydraharp 400)</td>
			<td>Optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)</td>
			<td>T4299-100ml</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm</td>
			<td>Thorlabs, Bergkirchen, Germany</td>
			<td>ACN127-020-A</td>
			<td>First part of Beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td>UPLSAPO60XW</td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy to study protein-protein interaction and protein dynamics in live cells

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için bir protokol ve iş akışı sunuyoruz. Floresan yoğunluğundaki dalgalanmaların ilgili floresan biyomolekülün dinamik "parmak izini" temsil ettiği çift renkli FCCS'de, reseptörlerin ortak difüzyonunu veya bağlanmasını araştırabiliriz. FRET, moleküler mesafelere karşı yüksek hassasiyeti ile, intramoleküler değişiklikleri izlemek için iyi bilinen bir "nanoruler" görevi görür. Birlikte ele alındığında, konformasyon değişiklikleri ve yerel reseptör konsantrasyonları ve hareketlilik sabitleri gibi temel parametreler hücresel ortamlarda erişilebilir hale gelir.
Nicel floresan yaklaşımları, yüksek gürültü seviyeleri ve numunenin güvenlik açığı nedeniyle hücrelerde zorlayıcıdır. Burada, eGFP ve SNAP-tag-TAMRA etiketli çift renkli etiketli β2-adrenerjik reseptör (β2AR) kullanılarak kalibrasyon adımları da dahil olmak üzere bu deneyin nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Özelleştirilebilen açık kaynaklı yazılımlar ve şablonlar kullanılarak adım adım veri analizi yordamı sağlanır.
Kılavuzumuz, araştırmacıların canlı hücre deneylerindeki sınırlı sinyal-gürültü seviyelerine rağmen, canlı hücrelerdeki biyomoleküllerin moleküler etkileşimlerini yerinde yüksek güvenilirlikle çözmelerini sağlar. FRET ve özellikle FCCS'nin düşük konsantrasyonlardaki çalışma penceresi, fizyolojik koşullara yakın koşullarda nicel analize izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells at JoVE.com

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Floresan çapraz korelasyon spektroskopisi, canlı hücrelerde G proteini bağlantılı reseptörlerin dinamik imzasını belirlemek için zaman sonucu floresan kullanan istatistiksel bir yöntemdir. Burada, özellikle beta-2 adrenerjik reseptörlerle ilgileniyoruz. Sphingolipid reseptörleri esas olarak çevirisel difüzyon dinamikleri hakkında bilgi sağlar ve floresan anizotropi yardımıyla da rotasyonel difüzyon sağlar.Ek bir etiket sunarak, etiketler arasında problanmış olarak rezonans enerjisi transferini teşvik ederse, bağlayıcı ve hatta konformasyonsal değişiklikler de yapabiliriz. Nicel zaman çözümlenen floresan, kurulum ve kalibrasyon ölçümlerinin dikkatli bir şekilde hizalamasını gerektirir. İlerleyen dakikalarda, klonlamalı etiketler ve sentetik akış kuvveti kullanarak G proteini bağlantılı reseptörlerin yaşam hücresi floresan korelasyon spektroskopisi, çapraz korelasyon spektroskopisi ve Forster rezonans enerji transferi için deneysel bir kılavuz sunacağız.Hücre oturma ve transfixing steril koşullarda yapılmalıdır. Altı kuyu kültür tabağına temiz bir kapak kayması halteri yerleştirin ve steril fosfat tampon salin ile yıkayın, her kuyuya% 10 fetal sığır serumu, 100 mikrogram, amin penisilin başına ve ml streptomisin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş fenol kırmızısı ile iki mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve bir kenara saklayın. Yüzde beş CO2'de 37 derecelik derecelik fenol kırmızısı ile aynı ortamda kültürlenen CHO hücrelerini alın ve ölü hücreleri çıkarmak için beş mL PBS ile yıkayın.İki mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yaslayın. Veri hücrelerini sekiz mL orta ile fenol kırmızısı ile seyreltin ve pipetleme ile dikkatlice karıştırın. Bir Neubauer odasındaki hücreleri sayın ve kapak kaymasını içeren altı kuyu kültürü plakasında kuyu başına 150.000 hücre yoğunluğunda hücreleri oturtun.Hücrelerin yaklaşık% 80 izdiah elde etmek için 24 saat boyunca bir inkübatörde büyümesine izin verin. İstenen vektör DNA'sının iki mikrogramını seyreltin. Örneğin, CT SNAP veya NT SNAP ve bu transfeksiyon reaktifinin altı mikroliteri iki ayrı tüpe dönüştürülür.Her biri her kuyu için 500 mikroliter azaltılmış serum ortamı içerir ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırılır. Transfeksiyon karışımını elde etmek için iki çözeltiyi karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika daha kuluçkaya bırakın. Bu arada, oturulan CHO hücrelerini steril PBS ile bir kez yıkayın.PBS'yi% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik içermeyen fenol kırmızısı içermeyen ortamın kuyusu başına bir ml ile değiştirin. Her kuyuya bir ml'lik damlanın tüm inşaat karışımını ekleyin ve hücreleri bir gecede yüzde beş CO2'de 37 derecede kuluçkaya yatırın. Etiketleme için, uygun SNAP substratını% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş bir mL ortamında seyrelterek bir mikromolar son konsantrasyonu elde edin.Transfected hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve bir mikromolar SNAP substrat çözeltisinin kuyusu başına bir mL ekleyin. Hücreleri yüzde beş CO2'de 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatır. Hücreleri fenol kırmızı serbest ortamla üç kez yıkayın ve kuyu başına iki mL fenol kırmızı serbest ortam ekleyin.Hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yüzde beş CO2'de kuluçkaya yatır. Tüm numunelerin kapak fişini daha sonra görüntüleme odasına aktarın ve 500 Mikroliter görüntüleme Tamponu ile yıkayın. FRED FCS kurulumuna geçmeden önce 500 mikroliter görüntüleme tamponu ekleyin.FRED FCS kurulumu bir konfokal mikroskopi su hedefi, iki lazer hattı, bir zaman quilter tek yabancı sayım sistemi, iki hibrid BMT ve foton toplama ve veri toplama yazılımı için iki hisse senedi ile donatılmıştır. Canlı hücrelerde ölçümden önce kurulumu her seferinde hizalamak çok önemlidir. Odak, iğne deliği ve renklendirme pozisyonunu ayarlamak için, cam kapak kaymasına iki nanomoler yeşil kalibrasyon çözeltisi yerleştirin ve kazıklar, aralanmış heyecan veya PI modunda çalıştırılan 485 nanometre ve 560 nanometre lazeri çalıştırın.Çözeltiye odaklanın ve iğne deliği ve yaka halkası konumunu, maksimum moleküler parlaklığı elde etmek için en yüksek sayım oranı ve en küçük konfokal hacim elde olacak şekilde ayarlayın. 10 nanomoler kırmızı kalibrasyon çözeltisi ve her ikisinin bir karışımı ile kırmızı kanallar için bu işlemi tekrarlayın. Cam kapak kaymasına 10 nanomolar DNA çözeltisi yerleştirin ve iğne deliğinin odağını ve yaka halkası konumunu yeşil ve kırmızı algılama kanalları arasındaki çapraz renklerin en yüksek olduğu şekilde ayarlayın.Bu en yüksek genliği kaynaktır. Canlı hücrelerdeki ölçümler için, işaret lambası ile sınırlayarak ve oküler gözleyerek uygun bir hücre bulun. Pi modunda her iki lazeri de aç ve saniyede maksimum sayıyı arayarak zara odaklan.Hücre örnekleri için lazer gücünün azaltılması gerekebileceğini lütfen unutmayın. Tercihen hedefte beş mikrowatt'tan az. Bu, kullanılan floral ve kuruluma bağlıdır.Veri toplama yazılımının çevrimiçi önizlemesinde EGP'ye bağlı beta-2 AR'nin otomatik ve çapraz harman eğrilerini gözlemleyin ve etiket problarını tutturun ve 60 ila 180 saniye arasında bir alım süresiyle birkaç sıralama ölçümü toplayın. Korelasyon seyrini ve kontrastı tüm ölçümlerden dışa aktarın. İstem ve gecikme süresi pencerelerini doğru bir şekilde tanımlamak ve veri korelasyon yazılımında mikro zaman alma seçeneğini kullanmak için lütfen burada dikkatli olun.Toplamda üç farklı korelasyon gereklidir. Yeşil kanal istemi zaman penceresinin otomatik korelasyonu. Kırmızı kanalların otomatik korelasyonu ve gecikme süresi penceresi.Ve son olarak yeşil kanal sinyalinin çapraz korelasyonu ve istemin zaman aralığı gecikme süresi penceresindeki kırmızı kanal sinyaliydi. İşte çözümler için yeşil ve kırmızı FRED'nin otomatik korelasyon fonksiyonları ve bunları, B'nin eğrinin temeli ve molekül ve odak sayısı olduğu iki kullanım renk kanalı için konfokal algılama hacminin şeklini ve boyutunu kalibre etmek için gereken ek bir üçlü terime sahip 3 DT difüzyon modeline sığdırmak, Difüzyon süresi ve S, omega sıfır üzerinde sıfır, konfokal hacim elemanının şekil faktörü. Üçüz yanıp sönme ve fotoğraf fiziği genlik AR ve gevşeme süresi TR olarak tanımlanır. Enfektif konfokal hacim elemanının boyutlarını ve hacmini belirlemek için yeşil ve kırmızı kalibrasyon standları için bilinen difüzyon katsayısını kullanın ve şekil faktörleri elde edin.SPEKTRUMU IFR, kanal sıfırlarında toplanan yeşil floresan sinyali ve iki doğru algılama kanalına, kanal bir ve üçe kadar, toplanan arka plan sinyallerinin bir oranı olarak hesaplayın. Donör ekscitasyon dalga boyları tarafından kabul eden veri akışının doğrudan beklentisini, kırmızı kalibrasyon ölçümlerinin arka plan toplanan kontrastının oranına ve yeşil lazerle hızlı zaman penceresinin doğrudan kırmızı lazerle gecikme süresi penceresi ekscitasyonunda arka plan doğru hesabına oranına göre belirleyin. Toplanan kontrastı arka plana göre hem yeşil hem de kırmızı akış kuvvetinin B'nin moleküler parlaklığını hesaplayın ve molekül sayısını elde etmek ve 3 DT difüzyon uyumuna odaklanmak için.Hem yeşil ve kırmızı kanaldan ultra korelasyonlara hem de çift seviyeli DNA'nın yeşil isteminden kırmızı gecikmesine ve 3 DT difüzyon modeline kadar korelasyon boyunca, elde edilen şekilli faktörleri otomatik korelasyon işlevleri için sabit tutar. Çapraz korelasyon işlevlerinin şekil faktörü genellikle bu iki değer arasındadır. Görünür molekül ve odak sayısının yazı tipi değerlerine göre sıfır korelasyon zamanında genliği belirleyin.Bir numune için genlik oranının yeşil ve kırmızı zemin kuvvetinin%100 ortak difüzyonu olduğunu hesaplayın. Hücre örneklerini uygun bir modele sığdırın. Membran reseptör difüzyonlarının iki modlu bir şekilde nasıl gösterildiği kısa ve uzun bir difüzyon süresi değildi.Ayrıca, fotoğraf fiziği ve zemin kuvvetini yanıp sönen göz kırpma göz önünde bulundurulmalıdır. TD1 ve TD2'ye, difüzyon süreleri için gerekli olan ikisi. Ve biri ilk difüzyon süresinin bir kısmı Serbest zar ve DNA iplikçiklerinin difüzyon yaptığı kalibrasyon ölçümünün aksine, tüm yönler, membran reseptörleri hücre zarları boyunca sadece 2D difüzyon gösterir, molekül sayısı ve odak açısından yeşil veya kırmızı etiket proteinlerinin konsantrasyonunu hesaplar.Ve konfokal hacim elemanının hacmi, önyargılı kütle kullanarak. Tek düzeyli yapı ile aynı modeli ve iki modlu difüzyon modeli kullanarak çapraz korelasyon işlevini kullanarak çift etiketli örneğin iki alto korelasyonunu sığdırın, sistemin genel açıklaması için Not. Üç ürün de ortaklaşa sığmalı.Difüzyon terimi her üç ürün için de aynıdır. Ve tek fark, itibar zamanının düşmesi, çapraz korelasyon fonksiyonudur. Yeşil veya kırmızı işgücü proteinlerinin konsantrasyonunu ilgili molekül ve odak sayısından ve konfokal hacim elemanının hacminden hesaplayın.DNA örneklerinden elde edilen düzeltme faktörlerini, hücre örneğinin genlik oranlarını ve ilgili elde edilen konsantrasyonları kullanarak hücre örneklerinden etkileşime giren yeşil ve kırmızı etiket proteinlerinin fraksiyonunu veya konsantrasyonunu tahmin edin. FRED örneğinin iki alter korelasyonunu tek etiketli örnek olarak ve ön çapraz korelasyonu, AF'nin toplam anti korelasyon ve AR ve TR'nin genliğini ilgili genlik ve gevşeme süresini yansıttığı bir anti korelasyon terimi içeren iki modlu difüzyon modeline sığdırın. Fred'e bağlı anti-korelasyonlu floresan değişiklikleri durumunda bir veya birkaç anti korelasyon terimleri gerekebilir, bu da fred çapraz korelasyon fonksiyonunun düşük korelasyon zamanlarında bir düşüşe neden oldu ve iki otomatik korelasyon fonksiyonunda bir artışa neden oldu.6.5 ve yeşil kanallarda ve kırmızı kanallarda 6.8 tıraş faktörlerine yeşil ve kırmızı çiçek çözeltilerinin kalibrasyon ölçümleri. Bu nedenle, konfokal hacim bu ölçüm gününün ilerleyen saatlerinde 1.4 ve 1.9 femto boyutuna sahiptir, molekül parlaklığı molekül başına 12.5 kilohertz ve molekül başına 2.6 kilohertz'dir. Donör ekscitasyonundan sonra yeşil çiçekten kırmızı kanallara çapraz konuşmanın %15'ine ve kırmızı çiçek formunun yeşil tarafından heyecanlanması dışında doğrudan %38'ine sahibiz. DNA ölçümümüzden, konfokal örtüşme hacminin düzeltme faktörlerini de 0,6 ve 0,7'ye belirleriz, tek etiket yapısı ile trans enfekte olan hücreler, moleküllerin kabaca yarısının yavaşça yayıldığı hücre zarında iki modlu iki boyutlu difüzyon gösterir 50 ila yüz milisaniyelik zaman ölçeği ve diğer yarısı her iki yapıda da nispeten hızlıdır.Ayrıca, üçlü yanıp sönme mevcuttur. Bununla birlikte, kırmızı düzeyde yapı yapısında, 180 mikrosaniyede başka bir gevşeme süresi elde edilir, bu da İlişkisiz düz bir şekilde tutturulduğunu gösterebilir. Hücre zarının iki farklı tarafındaki iki etiketin bulunduğu anti snap yapısı ile transekte edilmiş çift etiketin kendisinden, gürültü ve kırmızı kaplama korelasyon üzerine iki daha az ölçüm toplanmıştır.Ve PI çapraz korelasyonu burada oldukça yüksek. Burada moleküllerin % 70'i, yüz milisaniyelik zaman ölçeğinin altında yavaş ve sadece% 30'u bir milisaniye civarında hızlıysanız, çift serbest moleküllerin fraksiyonu düşüktür ve% 15 ila 25 arasındadır CT snap için veriler daha iyi görünür ve daha az gürültülüdür. Bununla birlikte, beklenen ön en derin anti korelasyon görülemez ve büyük olasılıkla yüksek miktarda çapraz konuşma, her iki çiçek kuvvetinin doğrudan kabul ekscitasyonu ve üçüz yanıp sönmesi ile kütledir ve toplanan floresan yoğunluğundan yararlanan veri analiz şemaları DKS, simüle edilmiş veri kümesi için gösterildiği gibi bunu kurtarmaya yardımcı olabilir.Fred FCS tekniğinin avantajı, mobilite ile birlikte GPCR'lerin konferans dinamiklerini araştırabilmemizdir. Bununla birlikte, LABORATUVARLARDA FRED DC'leri gerçekleştirmek zordur ve iyi transfected hücreler, verimli etiketleme ve mükemmel kalibre edilmiş kurulum talep eder. Sadece bir FRED çift pro gücü de çok önemlidir.Kritik deneysel adımlar arasında transfeksiyon optimizasyonunun optimizasyonu, arka planın en aza indirilmesi ve otomatik floresan sayılmaktadır. Ayrıca ve Atom analiz işlem hattı canlı hücrelerde preseptörlerin çeşitli dinamiklerini anlamaya yardımcı olacaktır. Bu protokolün canlı hücre deneylerinde FRED FCS yaklaşımını gerçekleştirmenin yararlı olacağını umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...