Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

يشكر المؤلفان كورتوت وسيباستيان مونك من LiMoNe، مجموعة الأبحاث البيولوجيا العصبية الجزيئية (VIB-KU Leuven) على نصائحهما بشأن تسجيلات الفلورية العابرة للكالسيوم الحية. وقد دعم هذا البحث كل من لجنة فولبرايت في بلجيكا ولكسمبرغ، وكو لوفين (C1 وصندوق "فتح المستقبل")، وهيئة الأبحاث VIB، ووكالة الابتكار بالعلم والتكنولوجيا( IWT؛ ومنظمة الاستشارات العلمية والتقنية؛ ومنظمة الاستشارات العلمية والتقنية؛ ومنظمة التعاون التقني في مجال التكنولوجيا والابتكار؛ ومنظمة التعاون التقني؛ ومنظمة التعاون والتنمية في مجال التكنولوجيا والابتكار؛ ومنظمة التعاون والتنمية في مجال التكنولوجيا والابتكار؛ ومنظمة التعاون والتنمية في مجال التكنولوجيا SBO-iPSCAF)، "صندوق فلاندرز البحث العلمي" (FWO-فلاندرين)، الهدف ALS، ALS Liga België (علاج ل ALS)، الحكومة البلجيكية (برنامج أعمدة الجذب بين الجامعات P7/16 الذي بدأه مكتب السياسة العلمية الاتحادي البلجيكي)، ومؤسسة تييري لاتران و"جمعية بيلجي كونتري ليه مالادس العصبية-موسكولايير" (ABMM). T.V. و J.B. يتم دعمها من قبل زمالات الدكتوراه التي تمنحها FWO-فلاندرين.

L.V.D.B لديه براءة اختراع على استخدام مثبطات HDAC في مرض شاركوت ماري توث (الولايات المتحدة-2013227717-A1)، هو المؤسس المشارك العلمي لشركة أوغسطين للعلاجات، وعضو في مجلسها الاستشاري العلمي. ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

يصف البروتوكول طريقة سهلة الاستخدام نسبيا ، والتي تولد وحدات حركية بشرية مع NMJs وظيفية في أجهزة microfluidic المتاحة تجاريا في أقل من 30 يوما. ويوصف كيف يمكن تقييم NMJs مورفولوجيا من خلال التقنيات القياسية مثل المحكمة الجنائية الدولية وSEM ووظيفيا من خلال تسجيلات الكالسيوم الخلايا الحية.
ميزة كبيرة لهذا البروتوكول هو استخدام تكنولوجيا الخلايا الجذعية. وهذا يسمح بالقدرة الكاملة على التكيف حيث يمكن تقييم NMJs في كل من الصحة والمرض، بغض النظر عن ملف المانحين. وقد أثبت النموذج نجاحه ومفيده بالفعل في أبحاث ALS ، حيث حددنا العاهات في نمو النيوريت ، وإعادة النمو ، وأرقام NMJ كأنماط ظاهرة جديدة بسبب الطفرات في جين FUS18. مع هذا النموذج، فمن الممكن لتوسيع نطاق البحث لتشمل أشكال متفرقة من ALS، حيث المسببات غير معروف، وذلك باستخدام iPSCs من المرضى ALS متفرقة. وهذا يوفر ميزة على النماذج الحيوانية التقليدية، التي تعتمد على التعبير المفرط المعدل وراثيا من الجينات المتحولة لتلخيص الأمراض البشرية23،24. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح نظامنا البشري الكامل بتلخيص محتمل لعلم وظائف الأعضاء والأمراض الخاصة بالإنسان. أظهرت الدراسات السابقة الاختلافات بين القوارض ومورفولوجيا NMJ البشرية25 ، مما يشير إلى أنه يجب تنفيذ الحذر عند استخدام القوارض لمعالجة أمراض NMJ البشرية. على الرغم من أن هذا النظام هو إعداد بسيط نسبيا في المختبر ، والذي يفتقر إلى تعقيد نموذج في الجسم الحي ، كان من الممكن إثبات أن مورفولوجيا NMJ المعروضة في الأجهزة الدقيقة تشبه NMJs من بتر الإنسان25. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا النموذج لتقييم NMJ أثناء تشكيل NMJ والنضج، مما قد يكشف عن الأنماط الظاهرية للأمراض المبكرة، والتي هي غائبة، غير معروفة، أو تجاهلها في عينات ما بعد الوفاة البشرية.
MABs توفير خيار صالح لتوليد myotubes، على الرغم من بقاءها محدودة من 10 أيام هو عيب للنظام. يعتمد بقاء الميوتوب على تعلقهم بالسطح ، والذي من المرجح أن يتعرض للخطر بسبب الانقباضات التلقائية للألياف العضلية. بعد أكثر من 10 أيام ، سيكون معظم myotubes منفصلة ، مما يجعل ثقافة NMJ غير صالحة للاستخدام. من الناحية المثالية ، سيتم إنشاء myotubes من iPSCs أيضا. ومع ذلك، ثبت أن البروتوكولات الحالية يصعب إعادة إنتاج26 بسبب التباين في مؤشر الانصهار27,28,29,30.
باستخدام الأجهزة الدقيقة المتاحة تجاريا، قمنا بإنشاء نظام موحد، والذي يمكن الوصول إليه بالكامل. وتوجد نماذج أخرى من طرازات NMJ31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. ومع ذلك، فإنها تعتمد عادة على مقصورات واحدة، والتي تفتقر إلى التقسيم والعزلة السائلة بين أنواع الخلايا، أو على الأوعية الثقافية المصنوعة خصيصا، مما يقلل من توافر وربما أيضا استنساخ. يمكن شراء الأجهزة الدقيقة المستخدمة لهذا البروتوكول مع microgrooves من أطوال مختلفة ، مما يسمح لمزيد من التحليل مثل transport4344 أو axotomy184546 التحقيقات. العزلة السائلة بين المقصورات تمكن كذلك من العلاج الدوائي المجزأ إما للخلايا العصبية الحركية أو الميوتوب ، والتي يمكن أن تكون مواتية في تطوير العلاج. وقد ظهر المزيد من الشركات المتخصصة في microfluidics ، والتي فتحت لمزيد من مجموعة كبيرة من تصميم الأجهزة والميزات ، مما يزيد من تعزيز إمكانية الوصول للبحوث المختبرية.
في الختام، قمنا بتطوير بروتوكول توفير طريقة موثوقة، تنوعا وسهلة لثقافة وحدات السيارات البشرية مع NMJs وظيفية.

NMJs تسهيل الاتصال بين الخلايا العصبية الحركية السفلية الشوكية وألياف العضلات الهيكلية من خلال الإفراج عن الناقلات العصبية1. في اضطرابات الخلايا العصبية الحركية مثل ALS وSMA، وNMJs المنحطة، مما يسبب اضطرابا في الاتصال مع العضلات2،3،4،5،6،7. وهذا يؤدي إلى فقدان المرضى تدريجيا لوظائف العضلات، مما يؤدي إلى أن تكون مقيدة بكرسي متحرك وتعتمد في نهاية المطاف على دعم الحياة التنفسية بسبب ضمور التدريجي لمجموعات العضلات الحيوية مثل الحجاب الحاجز. الآليات الكامنة وراء الدقيق المسؤول عن هذا فقدان عميق من NMJs في هذه الاضطرابات غير معروفة. وقد أجريت العديد من الدراسات على نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا، والتي أعطتنا بعض الأفكار حول الإمراض من انحطاط NMJ5،6،8،9،10،11. ومع ذلك ، لفهم علم الأمراض بشكل كامل ومواجهة الحرمان ، من المهم أن يكون هناك نظام بشري ، والذي يسمح بإمكانية الوصول الكامل.
هنا، يصف البروتوكول طريقة بسيطة نسبيا لتوليد NMJs الإنسان من خلال التجريب المشترك للخلايا العصبية الحركية المشتقة من hiPSC والأنابيب العضلية الأساسية البشرية المشتقة من MAB باستخدام الأجهزة الدقيقة المتاحة تجاريا. وقد عرف استخدام microfluidics لاستقطاب وعزل السوائل سوماس وماكسونات الخلايا العصبية منذ الوصف الأول للغرف 'Campenot'12 في أواخر 1970s. ومنذ ذلك الحين، تم تصنيع المزيد من التصاميم الدقيقة، بما في ذلك الخيارات التجارية. تحتوي الأجهزة المستخدمة في هذا البروتوكول على مقصورتين، وتتكون كل مقصورة من بئرين متصلين بقناة 13. يتم عكس المقصورتين وتوصيلها مع العديد من microgrooves. هذه microgrooves لها حجم يسهل نمو neurite مع الحفاظ على عزلة السوائل بين المقصورتين من خلال الضغط الهيدروستاتيكي الشعرية13,14. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن لثقافة الخلايا العصبية الحركية في مقصورة واحدة وخلايا العضلات في الآخر، كل في المتوسط ثقافة محددة، في حين لا يزال تسهيل اتصال مادي من خلال neurites تمر عبر microgrooves والانخراط مع خلايا العضلات. يوفر هذا النموذج نظاما قابلا للوصول الكامل وقابلا للتكيف في المختبر لوحدة محرك بشري ، والتي يمكن استخدامها لدراسة أمراض NMJ المبكرة في أمراض مثل ALS و SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

تقاطعات العصبية والعضلية (NMJs) هي نقاط الاشتباك العصبي المتخصصة بين محور عصبي من الخلايا العصبية الحركية السفلية والعضلات تسهيل مشاركة تقلص العضلات. في اضطرابات الخلايا العصبية الحركية، مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وضمور العضلات الشوكي (SMA)، تنحط NMJs، مما يؤدي إلى ضمور العضلات والشلل التدريجي. الآلية الأساسية لانحطاط NMJ غير معروفة ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم وجود نماذج بحثية قابلة للترجمة. هدفت هذه الدراسة إلى إنشاء نموذج متعدد الاستخدامات وقابل للاستنساخ في المختبر لوحدة محرك بشري مع NMJs وظيفية. لذلك ، تم استزراع الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC) المشتقة من الخلايا العصبية الحركية وخلايا الميوجيوبلاست الأولية البشرية (MAB) المشتقة من الميوتوب في الأجهزة الدقيقة المتاحة تجاريا. يسمح استخدام المقصورات الصغيرة المعزولة بشكل سلس بالحفاظ على البيئات الدقيقة الخاصة بالخلايا مع السماح بالاتصال من خلية إلى خلية من خلال الميكروبات. من خلال تطبيق التدرج الكيميائي والحجمي ، تم تحفيز نمو الخلايا العصبية الحركية - neurites من خلال microgrooves تعزيز التفاعل myotube وتشكيل NMJs. تم تحديد هذه NMJs المناعي كيميائيا من خلال التوطين المشترك للخلايا العصبية الحركية علامة presynaptophysin (SYP) ومستقبلات أستيل postynaptic (AChR) علامة α-bungarotoxin (Btx) على الميوتوب وتتميز مورفولوجيا باستخدام المسح المجهري الإلكتروني (SEM). تم تأكيد وظيفة NMJs من خلال قياس استجابات الكالسيوم في الميوتوب عند إزالة الاستقطاب من الخلايا العصبية الحركية. يمكن للوحدة الحركية التي تم إنشاؤها باستخدام أجهزة microfluidic القياسية وتكنولوجيا الخلايا الجذعية أن تساعد الأبحاث المستقبلية التي تركز على NMJs في الصحة والمرض.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

نحن نصف طريقة لتوليد وحدات المحركات البشرية في الأجهزة الدقيقة المتاحة تجاريا عن طريق المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الحركية المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة من الخلايا الجذعية المستحثة بالخلايا الجذعية مع الميوتوبات المشتقة من الميوتيوم الأساسي البشري مما يؤدي إلى تشكيل تقاطعات عصبية عضلية نشطة وظيفيا.

جيل من وحدات السيارات البشرية مع تقاطعات العصبية والعضلية الوظيفية في الأجهزة Microfluidic

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

هذه الطريقة البسيطة نسبيا يمكن أن تساعد البحوث التي تركز على الخلايا العصبية الحركية والتقاطعات العصبية والعضلية في الصحة والمرض. يستخدم هذا البروتوكول تكنولوجيا الخلايا الجذعية القياسية والأجهزة الدقيقة المتاحة تجاريا مما يزيد من إمكانية إعادة الإنتاج. قطع الخلايا العصبية الحركية وخلايا العضلات هو ظاهرة مبكرة في العديد من الأمراض العصبية والعضلية.ويمكن لنموذج إنساني بسيط أن يساعد على وضع استراتيجيات لمواجهة هذه الظاهرة. نحن نستخدم هذا النموذج للتحقيق في اضطراب الخلايا العصبية الحركية, التصلب الجانبي الضموري, ومع ذلك, ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النموذج لاضطرابات أخرى في وحدة المحرك الذي ضروري. ابدأ بنقل الجهاز باستخدام ملقط من حاوية الشحن إلى طبق بيتري الذي يحتوي على 10 ملليلترات من 70٪ إلى 100٪ إيثانول للتعقيم لمدة 10 ثوان.نقل الجهاز مع ملقط إلى قطعة من الورق لتجف الهواء في تدفق لامينار لمدة 30 دقيقة تقريبا. بمجرد تجفيف الجهاز ، استخدم ملقط لنقل كل جهاز إلى طبق بيتري فردي طوله 10 سنتيمترات. لتغليف الجهاز مع Poly-L-ornithine أو PLO، أضف 100 ميكرولتر من محلول PLO إلى البئر العلوي ولاحظ مرور السائل من الأعلى جيدا عبر القناة إلى البئر السفلي.ثم، إضافة 100 ميكرولتر من حل منظمة التحرير الفلسطينية إلى البئر السفلي، وكرر على الجانب الآخر من الأخافير الصغيرة. الانتهاء من خلال إضافة 100 ميكرولتر من حل منظمة التحرير الفلسطينية على جانب واحد لخلق تدرج حجم بين الجانبين معكوسة من الجهاز لمعطف الأخافير الصغيرة. احتضان لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد ثلاث ساعات، اغسل الجهاز ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام DPBS. معطف الجهاز مع 20 ميكروغرام لكل صفح ملليلتر والمتوسطة العصبية عن طريق اتباع الإجراء مماثلة لطلاء منظمة التحرير الفلسطينية. احتضان الجهاز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي استخدام ماصة 200 ميكرولتر ووضع طرف في المقابل تماما لفتح القناة لإزالة طلاء صفح من الآبار. بعد إضافة DPBS إلى جميع الآبار ، اترك الأجهزة مع DPBS في تدفق Laminar في درجة حرارة الغرفة لزرع الخلايا. قطع الأوراق SCM إلى حجم الجهاز في حين ترك بضعة ملليمترات على كل جانب.بعد تعقيم الأجهزة وأوراق SCM في طبق بيتري يحتوي على 10 ملليلتر من 70٪ إلى 100٪ الإيثانول لمدة 10 ثوان، نقل الأجهزة مع ملقط إلى لوحة من ستة آبار وصحائف SCM إلى طبق بيتري 10 سم لتجفيف الهواء في تدفق اللامينار. ضع الجهاز على حافة الحافة للسماح لجميع الجوانب بالجفاف لمدة 30 دقيقة تقريبا. معطف الأجهزة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل منظمة التحرير الفلسطينية لكل بئر لكل جهاز في لوحة من ستة آبار.تأكد من أن الجهاز يطفو فوق حل منظمة التحرير الفلسطينية مع القناة والجانب الأخدود الصغير الذي يواجه السائل. قم بتغليف أوراق SCM بإضافة 10 ملليلتر من محلول PLO إلى طبق بيتري الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات ، واستخدم ملقط لدفع أوراق SCM إلى السائل. احتضان الأجهزة وأوراق SCM لمدة ثلاث ساعات كما هو موضح سابقا.بعد ثلاث ساعات، اغسل الأجهزة وأوراق SCM مرتين لمدة خمس دقائق مع DPBS تليها غسل آخر لمدة خمس دقائق بالماء العقيم. ثم نقل كل ورقة SCM إلى طبق بيتري 10 سم الفردية للهواء الجاف. أثناء العمل تحت المجهر في تدفق Laminar ، استخدم ملقط لتركيب جهاز السيليكون مع القناة والجانب الأخدود الصغير لأسفل بزاوية 90 درجة على ورقة SCM لضمان محاذاة جميع الجوانب.اضغط بخفة على الجهاز للتأكد من ختم ليس فقط الحواف الخارجية، ولكن أيضا حول الآبار والقنوات والأخاد الصغيرة. لمعطف الجهاز مع صفح، داخل تدفق لامينار وتحت المجهر، إضافة 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل محلول ملليلتر من اللامينين في البئر العلوي باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. مراقبة السائل يمر من أعلى جيدا من خلال القناة إلى أسفل البئر دون أي تسرب حول البئر والقناة.في وقت لاحق، إضافة 100 ميكرولتر من محلول صفح إلى أسفل جيدا، كرر على الجانب الآخر من الأخافير الصغيرة والانتهاء مع 100 ميكرولتر إضافية من صفح على جانب واحد لخلق تدرج حجم بين الجانبين معكوسة من الجهاز لمعطف الأخافير الصغيرة، ثم احتضان الجهاز بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بإزالة الطلاء من الآبار مع ماصة 200 ميكرولتر عن طريق وضع الطرف في الجزء المقابل لفتح القناة، بعد إضافة DPBS إلى جميع الآبار، اترك الأجهزة مع DPBS في تدفق لامينار في درجة حرارة الغرفة لزرع الخلايا. للوحة خلايا السلف العصبية أو الشخصيات في الجهاز microfluidic، وإزالة DPBS من بئرين على جانب واحد من الأخافير الصغيرة في الجهاز باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.لزرع ما مجموعه 250، 000 NPCs و 60 إلى 100 ميكرولتر من اليوم 10 الخلايا العصبية الحركية المتوسطة لكل جهاز، في أعلى البئر الأيمن، نصف البذور من تعليق الخلية على مقربة من فتح القناة بزاوية 45 درجة. توقف لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية بالتدفق عبر القناة قبل إضافة النصف المتبقي من تعليق الخلية في البئر السفلي. استخدم قلما لوضع علامة على الجانب المصنف على أنه NPC أو ما يعادله ، لتسهيل توجيه الجهاز بدون مجهر ، واحتضانه لمدة خمس دقائق لمرفق الخلية.المقبل، أعلى ببطء حتى اثنين من الآبار NPC المصنف مع يوم إضافي 10 الخلايا العصبية الحركية المتوسطة إلى حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر لكل بئر. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، قم بإزالة DPBS من البئرين على الجانب الآخر من الأخافير الصغيرة المقابلة ل NPCs المصنفة حديثا.ثم أضف ستة ملليلترات من DPBS لكل طبق طوله 10 سنتيمترات حول الجهاز لمنع تبخر الوسط أثناء الحضانة. لتغيير الوسط، قم بإزالة الوسائط ببطء في كلا البئرين باستخدام NPCs عن طريق وضع طرف ماصة 200 ميكرولتر في الحافة السفلية لجدار البئر المقابل لفتح القناة. لمنع تدفق متوسط قوي من إتلاف الخلايا على القناة، إضافة ببطء 50 إلى 100 ميكرولتر من الخلايا العصبية الحركية الطازجة المتوسطة إلى كل بئر عن طريق تغيير مستمر بين أعلى وأسفل جيدا.كرر العملية حتى يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من المتوسط. في اليوم 17 من التمايز العصبي الحركي، وإزالة متوسط الخلايا العصبية الحركية على الجانب غير المصنف من الأخافير الصغيرة في الجهاز مع ماصة 200 ميكرولتر وغسل الآبار مع DPBS. البذور ما مجموعه 200،000 mesoangioblasts الأولية البشرية أو MABs، في 60 إلى 100 ميكرولتر من متوسط النمو لكل جهاز عن طريق بذر نصف تعليق الخلية في البئر العلوي.وقفة لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية لتدفق من خلال القناة قبل بذر النصف المتبقي من تعليق الخلية في البئر السفلي، كما هو موضح في وقت سابق للطلاء NPCs. احتضان الجهاز لمدة خمس دقائق لمرفق الخلية. ثم أعلى اثنين من الآبار الطازجة MAB المصنف مع متوسط نمو إضافية واحتضان مرة أخرى كما هو موضح.لبدء تكتيك العلاج الكيميائي والتدرج الحجمي في اليوم الحادي والعشرين من تمايز الخلايا العصبية الحركية ، أضف 200 ميكرولتر لكل بئر من الوسط العصبي العصبي الحركي الذي يحتوي على عوامل النمو إلى مقصورة Myotube ، ثم أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من المتوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية دون عوامل نمو إلى مقصورة الخلايا العصبية الحركية. من المهم تقييم إمكانات التفريق لخطوط الخلية قبل المشاركة في زراعة هذه الخطوط في أجهزة ميكروفلويديك. تم تحديد مؤشر الاندماج ل MABs ، وقدر أن حوالي 8٪ كافية للثقافة المشتركة.وكانت الثقافات الخلايا العصبية الحركية ولدت 85 إلى 95٪ إيجابية لعلامات الخلايا العصبية الحركية. لوصف وتحديد كمية التقاطعات العصبية والعضلية أو NMJs ، تم حساب عدد التوطينات المشتركة بين الخلايا العصبية الحركية وعلامات ما قبل المتشابكة العصبية السلسلة الثقيلة والسيبتوفيسين وعلامة مستقبلات الأسيتلين ما بعد المتشابك ألفا bungarotoxin ، من خلال كل كومة مرض وتم تطبيعها في عدد من سلسلة الميوزين الثقيلة المسماة Myotubes الموجودة في Z-stack. ظهرت NMJs كنقطة اتصال واحدة NMJs حيث تطرق neurite على مجموعة من مستقبلات الكولين خفية في نقطة تفاعل واحدة.أو كنقطة اتصال متعددة NMJs حيث انتشر neurite واشتبك مع مجموعة مستقبلات الكولين خفية على سطح أكبر. القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا العصبية الحركية ابتكر Myotubes أشار إلى أن ليس كل Myotubes الواردة NMJs. عند تنشيط الخلايا العصبية الحركية مع كلوريد البوتاسيوم ، لوحظ تدفق الكالسيوم في Fluo-4 المسمى Myotubes ، والذي أكد وجود اتصال وظيفي من خلال نيوريت الخلايا العصبية الحركية في Myotube ، بالإضافة إلى مانع NMJ d-tubocurarine ، أو DTC إلى مقصورة Myotube أدى إلى تثبيط تدفق الكالسيوم.أن يكون أكبر نجاح مع هذا النموذج من المهم بشكل لا يصدق لأداء فحص جودة خط الخلية وتجنب تشكيل فقاعات الهواء في قنوات الجهاز. الجمع بين تقاطع العصبية والعضلية في طبق مع أنواع الخلايا المباشرة IPC أخرى تحاكي حتى أفضل الوضع في المختبر، وهذا يسمح أيضا لدراسة دور هذه الأنواع من الخلايا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

النقل المحوري للأرغنفيات في ثقافات الخلايا العصبية الحركية باستخدام نظام غرف السوائل الدقيقة

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

ثلاثي الأبعاد موتور العصب الجهازية جيل

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

العزل الوظيفي للوحدات الحركية واحدة من الجرذ ميديال Gastrocnemius العضلات

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

تشريح ألياف العضلات الهيكل العظمي واحد للتحليلات Immunofluorescent ومورفومتري من تقاطعات العضلات العصبية جبل كامل

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...