Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

作者感谢来自LiMoNe的Nikky Corthout和Sebastian Munck，研究小组分子神经生物学（VIB-KU Leuven）对活细胞钙瞬时荧光记录的建议。这项研究得到了比利时和卢森堡富布赖特委员会，KU Leuven（C1和"开放未来"基金），VIB，科学技术创新机构（IWT;SBO-iPSCAF）、"法兰德斯科学研究基金"（FWO-Vlaanderen）、目标ALS、ALS Liga België（ALS的治愈方法）、比利时政府（由比利时联邦科学政策办公室发起的大学间吸引力极点计划P7/16）、Thierry Latran基金会和"比利时抵抗疾病神经肌肉组织协会"（ABMM）。T.V.和J.B由FWO-Vlaanderen颁发的博士奖学金支持。

L.V.D.B.拥有HDAC抑制剂在Charcot-Marie-Tooth疾病中使用专利（US-2013227717-A1），是Augustine Therapeutics的科学联合创始人，也是其科学顾问委员会成员。其他作者声明没有竞争利益。

该协议描述了一种相对易于使用的方法，该方法在不到30天的时间内在市售的微流体装置中生成具有功能NMJ的人体运动单元。它描述了如何通过ICC和SEM等标准技术在形态学上评估NMJ，并通过活细胞钙记录进行功能评估。
该协议的一大优点是使用干细胞技术。这允许完全的适应性，其中NMJ可以在健康和疾病中进行评估，而与供体概况无关。该模型已被证明在ALS研究中已经成功且有益，其中我们发现由于 FUS 基因突变而导致的神经突出生长，再生和NMJ数量的损伤是新的表型18。通过该模型，通过使用来自散发性ALS患者的iPSCs，可以将研究扩展到包括散发形式的ALS，其中病因尚不清楚。与传统动物模型相比，这提供了优势，传统动物模型依靠突变基因的转基因过表达来概括人类疾病23，24。此外，我们完全由人类组成的系统可以潜在地概括人类特定的生理学和疾病。先前的研究表明啮齿动物和人类NMJ形态之间的差异25，这表明在使用啮齿动物解决人类NMJ病理学时必须谨慎行事。虽然该系统是一个相对简单的 体外 设置，缺乏 体内 模型的复杂性，但有可能证明微流体装置中显示的NMJ形态类似于人类截肢者的NMJs25。此外，该模型允许在NMJ形成和成熟期间进行NMJ评估，可能揭示早期疾病表型，这些表型在人类死后样本中不存在，无法识别或被忽视。
MABs提供了产生肌管的有效选择，尽管它们有限的10天存活是该系统的缺点。肌管存活依赖于它们对表面的附着，这可能受到肌纤维自发收缩的影响。超过10天后，大多数肌管将分离，使NMJ培养物无法使用。理想情况下，肌管也将从iPSCs产生。然而，由于融合指数27，28，29，30的可变性，目前的方案已被证明难以重现26。
通过使用市售的微流体装置，我们生成了一个完全可访问的标准化系统。其他NMJ模型存在31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42。然而，它们通常依赖于单个隔室，缺乏细胞类型之间的区室化和流体分离，或者依赖于定制的培养容器，这降低了可用性，并可能降低可重复性。用于该协议的微流体装置可以购买各种长度的微槽，这允许进一步分析，例如轴突转运43，44 或轴突切开术18，45，46 研究。隔室之间的流体隔离进一步实现了运动神经元或肌管的区室化药物治疗，这可能有利于治疗的发展。更多专门从事微流体的公司已经出现，这为大量的设备设计和功能提供了选择，进一步促进了 体外 研究的可及性。
总之，我们开发了一种方案，提供了一种可靠，多功能和简单的方法来培养具有功能性NMJ的人体运动单元。

NMJ通过释放神经递质促进下脊柱运动神经元和骨骼肌纤维之间的通信1。在ALS和SMA等运动神经元疾病中，NMJs退化，导致与肌肉的通信中断2，3，4，5，6，7。这导致患者逐渐失去肌肉功能，这导致他们被轮椅束缚，并最终依赖于呼吸系统生命支持，因为重要肌肉群如隔膜等逐渐萎缩。导致这些疾病中NMJs严重丧失的确切潜在机制尚不清楚。已经对转基因动物模型进行了许多研究，这使我们对NMJ变性的发病机制有了一定的了解5，6，8，9，10，11。然而，为了充分了解病理学并抵消去神经支配，重要的是要有一个允许完全可及性的人类系统。
在这里，该协议描述了一种相对简单的方法，通过使用市售的微流体装置共培养hiPSC衍生的运动神经元和人类原代MAB衍生的肌管来产生人类NMJ。自20世纪70年代末首次描述"Campenot"室12 以来，使用微流体来极化和流体分离神经元的体细胞和轴突就已经为人所知。从那时起，已经制造了更多的微流体设计，包括商业选择。该协议中使用的设备包含两个隔间，每个隔间由两个与通道13连接的孔组成。两个隔间是镜像的，并用几个微槽连接。这些微凹槽的尺寸有助于神经突生长，同时通过毛细管静水压力保持两个隔室之间的流体隔离13，14。使用该系统，可以在一个隔室中培养运动神经元，在另一个隔室中培养肌肉细胞，每个隔室在其特定的培养基中培养，同时仍然通过穿过微凹槽的神经突起并促进物理连接并与肌肉细胞结合。该模型为人类运动单元提供了一个完全可访问和适应性强的 体外 系统，可用于研究ALS和SMA等疾病的早期NMJ病理学。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

神经肌肉接头（NMJ）是下运动神经元的轴突和肌肉之间的特殊突触，促进肌肉收缩的参与。在运动神经元疾病中，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA），NMJs退化，导致肌肉萎缩和进行性麻痹。NMJ退化的潜在机制尚不清楚，主要是由于缺乏可翻译的研究模型。这项研究旨在创建具有功能性NMJ的人类运动单元的多功能且可重复的 体外 模型。因此，在市售的微流体装置中共培养了人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的运动神经元和人原发性介观母细胞（MAB）衍生的肌管。使用流体隔离的微隔室可以维持细胞特异性微环境，同时允许通过微凹槽进行细胞间接触。通过应用趋化和体积梯度，刺激运动神经元 - 神经突起通过促进肌管相互作用的微凹槽的生长和NMJ的形成。这些NMJ通过运动神经元突触前标志物突触素（SYP）和突触后乙酰胆碱受体（AChR）标志物α-bungarotox（Btx）在肌管上的共定位进行免疫细胞化学鉴定，并使用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学表征。NMJ的功能通过测量运动神经元去极化时肌管中的钙反应来证实。使用标准微流体装置和干细胞技术生成的运动单元可以帮助未来专注于健康和疾病中NMJ的研究。

微流体器件中 NMJ 的生成 为了在市售的微流体装置中产生具有功能NMJ的人类运动单元，使用了人iPSC衍生的运动神经元和人MAB衍生的肌管。起始细胞材料的质量很重要，特别是MABs与肌管的融合能力对于该协议的成功结果至关重要。MABs很容易保留在培养物中。然而，在将每批次应用于微流体装置之前，评估每批的融合能力非常重要（补充图1A，B）18。任何在分化10天后不显示肌管形成的批次都不应使用。补充图1B中的融合指数是通过计算每个肌管标记物中每个肌管标记物中每张图像的细胞核总数的阳性百分比来确定的。我们发现，大约8%的融合指数足以使我们的共培养产生NMJ。
从纯iPSC培养物开始运动神经元分化始终很重要。输入越纯 - 结果越纯。运动神经元分化方案产生运动神经元培养物，运动神经元标志物通常为85%-95%阳性（补充图1C，D）18。剩余的细胞通常是未分化的前体细胞，在某些情况下将经历广泛的增殖，从而对培养物的质量产生负面影响。为了获得该协议的最佳结果，在将第10天的运动神经元 - NPC应用于设备之前，应评估运动神经元分化效率。此外，可以在第11天进行NPC质量检查，以评估NPC标记Olig2的表达（补充图1E，F）。
最初，运动神经元NPC和MABs在第10天的同一时间点接种。在这里，MAB分化在第11天开始。在第14天实施的体积和生长因子梯度使我们能够在第21天评估NMJ的形成，从而将方案缩短一周。有趣的是，我们可以通过ICC观察特征性NMJ的形成（补充图2A）。然而，我们无法在运动神经元分化的早期通过活细胞钙记录获得功能输出（数据未显示）。我们得出结论，运动神经元还不够成熟，无法与肌管形成功能性NMJ连接，尽管NMJ形态看起来很有希望。这与我们之前的观察一致，即通过膜片钳电生理分析记录的运动神经元中的自发动作电位仅发生在运动神经元分化的第35天15。
此外，我们试图通过在接种MABs之前将设备中的运动神经元成熟2周（第24天）来延长运动神经元成熟以及共培养可持续性。不幸的是，观察到大量自发的运动神经元 - 神经突过微凹槽，这导致MAB附着的抑制（补充图2B）。由于通道中缺乏肌管形成，我们在第36天鉴定NMJs失败，因此应用了28天方案（图1）。
体外 NMJ 的鉴定、定量和形态学表征 遵循28天协议（图1）后，可以获得功能齐全的NMJ。无论是在体内还是在体外，NMJs都通过突触前标志物和突触后标志物的共定位来表征免疫组织或免疫细胞化学。在这项研究中，使用神经丝重链（NEFH）和SYP的组合作为突触前标志物的组合，这允许从运动神经元的体细胞到最远端过程的单个神经突起的跟随。在肌肉方面，Btx被广泛用作AChR的突触后标志物，同样在这项研究中使用。补充agrin和层粘连蛋白可促进AChRs在sarcolemma19，20，21的聚集，使其更容易在体外识别AChRs，并同样增加存在的AChRs和NMJ的数量18。
为了以无偏的方式定位和计算NMJ，每个肌管通过肌球蛋白重链（MyHC）阳性进行鉴定，并使用倒置共聚焦显微镜以40倍放大倍率在z-stack中成像。对于很长的肌管，获得了多个z-stack。对于图像分析，NEFH / SYP和Btx之间的共定位次数通过每个z-stack手动计数，并且共定位的数量被归一化为z-stack中存在的肌管数量（图2A-C）18。并非所有的肌管都会有NMJ，如神经支配的肌管的定量所示（图2D）。因此，重要的是执行无偏记录方法，其中所有肌管都成像，独立于Btx的存在。
可以在该 体外 系统中鉴定两种类型的形态学。NMJ要么表现为单个接触点NMJs，其中神经突触在一个相互作用点处的AChR簇上，要么表现为多个接触点NMJ，其中神经突起将在较大的表面上扇出并与AChR团簇啮合。这两种形态学可以通过免疫细胞化学（图2A）18 和SEM（图2B）18进行鉴定，并且同样可以定量（图2C）18。总体而言，多个接触点通过大肌肉嵌入促进更广泛的连接，这指向更成熟的NMJ形成。相反，由于培养物的早期发育状态，单接触点NMJ被认为不太成熟。
体外NMJ的功能评估 为了评估NMJ的功能，使用活细胞钙瞬时记录（图3）18。利用微流体装置的流体隔离系统，运动神经元体细胞侧被高浓度（50mM）氯化钾刺激，同时记录肌管中钙的流入，肌管中加载了钙敏感的Flu-4染料（图3A）。几乎在运动神经元激活后，我们可以通过特征性波形成观察到肌管中的钙流入，这证实了通过运动神经元 - 神经突和肌管的功能连接（图3A-C）18。没有观察到自发的钙波或自发的肌管收缩，尽管在用氯化钾直接刺激时观察到肌管收缩。通过将竞争性AChR拮抗剂盐酸图博库拉林五水合物（DTC）添加到肌管室（图3A）中，进一步证实了连接的特异性，这导致钙流入的抑制（图3C）。这种效应证实了运动神经元和肌管之间的连接导致了功能齐全的NMJ。为了通过NMJ刺激评估活性肌管的数量，直接用氯化钾刺激肌管室以确定该室中活性肌管的总数。大约70%的肌管通过氯化钾的运动神经元刺激的激活而活跃（图3D）18。
这些结果通过在28天方案期间共培养iPSC衍生的运动神经元和MAB衍生的肌管，证实了最佳的NMJ形成，数量，形态和功能。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62959/62959fig02.jpg"> 图2：微流体装置中的NMJ形成。 （A）第28天预组装微流体装置中NMJ形成的共聚焦显微照片。NMJ通过MyHC染色的肌管上突触前标记物（NEFH和SYP）和突触后AChR标记（Btx）的共定位（箭头）来鉴定。NMJ通过神经突和AChR团簇之间的单个或多个接触点形成在形态学上被鉴定。DAPI 标记核。比例尺，25 μm。插图显示 NMJ 的放大倍率。第28天，10μm.（B）有机硅微流体装置中NMJ形态的SEM的插入比例尺。箭头描绘了神经突嵌入肌管。比例尺，2 μm。插图显示 NMJ 的放大倍率。插入比例尺，1μm.（C）定量每个肌管的NMJ总数以及每个肌管的单点和多接触点NMJ的数量。图形显示为来自四个生物重复的平均值±标准误差。统计显著性由曼惠特尼检验确定，* p < 0.05。（D）神经支配肌管百分比的定量。图形显示为来自四个生物重复的平均值±标准误差。这个数字是从Stoklund Dittlau， K. et al.18修改而来的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/62959fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62959/62959fig03.jpg"> 图 3：确认 NMJ 功能。 （A）在用管尿素（DTC）阻断NMJ阻断之前和之后的第28天预组装的微流体装置中NMJ功能的活细胞瞬时钙记录的示意图22。浅绿色隔室中的运动神经元受到50mM氯化钾（KCl）的刺激，其通过神经突起引起细胞内运动神经元反应。这唤起了肌管中钙（Ca2 +）的流入，肌管中标有钙敏感的Flu-4染料（深绿色隔室）。（B）Myotube的刺激前，强度峰值和刺激后的Flu-4荧光显微照片，描绘了用KCl刺激运动神经元时细胞内钙增加的波浪。比例尺，100 μm。插入比例尺，200μm.（C）运动神经元刺激后肌管中的代表性钙流入曲线，KCl（箭头）确认NMJ功能。Myotube 1-3通过运动神经元 - 肌管神经支配显示特征性钙曲线，而肌管A-C DTC描绘了NMJ阻断与DTC后的曲线。（D）运动神经元刺激的活性肌管与活性肌管总数的比值。这个数字是从Stoklund Dittlau， K. et al.18修改而来的。细胞插图已从智能服务器医疗艺术22修改而来。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/62959fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图1：运动神经元验证，MAB融合指数和鼻咽癌质量控制。 （A）分化开始后10天MAB衍生的肌管的共聚焦图像。肌管用肌管标记标记：desmin，MyHC，肌原蛋白（MyoG）和titin。细胞核用DAPI染色。比例尺，100μm.（B）分化开始后10天定量MAB融合指数。饥饿后，MABs融合成多核肌管，其被量化为肌管标志物阳性（AB +）。图描述了来自三个生物重复的平均值±标准误差。（C）分化第28天iPSC衍生的运动神经元的共聚焦图像，除了泛神经元标志物βIII-微管蛋白（管蛋白）外，还标有运动神经元标志物NEFH，胆碱乙酰转移酶（ChAT）和胰岛-1。细胞核用DAPI染色。比例尺，75μm.（D）细胞数量的定量，这些细胞对运动神经元和泛神经元标记物（AB +）呈阳性。图描述了来自三个生物重复的平均值±标准误差。（E）运动神经元分化第11天iPSC衍生的NPC的共聚焦图像，用NPC标记Olig2和泛神经元标记βIII-微管蛋白（微管蛋白）。标记。细胞核用DAPI染色。比例尺，50μm.（F）NPC数量的定量，对Olig2和βIII-微管蛋白（AB +）呈阳性。图描述了来自三个生物重复的平均值±标准误差。这个数字是从Stoklund Dittlau， K. et al.18修改而来的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/Supplemental%20Figure%201.tif" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图2：共培养方案的优化 （A）运动神经元分化第21天NMJ形成的共聚焦图像，当MABs在第10天与NPC在同一时间点播种时。NMJ通过MyHC染色的肌管上突触前标记物（NEFH和SYP）和突触后AChR标记（Btx）的共定位（箭头）来鉴定。比例尺（左），10 μm。比例尺（右），5μm.（B）第24天肌管通道的明场图像，描绘了抑制MABs附着的自发运动神经元 - 神经突交。比例尺，100 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/Supplemental%20Figure%202.tif" target="_blank">。请单击此处下载此文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>库存集中度</td>
			<td>最终浓度</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>1 倍</td>
			<td>80%</td>
		</tr>
<tr>
<td>胎牛血清</td>
			<td></td>
			<td>15%</td>
		</tr>
<tr>
<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>5000 U/mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>50 倍</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>丙酮酸钠</td>
			<td>100 平方米</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>非必需氨基酸</td>
			<td>100 倍</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>胰岛素转铁蛋白硒</td>
			<td>100 倍</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF （添加新鲜）</td>
			<td>50微克/毫升</td>
			<td>5 纳克/毫升</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：人与生物圈生物生长培养基。 培养基可以在4°C下持续2周，bFGF在使用当天新鲜添加。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>库存集中度</td>
			<td>最终浓度</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>神经基底培养基</td>
			<td></td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>5000 U/mL</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>50 倍</td>
			<td>0.5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2 补充剂</td>
			<td>100 倍</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>不含维生素A的B-27</td>
			<td>50 倍</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>β-巯基乙醇</td>
			<td>50 毫米</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗坏血酸</td>
			<td>200 微米</td>
			<td>0.5 微米</td>
		</tr>
</tbody></table>表2：运动神经元基础培养基。 培养基可以在4°C下持续4周。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>日</td>
			<td>试剂</td>
			<td>库存集中度</td>
			<td>最终浓度</td>
			<td>车厢</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">第10/11天</td>
			<td>平滑激动剂</td>
			<td>10 毫米</td>
			<td>500 毫安</td>
			<td rowspan="5">双</td>
		</tr>
<tr>
<td>视黄酸</td>
			<td>1 毫米</td>
			<td>0.1 微米</td>
		</tr>
<tr>
<td>达普特</td>
			<td>100 平方米</td>
			<td>10 微米</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">第14天</td>
			<td>达普特</td>
			<td>100 平方米</td>
			<td>20 微米</td>
			<td rowspan="3">双</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">第16天</td>
			<td>达普特</td>
			<td>100 平方米</td>
			<td>20 微米</td>
			<td rowspan="4">双</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>国家工作队</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">第18天</td>
			<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
			<td rowspan="3">运动神经元</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>国家工作队</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>10 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">天 21+</td>
			<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>30 纳克/毫升</td>
			<td rowspan="5">肌管</td>
		</tr>
<tr>
<td>断续器</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>30 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>国家工作队</td>
			<td>0.1毫克/毫升</td>
			<td>30 纳克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>阿格林</td>
			<td>50微克/毫升</td>
			<td>0，01 微克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>层粘连蛋白</td>
			<td>1毫克/毫升</td>
			<td>20微克/毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>天 21+</td>
			<td>无补充剂</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>运动神经元</td>
		</tr>
</tbody></table>表3：运动神经元培养基补充剂。 补充剂在使用当天新鲜添加到运动神经元基础培养基中。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>日</td>
			<td>试剂</td>
			<td>库存集中度</td>
			<td>最终浓度</td>
			<td>车厢</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">第18天</td>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
			<td>97%</td>
			<td rowspan="4">人与生物圈计划</td>
		</tr>
<tr>
<td>丙酮酸钠</td>
			<td>100 平方米</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>马血清</td>
			<td></td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>阿格林</td>
			<td>50微克/毫升</td>
			<td>0.01 微克/毫升</td>
		</tr>
</tbody></table>表4：人脑生物分类培养基。 培养基可以在4°C下持续2周。 Agrin在使用当天新鲜添加。

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

我们描述了一种在市售微流体装置中产生人类运动单元的方法，方法是将人诱导多能干细胞衍生的运动神经元与人类原代介观细胞衍生的肌管共同培养，从而形成功能活性的神经肌肉接头。

在微流体装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

这种相对简单的方法可以帮助研究关注健康和疾病中的运动神经元和神经肌肉接头。该协议使用标准干细胞技术和市售的微流体装置，可提高可重复性。运动神经元和肌肉细胞的断开是几种神经肌肉疾病的早期现象。一个简单的人性化模型可以帮助制定应对这种现象的策略。我们使用这个模型来研究运动神经元疾病，肌萎缩性侧索硬化症，然而，这个模型也可以用于运动单位至关重要的其他疾病。首先使用镊子将设备从运输容器转移到含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中，以进行灭菌10秒。将带有镊子的设备转移到一张纸上，在层流中风干约30分钟。干燥设备后，使用镊子将每个设备移动到单独的10厘米培养皿中。要用聚L-鸟氨酸或PLO涂覆设备，向顶部孔中加入100微升PLO溶液，并观察流体从顶部孔通过通道到底部孔。然后，向底部孔中加入100微升PLO溶液，并在微槽的另一侧重复。最后，在一侧添加100微升PLO溶液，在器件的两个镜面之间形成体积梯度，以涂覆微槽。在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育三小时。三小时后，用DPBS清洗设备三次，持续五分钟。按照类似于PLO涂层的程序，用每毫升20微克的层粘连蛋白和神经基质涂覆设备。将设备在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。第二天使用200微升移液器，将尖端放置在与通道开口相反的孔中，以从孔中除去层粘连蛋白涂层。将DPBS添加到所有孔中后，将带有DPBS的器件留在室温的层流中以进行细胞接种。将单片机切割成设备的大小，同时在每侧留出几毫米。在含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中对设备和SCM片进行灭菌10秒后，将带有镊子的设备转移到六孔板中，将SCM片转移到10厘米培养皿中，以便在层流中进行空气干燥。将设备放在边缘，让所有侧面干燥约30分钟。通过向六孔板中的每个设备添加每孔一毫升PLO溶液来涂覆设备。确保设备漂浮在PLO溶液的顶部，通道和微槽侧朝下进入液体。通过将10毫升PLO溶液添加到10厘米培养皿中来涂覆SCM片材，并使用镊子将单片机片推入液体中。如前所述，将设备和 SCM 片材孵育三个小时。三小时后，用DPBS清洗设备和SCM片材两次，持续五分钟，然后用无菌水再次洗涤五分钟。然后将每张单片机转移到单独的10厘米培养皿中风干。在层流中在显微镜下工作时，使用镊子将硅胶装置与通道和微槽以90度角朝下安装到SCM片上，确保所有侧面对齐。轻轻按压到设备上，确保不仅密封外边缘，还密封孔、通道和微槽周围。要用层粘连蛋白涂覆设备，在层流内部和显微镜下，使用200微升移液管在顶部孔中加入100微升每毫升20微克的层粘连蛋白溶液。观察从顶部井通过通道到底部井的流体在井和通道周围没有任何泄漏。随后，向底部孔中加入100微升的层粘连蛋白溶液，在微槽的另一侧重复，并在一侧用额外的100微升层粘连蛋白完成，以在器件的两个镜面之间形成体积梯度以涂覆微槽，然后将器件孵育过夜。第二天，使用200微升移液器将尖端定位在通道开口对面的孔中，从孔中取出涂层，将DPBS添加到所有孔中后，将带有DPBS的设备留在室温的层流中进行细胞接种。要将神经祖细胞或NPC接种在微流体装置中，请使用200微升移液管从装置中微槽一侧的两个孔中取出DPBS。为了接种总共250， 000个NPC和60至100微升的天10运动神经元培养基，在右上方的孔中，以45度的角度播种靠近通道开口的细胞悬浮液的一半。暂停几秒钟，让细胞悬浮液流过通道，然后将剩余的一半细胞悬浮液加入下孔中。使用笔将晶种侧标记为NPC或等效物，以便在没有显微镜的情况下轻松定位设备，并孵育五分钟以进行细胞附着。接下来，用额外的第10天运动神经元培养基缓慢地将两个NPC播种孔充注到每孔200微升的总体积。使用200微升移液器，从与新播种的NPC相对的微槽另一侧的两个孔中取出DPBS。向未播种的孔中加入每孔200微升第10天运动神经元培养基。然后在设备周围每10厘米培养皿中加入6毫升DPBS，以防止培养基在孵育过程中蒸发。要更换培养基，通过将200微升移液器尖端放置在与通道开口相对的孔壁底部边缘，用NPC缓慢去除两个孔中的培养基。为了防止强培养基流损坏通道上的细胞，通过在顶部和底部孔之间不断变化，向每个孔缓慢添加50至100微升的新鲜运动神经元培养基。重复该过程，直到每个孔含有200微升培养基。在运动神经元分化的第17天，用200微升移液管除去设备中微沟中未播种侧的运动神经元培养基，并用DPBS洗涤孔。通过在顶部孔中接种一半的细胞悬浮液，在每个装置的60至100微升生长培养基中播种总共200， 000个人类原发性介观胚层母细胞或MABs。暂停几秒钟，让细胞悬浮液流过通道，然后将剩余的一半细胞悬浮液接种在底部孔中，如前所述，用于电镀NPC。将设备孵育五分钟以进行细胞附着。然后用额外的生长培养基填充两个新鲜播种的MAB孔，并再次孵育， 如图所示。为了在运动神经元分化的第21天启动化疗策略和体积梯度，向Myotube室中每孔添加200微升含有生长因子的运动神经元神经基质培养基，然后向运动神经元室中每孔添加100微升无生长因子的运动神经元基础培养基。在微流体装置中共培养细胞系之前，评估细胞系的分化潜力非常重要。测定了MABs的融合指数，估计约8%足以进行共培养。产生的运动神经元培养物对运动神经元标志物的阳性率为85%至95%。为了表征和量化神经肌肉接头或NMJ的数量，运动神经元和突触前标志物之间的共定位数量神经丝重链和突触后乙炔受体标记α bungartoxin通过每个疾病堆栈计数，并在Z-stack中存在的多个肌球蛋白重链标记Myotubes上归一化。NMJs表现为单一接触点NMJ，其中神经突触碰到一个相互作用点处的微妙胆碱受体簇。或者作为多接触点NMJ，其中神经突起并在较大的表面上与微妙的胆碱受体簇啮合。对运动神经元创新肌管百分比的量化表明，并非所有肌管都含有NMJ。在用氯化钾激活运动神经元时，在Fluo-4标记的Myotubes中观察到钙流入，这证实了与Myotube中的运动神经元神经突的功能连接，将NMJ阻断剂d-tubocurarine或DTC添加到Myotube室导致钙流入的抑制。为了使该模型取得最大成功，执行细胞系质量检查并避免在设备通道中形成气泡非常重要。将培养皿中的神经肌肉接头与其他IPC直接细胞类型相结合，可以更好地模拟体外情况，这也允许研究这些细胞类型的作用。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神经肌肉接头处：测量突触大小，碎片和改变突触蛋白密度利用共聚焦荧光显微镜

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

科研

神经科学

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

微流控采用共培养开发设备牙胚支配分析

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

为什么量化事项：表型的表征在<em&gt;果蝇</em&gt;幼虫神经肌肉接头

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

腓神经损伤方法：可靠检测，以确定和测试因素修复神经肌肉接头

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

坐骨神经粉碎损伤大鼠模型中功能评估的3D运动学分析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

使用微流体腔系统在运动神经元培养物中有机细胞的斧头迁移

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

三维运动神经器官生成

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Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

大鼠中胃肌肉单运动单元的功能隔离

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

单骨骼肌肉纤维解剖，用于全山神经肌肉结的免疫荧光和形态分析

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...