Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Forfatterne takker Nikky Corthout og Sebastian Munck fra LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) for deres råd om levende celle calcium forbigående fluorescens optagelser. Denne forskning blev støttet af Fulbright-kommissionen til Belgien og Luxembourg, KU Leuven (C1 og "Opening the Future"-fonden), VIB, Agenturet for Innovation af Videnskab og Teknologi (IWT; SBO-iPSCAF), "Fonden for Videnskabelig Forskning Flandern" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiske regering (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 iværksat af den belgiske Federal Science Policy Office), Thierry Latran Foundation og "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. og J.B. støttes af ph.d.-stipendier tildelt af FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. har patent på brugen af HDAC-hæmmere i Charcot-Marie-Tooth sygdom (USA-2013227717-A1), er en videnskabelig medstifter af Augustine Therapeutics og medlem af dets videnskabelige advisory board. De andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Protokollen beskriver en relativt brugervenlig metode, som genererer menneskelige motorenheder med funktionelle NMJs i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder på mindre end 30 dage. Det beskrives, hvordan NMJs kan vurderes morfologisk gennem standard teknikker såsom ICC og SEM og funktionelt gennem live-celle calcium optagelser.
En stor fordel ved denne protokol er brugen af stamcelleteknologi. Dette giver mulighed for fuld tilpasningsevne, hvor NMJs kan evalueres i både sundhed og sygdom, uafhængigt af donorprofilen. Modellen har vist sig allerede vellykket og gavnlig i ALS forskning, hvor vi identificerede værdiforringelser i neurit udvækst, genvækst, og NMJ numre som nye fænotyper på grund af mutationer i FUS genet18. Med denne model er det muligt at udvide forskningen til at omfatte sporadiske former for ALS, hvor ætiologien er ukendt, ved hjælp af iPSCs fra sporadiske ALS-patienter. Dette giver en fordel i forhold til traditionelle dyremodeller, som er afhængige af transgen overekspression af muterede gener for at generobre menneskers sygdom23,24. Derudover giver vores fuldt menneskelige system mulighed for potentiel rekapitulation af menneskespecifik fysiologi og sygdom. Tidligere undersøgelser viste forskellene mellem gnaver og human NMJ morfologi25, hvilket tyder på, at forsigtighed skal gennemføres, når man bruger gnavere til at løse menneskelige NMJ patologi. Selv om dette system er en relativ simpel in vitro setup, som mangler kompleksiteten af en in vivo model, var det muligt at påvise, at NMJ morfologi vises i mikrofluidiske enheder lignede NMJs af menneskelige amputater25. Desuden giver denne model mulighed for NMJ evaluering under NMJ dannelse og modning, potentielt afslørende tidlige sygdom fænotyper, som er fraværende, uidentificerbare, eller overset i menneskelige post mortem prøver.
MABs giver en gyldig mulighed for at generere myotubes, selv om deres begrænsede overlevelse på 10 dage er en ulempe for systemet. Myotube overlevelse afhænger af deres tilknytning til overfladen, som sandsynligvis er kompromitteret af spontane sammentrækninger af myofibers. Efter mere end 10 dage, vil de fleste myotubes have løsrevet, hvilket gør NMJ kultur ubrugelig. Ideelt set ville myotubes også blive genereret fra iPSCs. De nuværende protokoller har imidlertid vist sig vanskelige at reproducere26 på grund af variation i fusionsindekset27,28,29,30.
Ved at bruge kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder genererede vi et standardiseret system, som er fuldt tilgængeligt. Andre NMJ-modeller findes31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Men de er typisk afhængige af enkelte rum, som mangler opdeling og flydende isolation mellem celletyper eller på skræddersyede kulturfartøjer, hvilket sænker tilgængeligheden og potentielt også reproducerbarheden. De mikrofluidiske enheder, der anvendes til denne protokol, kan købes med mikrogroove af forskellig længde, hvilket giver mulighed for yderligere analyse såsom axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersøgelser. Den fluidiske isolation mellem rum muliggør yderligere opdelt lægemiddelbehandling af enten motoriske neuroner eller myotubes, som kan være gunstig i terapiudvikling. Flere virksomheder med speciale i mikrofluidics er opstået, som har åbnet op for et stort udvalg af enhed design og funktioner, yderligere fremme tilgængeligheden for in vitro forskning.
Afslutningsvis har vi udviklet en protokol, der giver en pålidelig, alsidig og nem metode til at dyrke menneskelige motorenheder med funktionelle NMJs.

NMJs lette kommunikationen mellem lavere spinal motor neuroner og skeletmuskulaturfibre gennem frigivelse af neurotransmittere1. I motoriske neuron lidelser som ALS og SMA, NMJs degenerere, hvilket forårsager en forstyrrelse i kommunikationen med musklerne2,3,4,5,6,7. Dette resulterer i, at patienter gradvist mister deres muskelfunktion, hvilket får dem til at være kørestolsbundne og i sidste ende afhængige af respiratorisk livsunderstøttelse på grund af progressiv atrofi af vitale muskelgrupper som mellemgulvet. De nøjagtige underliggende mekanismer, der er ansvarlige for dette dybe tab af NMJs i disse lidelser, er ukendte. Mange undersøgelser er blevet udført på transgene dyremodeller, hvilket har givet os en vis indsigt i patogenesen af NMJ degeneration5,6,8,9,10,11. Men for fuldt ud at forstå patologien og modvirke denervation er det vigtigt at have et menneskeligt system, som giver fuld tilgængelighed.
Her beskriver protokollen en relativt enkel måde at generere menneskelige NMJs gennem co-dyrkning af hiPSC-afledte motor neuroner og menneskelige primære MAB-afledte myotubes ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder. Brugen af mikrofluidics til at polarisere og flydende isolere somaer og axoner af neuroner har været kendt siden den første beskrivelse af 'Campenot' kamre12 i slutningen af 1970'erne. Siden da er flere mikrofluidiske designs blevet fremstillet, herunder kommercielle muligheder. De enheder, der anvendes i denne protokol indeholder to rum, og hvert rum består af to brønde forbundet med en kanal13. De to rum er spejlet og forbundet med flere mikrogroove. Disse mikrogroove har en størrelse, der letter neuritvæksten, samtidig med at den flydende isolation mellem de to rum opretholdes gennem et kapillært hydrostatisk tryk13,14. Ved hjælp af dette system er det muligt at dyrke motoriske neuroner i et rum og muskelceller i det andet, hver i deres specifikke kulturmedium, mens det stadig letter en fysisk forbindelse gennem neuritter, der passerer gennem mikrogrooves og engagerer sig med muskelcellerne. Denne model giver et fuldt tilgængeligt og fleksibelt in vitro-system af en menneskelig motorisk enhed, som kan bruges til at studere tidlig NMJ patologi i sygdomme som ALS og SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Neuromuskulære vejkryds (NMJs) er specialiserede synapser mellem axon af den lavere motoriske neuron og musklen lette engagement muskelsammentrækning. I motoriske neuron lidelser, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og spinal muskelatrofi (SMA), NMJs degenerere, hvilket resulterer i muskelatrofi og progressiv lammelse. Den underliggende mekanisme for NMJ degeneration er ukendt, hovedsagelig på grund af manglen på omsættelige forskningsmodeller. Denne undersøgelse havde til formål at skabe en alsidig og reproducerbar in vitro model af en menneskelig motor enhed med funktionelle NMJs. Derfor blev menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte motornanoner og menneskelige primære mesoangioblast (MAB)-afledte myotubes co-dyrket i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder. Brugen af flydende isolerede mikrorum giver mulighed for vedligeholdelse af cellespecifikke mikromiljø, samtidig med at celle-til-celle kontakt tillades gennem mikrogroove. Ved at anvende en chemotactic og volumetrisk gradient, væksten af motoriske neuron-neurites gennem mikrogroove fremme myotube interaktion og dannelsen af NMJs blev stimuleret. Disse NMJs blev identificeret immunocytokemisk gennem co-lokalisering af motor neuron præsynaptisk markør synaptophysin (SYP) og postsynaptisk acetylcholin receptor (AChR) markør α-bungarotoxin (Btx) på myotubes og karakteriseret morfologisk ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Funktionaliteten af NMJs blev bekræftet ved at måle calcium svar i myotubes ved depolarisering af motoriske neuroner. Den motoriske enhed, der genereres ved hjælp af standard mikrofluidiske enheder og stamcelleteknologi, kan støtte fremtidig forskning med fokus på NMJs inden for sundhed og sygdom.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Vi beskriver en metode til at generere menneskelige motorenheder i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder ved at co-culturing human induceret pluripotente stamcelle-afledte motor neuroner med menneskelige primære mesoangioblast-afledte myotubes resulterer i dannelsen af funktionelt aktive neuromuskulære knudepunkter.

Generation af menneskelige motorenheder med funktionelle neuromuskulære vejkryds i mikrofluidiske enheder

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Denne relativt enkle metode kan hjælpe forskning med fokus på motoriske neuroner og neuromuskulære knudepunkter i sundhed og sygdom. Denne protokol anvender standard stamcelleteknologi og kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder, hvilket øger reproducerbarheden. Afbrydelsen af motoriske neuroner og muskelceller er et tidligt fænomen i flere neuromuskulære sygdomme.En simpel humaniseret model kan bidrage til at udvikle strategier til at modvirke dette fænomen. Vi bruger denne model til at undersøge den motoriske neuron lidelse, amyotrofisk lateral sklerose, men denne model kan også bruges til andre lidelser, hvor motorenheden er afgørende. Begynd med at overføre enheden ved hjælp af sammenkne fra forsendelsesbeholderen til petriskålen, der indeholder 10 milliliter på 70% til 100% ethanol til sterilisering i 10 sekunder.Overfør enheden med sammenk tvinger til et stykke papir for at lufttørre i Laminar Flow i ca. 30 minutter. Når en enhed er tørret, skal du bruge sammenkædninger til at flytte hver enhed til en individuel 10 centimeter petriskål. For at belægge enheden med Poly-L-ornithine eller PLO skal du tilføje 100 mikroliter PLO-opløsning til toppen godt og observere væsken, der passerer fra toppen godt gennem kanalen til bunden godt.Tilsæt derefter 100 mikroliter PLO-opløsning til bunden godt, og gentag på den anden side af mikrosporene. Afslut ved at tilføje 100 mikroliter PLO-opløsning på den ene side for at skabe en volumengradient mellem de to spejlede sider af enheden for at belægge mikrosporene. Inkuber i tre timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Efter tre timer skal enheden vaskes tre gange i fem minutter med DPBS. Coat enheden med 20 mikrogram per milliliter laminin og neurobasal medium ved at følge proceduren svarende til PLO belægning. Inkuber enheden natten over ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Den følgende dag skal du bruge en 200 mikroliter pipette og placere spidsen i brønden modsat kanalåbningen for at fjerne lamininbelægningen fra brøndene. Efter at have tilføjet DPBS til alle brønde, skal du lade enhederne med DPBS i Laminar Flow ved stuetemperatur til cellesåning. Skær SCM ark til størrelsen af enheden, mens du efterlader et par millimeter på hver side.Efter sterilisering af enheder og SCM plader i en Petri parabol indeholder 10 milliliter af 70% til 100% ethanol i 10 sekunder, overføre enhederne med sammenkværn til en seks-brønd plade og SCM plader til en 10 centimeter Petri parabol til lufttørring i Laminar Flow. Anbring enheden på kanten, så alle sider kan tørre i ca. 30 minutter. Coat enhederne ved at tilføje en milliliter PLO-opløsning pr. brønd til hver enhed i seks-brøndspladen.Sørg for, at enheden flyder oven på PLO-opløsningen med kanal- og mikrosporetsiden nedad i væsken. Coat SCM ark ved at tilføje 10 milliliter PLO opløsning til 10 centimeter Petri parabol, og bruge propeller til at skubbe ned SCM ark i væsken. Inkuber enheder og SCM-ark i tre timer som påvist tidligere.Efter tre timer skal enhederne og SCM-arkene vaskes to gange i fem minutter med DPBS efterfulgt af endnu en vask i fem minutter med sterilt vand. Overfør derefter hvert SCM ark til en individuel 10 centimeter Petriskål til lufttørre. Mens du arbejder under et mikroskop i Laminar Flow, skal du bruge sammentrækninger til at montere silikoneenheden med kanalen og mikrosporet side ned i en 90 graders vinkel på SCM-arket, der sikrer, at alle sider er justeret.Tryk let ned på enheden for at sikre, at du ikke kun forsegler yderkanter, men også omkring brønde, kanaler og mikrospor. For at belægge enheden med laminin, inde i Laminar Flow og under mikroskopet, tilsættes 100 mikroliter af 20 mikrogram pr. milliliteropløsning af laminin i top godt ved hjælp af en 200 mikroliter pipette. Overhold væsken, der passerer fra toppen godt gennem kanalen til bunden godt uden lækage omkring brønden og kanalen.Derefter tilsættes 100 mikroliter laminin-opløsning til bunden godt, gentag på den anden side af mikrosporene og afslut med yderligere 100 mikroliter laminin på den ene side for at skabe en volumengradient mellem de to spejlede sider af enheden for at belægge mikrosporene og derefter inkubere enheden natten over. Den følgende dag skal du fjerne belægningen fra brøndene med 200 mikroliters pipetten ved at placere spidsen i brønden overfor kanalåbningen, efter at have tilføjet DPBS til alle brønde, lad enhederne med DPBS i Laminar Flow ved stuetemperatur til cellesåning. For at plade neurale forfædre celler eller NPC'er i den mikrofluidiske enhed, fjerne DPBS fra to brønde på den ene side af mikro riller i enheden ved hjælp af en 200 mikroliter pipette.At frø i alt 250, 000 NPC'er og 60 til 100 mikroliter af dag 10 motor neuron medium per enhed, i øverste højre brønd, frø halvdelen af celle suspension tæt på kanalen åbning i en vinkel på 45 grader. Hold pause i et par sekunder for at lade celleaffjedringen flyde gennem kanalen, før du tilføjer den resterende halvdel af celleaffjedringen i den nederste brønd. Brug en pen til at markere den seedede side som NPC eller tilsvarende, for nem orientering af enheden uden et mikroskop, og inkubere i fem minutter for celle vedhæftet fil.Dernæst langsomt fylde op de to NPC seedede brønde med en ekstra dag 10 motor neuron medium til et samlet volumen på 200 mikroliter per brønd. Brug en 200 mikroliter pipette, fjerne DPBS fra de to brønde på den anden side af mikro riller modsatte af frisksåede NPC'er. Tilføj 200 mikroliter af dag 10 motor neuron medier pr godt til de useedede brønde.Tilsæt derefter seks milliliter DPBS pr. 10 centimeter skål omkring enheden for at forhindre fordampning af mediet under inkubation. For at ændre mediet skal du langsomt fjerne medier i begge brønde med NPC'er ved at placere 200 mikroliters pipettespids i den nederste kant af brøndvæggen overfor kanalåbningen. For at forhindre en stærk medium flow fra at beskadige cellerne på kanalen, langsomt tilføje 50 til 100 mikroliter af frisk motor neuron medium til hver brønd ved løbende at skifte mellem top og bund godt.Gentag processen, indtil hver brønd indeholder 200 mikroliter af medium. På dag 17 af den motoriske neurondifferentiering skal du fjerne motor neuronmediet på den useedede side af mikrosporene i enheden med en 200 mikroliter pipette og vaske brøndene med DPBS. Seed i alt 200.000 menneskelige primære mesoangioblaster eller MABs, i 60 til 100 mikroliter af vækstmedium pr enhed ved såning halvdelen af celle suspension i top godt.Pause i et par sekunder for at tillade celleaffjedringen at strømme gennem kanalen, før du sår den resterende halvdel af celleaffjedringen i bunden godt, som det tidligere blev demonstreret til plating af NPC'er. Inkuber enheden i fem minutter til celletilbehør. Derefter fyldes de to frisk MAB-seedede brønde med et ekstra vækstmedium og inkuberes igen som demonstreret.For at indlede kemotaktik og volumetrisk gradient på den 21. dag i den motoriske neurondifferentiering skal du tilføje 200 mikroliters pr. brønd af motor neuron neurobasal medium, der indeholder vækstfaktorer til Myotube-rummet, og tilsæt derefter 100 mikroliters pr. brønd af motor neuron basal medium uden vækstfaktorer til det motoriske neuronrum. Det er vigtigt at vurdere cellelinjernes differentieringspotentiale, før de dyrkes sammen i mikrofluidiske enheder. Fusionsindekset for MBS blev fastlagt, og ca. 8% blev anslået til at være tilstrækkeligt til samkultur.De genererede motor neuron kulturer var 85 til 95% positive for motor neuron markører. For at karakterisere og kvantificere mængden af neuromuskulære knudepunkter eller NMJs, antallet af co-lokaliseringer mellem motor neuron og præ-synaptiske markører neurofilament tung kæde og synaptofysin og postsynaptisk acetylen receptor markør alpha bungarotoxin, blev talt gennem hver sygdom stak og blev normaliseret på en række myosin-tunge kæde mærket Myotubes til stede i Z-stakken. NMJs optrådte som enkelt kontaktpunkt NMJs, hvor neurite berørte en klynge af en subtil cholin receptor på et interaktionspunkt.Eller som flere kontaktpunkt NMJs, hvor en neurit pustet ud og engageret med en subtil cholin receptor klynge over en større overflade. Kvantificering af procentdelen af motor neuron innoverede Myotubes angivet, at ikke alle Myotubes indeholdt NMJs. Ved motor neuron aktivering med kaliumchlorid, calcium tilstrømning blev observeret i Fluo-4 mærket Myotubes, som bekræftede en funktionel forbindelse gennem til motor neuron neurit i Myotube, tilsætning af NMJ blocker d-tubocurarine, eller DTC til Myotube rummet resulterede i en hæmning af calcium tilstrømning.For at få den største succes med denne model er det utroligt vigtigt at udføre en cellelinje kvalitetskontrol og for at undgå dannelsen af luftbobler i enhedens kanaler. Ved at kombinere det neuromuskulære kryds i en skål med andre IPC direkte celletyper efterligner endnu bedre in vitro-situationen, dette gør det også muligt at studere disse celletypers rolle.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulære forbindelse: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og ændringer i Synaptic Protein Density Brug Konfokal Fluorescens mikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse af Udvikling Tooth Kim innervation Brug Mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantificering Matters: Karakterisering af fænotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Den fibular nerveskade Metode: En pålidelig analyse til at identificere og Test faktorer, Reparation neuromuskulære forbindelse

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal transport af organeller i motorneuronkulturer ved hjælp af microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Tre-dimensionelle Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Funktionel isolering af enkeltmotoriske enheder af Rotte Mediale Gastrocnemius Muskel

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissektion af enkelt skeletmuskelfibre til immunfluorescerende og morfometriske analyser af hele mount neuromuskulære vejkryds

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...