Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

De auteurs danken Nikky Corthout en Sebastian Munck van LiMoNe, Onderzoeksgroep Moleculaire Neurobiologie (VIB-KU Leuven) voor hun advies over live-cell calcium transient fluorescentie opnames. Dit onderzoek werd ondersteund door de Fulbright Commission naar België en Luxemburg, KU Leuven (C1 en "Opening the Future" Fund), het VIB, het Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (IWT; SBO-iPSCAF), het "Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, de ALS Liga België (A Cure for ALS), de Belgische Overheid (Interuniversitair Attractiepolen Programma P7/16 geïnitieerd door het Federaal Wetenschapsbeleid), de Thierry Latran Foundation en de "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. en J.B. worden ondersteund door doctoraatsbeurzen toegekend door FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. heeft een patent op het gebruik van HDAC-remmers bij de ziekte van Charcot-Marie-Tooth (US-2013227717-A1), is wetenschappelijk medeoprichter van Augustine Therapeutics en lid van de wetenschappelijke adviesraad. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Het protocol beschrijft een relatief eenvoudig te gebruiken methode, die in minder dan 30 dagen menselijke motoreenheden met functionele NMJ's genereert in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten. Er wordt beschreven hoe de NMJ's morfologisch kunnen worden beoordeeld door middel van standaardtechnieken zoals ICC en SEM en functioneel door live-cell calciumopnamen.
Een groot voordeel van dit protocol is het gebruik van stamceltechnologie. Dit zorgt voor een volledig aanpassingsvermogen waarbij NMJ's kunnen worden geëvalueerd in zowel gezondheid als ziekte, onafhankelijk van het donorprofiel. Het model is al succesvol en nuttig gebleken in ALS-onderzoek, waar we stoornissen in neurietuitgroei, hergroei en NMJ-nummers identificeerden als nieuwe fenotypen als gevolg van mutaties in het FUS-gen18. Met dit model is het mogelijk om het onderzoek uit te breiden naar sporadische vormen van ALS, waarbij de etiologie onbekend is, door gebruik te maken van iPSC's van sporadische ALS-patiënten. Dit biedt een voordeel ten opzichte van traditionele diermodellen, die afhankelijk zijn van transgene overexpressie van gemuteerde genen om menselijke ziekten samen te vatten23,24. Bovendien maakt ons volledig menselijke systeem potentiële recapitulatie van mensspecifieke fysiologie en ziekte mogelijk. Eerdere studies toonden de verschillen aan tussen knaagdier en menselijke NMJ-morfologie25, wat suggereert dat voorzichtigheid moet worden betracht bij het gebruik van knaagdieren om menselijke NMJ-pathologie aan te pakken. Hoewel dit systeem een relatief eenvoudige in vitro opstelling is, die de complexiteit van een in vivo model mist, was het mogelijk om aan te tonen dat de NMJ-morfologie die in de microfluïdische apparaten werd weergegeven, leek op NMJ's van menselijke amputaten25. Bovendien maakt dit model NMJ-evaluatie mogelijk tijdens NMJ-vorming en -rijping, waardoor mogelijk vroege ziektefenotypen worden onthuld, die afwezig, niet identificeerbaar of over het hoofd worden gezien in menselijke postmortemmonsters.
MABs bieden een geldige optie om myotubes te genereren, hoewel hun beperkte overleving van 10 dagen een nadeel van het systeem is. De myotube-overleving is afhankelijk van hun hechting aan het oppervlak, die waarschijnlijk wordt aangetast door spontane samentrekkingen van de myofiberen. Na meer dan 10 dagen zullen de meeste myotubes zijn losgemaakt, waardoor de NMJ-cultuur onbruikbaar wordt. Idealiter zouden de myotubes ook worden gegenereerd uit iPSC's. De huidige protocollen zijn echter moeilijk te reproduceren26 vanwege de variabiliteit in de fusie-index27,28,29,30.
Door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaten hebben we een gestandaardiseerd systeem gegenereerd, dat volledig toegankelijk is. Andere NMJ-modellen bestaan31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Ze vertrouwen echter meestal op enkele compartimenten, die de compartimentering en vloeiende isolatie tussen celtypen missen, of op op maat gemaakte kweekvaten, wat de beschikbaarheid en mogelijk ook de reproduceerbaarheid verlaagt. De microfluïdische apparaten die voor dit protocol worden gebruikt, kunnen worden gekocht met microgrooves van verschillende lengtes, wat verdere analyse mogelijk maakt, zoals axonaal transport43,44 of axotomie18,45,46 onderzoeken. De vloeiende isolatie tussen compartimenten maakt verder een gecompartimenteerde medicamenteuze behandeling van motorneuronen of myotubes mogelijk, wat gunstig kan zijn bij de ontwikkeling van therapieën. Er zijn meer bedrijven ontstaan die gespecialiseerd zijn in microfluïdica, wat zich heeft opengesteld voor een grote selectie van apparaatontwerp en -functies, waardoor de toegankelijkheid voor in vitro onderzoek verder wordt bevorderd.
Tot slot hebben we een protocol ontwikkeld dat een betrouwbare, veelzijdige en eenvoudige methode biedt om menselijke motoreenheden met functionele NMJ's te kweken.

NMJ's vergemakkelijken de communicatie tussen lagere spinale motorneuronen en skeletspiervezels door de afgifte van neurotransmitters1. Bij motorneuronaandoeningen zoals ALS en SMA degenereren de NMJ's, wat een verstoring in de communicatie met de spieren veroorzaakt2,3,4,5,6,7. Dit resulteert in patiënten die geleidelijk hun spierfunctie verliezen, waardoor ze rolstoelgebonden zijn en uiteindelijk afhankelijk zijn van ademhalingslevensondersteuning als gevolg van progressieve atrofie van vitale spiergroepen zoals het diafragma. De exacte onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor dit diepgaande verlies van NMJ's bij deze aandoeningen zijn onbekend. Er zijn veel studies gedaan naar transgene diermodellen, die ons enig inzicht hebben gegeven in de pathogenese van NMJ-degeneratie5,6,8,9,10,11. Om de pathologie volledig te begrijpen en de denervatie tegen te gaan, is het echter belangrijk om een menselijk systeem te hebben, dat volledige toegankelijkheid mogelijk maakt.
Hier beschrijft het protocol een relatief eenvoudige manier om menselijke NMJ's te genereren door het co-cultiveren van hiPSC-afgeleide motorneuronen en menselijke primaire MAB-afgeleide myotubes met behulp van commercieel beschikbare microfluïdische apparaten. Het gebruik van microfluïdica om de soma's en axonen van neuronen te polariseren en vloeibaar te isoleren is bekend sinds de eerste beschrijving van de 'Campenot'-kamers12 in de late jaren 1970. Sindsdien zijn er meer microfluïdische ontwerpen gefabriceerd, inclusief commerciële opties. De apparaten die in dit protocol worden gebruikt, bevatten twee compartimenten en elk compartiment bestaat uit twee putten die verbonden zijn met een kanaal13. De twee compartimenten zijn gespiegeld en verbonden met verschillende microgrooves. Deze microgrooves hebben een grootte die de groei van neuriet vergemakkelijkt met behoud van vloeibare isolatie tussen de twee compartimenten door middel van een capillaire hydrostatische druk13,14. Met behulp van dit systeem is het mogelijk om motorneuronen in het ene compartiment en spiercellen in het andere te kweken, elk in hun specifieke kweekmedium, terwijl het nog steeds een fysieke verbinding mogelijk maakt door neurieten die door de microgrooves gaan en zich bezighouden met de spiercellen. Dit model biedt een volledig toegankelijk en aanpasbaar in vitro systeem van een menselijke motorische eenheid, dat kan worden gebruikt om vroege NMJ-pathologie te bestuderen bij ziekten zoals ALS en SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Neuromusculaire juncties (NMJ's) zijn gespecialiseerde synapsen tussen het axon van het onderste motorneuron en de spier die de betrokkenheid van spiercontractie vergemakkelijken. Bij motorneuronaandoeningen, zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS) en spinale musculaire atrofie (SMA), degenereren NMJ's, wat resulteert in spieratrofie en progressieve verlamming. Het onderliggende mechanisme van NMJ-degeneratie is onbekend, grotendeels te wijten aan het ontbreken van vertaalbare onderzoeksmodellen. Deze studie had tot doel een veelzijdig en reproduceerbaar in vitro model te creëren van een menselijke motoreenheid met functionele NMJ's. Daarom werden door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide motorneuronen en van menselijke primaire mesoangioblast (MAB) afgeleide myotubes gecoöpteerd in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten. Het gebruik van vloeistofgeïsoleerde microcompartimenten zorgt voor het onderhoud van celspecifieke micro-omgevingen terwijl cel-tot-cel contact via microgrooves mogelijk is. Door het toepassen van een chemotactische en volumetrische gradiënt werd de groei van motorneuron-neurieten door de microgrooves die myotube-interactie bevorderden en de vorming van NMJ's gestimuleerd. Deze NMJ's werden immunocytochemisch geïdentificeerd door co-lokalisatie van motorneuron presynaptische marker synaptophysine (SYP) en postsynaptische acetylcholine receptor (AChR) marker α-bungarotoxine (Btx) op myotubes en morfologisch gekarakteriseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). De functionaliteit van de NMJ's werd bevestigd door het meten van calciumresponsen in myotubes bij depolarisatie van de motorneuronen. De motorische eenheid die wordt gegenereerd met behulp van standaard microfluïdische apparaten en stamceltechnologie kan toekomstig onderzoek naar NMJ's in gezondheid en ziekte ondersteunen.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

We beschrijven een methode om menselijke motorische eenheden te genereren in commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaten door door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide motorneuronen te co-cultiveren met menselijke primaire mesoangioblast-afgeleide myotubes, wat resulteert in de vorming van functioneel actieve neuromusculaire juncties.

Generatie van menselijke motorische eenheden met functionele neuromusculaire juncties in microfluïdische apparaten

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Deze relatief eenvoudige methode kan helpen bij onderzoek gericht op motorneuronen en neuromusculaire juncties in gezondheid en ziekte. Dit protocol maakt gebruik van standaard stamceltechnologie en in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaten die de reproduceerbaarheid verhogen. De ontkoppeling van motorneuronen en spiercellen is een vroeg fenomeen bij verschillende neuromusculaire ziekten.Een eenvoudig gehumaniseerd model zou kunnen helpen bij het ontwikkelen van strategieën om dit fenomeen tegen te gaan. We gebruiken dit model om de motorneuronstoornis, amyotrofische laterale sclerose, te onderzoeken, maar dit model kan ook worden gebruikt voor andere aandoeningen waarbij de motorische eenheid essentieel is. Begin met het overbrengen van het apparaat met behulp van de tang van de zeecontainer naar de petrischaal met 10 milliliter 70% tot 100% ethanol voor sterilisatie gedurende 10 seconden.Breng het apparaat met een tang over op een stuk papier om het gedurende ongeveer 30 minuten aan de lucht te drogen in de Laminar Flow. Zodra een apparaat is gedroogd, gebruikt u een tang om elk apparaat naar een individuele petrischaal van 10 centimeter te verplaatsen. Om het apparaat te coaten met Poly-L-ornithine of PLO, voegt u 100 microliter PLO-oplossing toe aan de bovenste put en observeert u de vloeistof die van de bovenste put door het kanaal naar de onderste put gaat.Voeg vervolgens 100 microliter PLO-oplossing toe aan de onderste put en herhaal dit aan de andere kant van de microgroeven. Werk af door aan één kant 100 microliter PLO-oplossing toe te voegen om een volumegradiënt te creëren tussen de twee gespiegelde zijden van het apparaat om de microgroeven te coaten. Incubeer gedurende drie uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Was het apparaat na drie uur driemaal gedurende vijf minuten met DPBS. Coat het apparaat met 20 microgram per milliliter laminine en neurobasaal medium door de procedure te volgen die vergelijkbaar is met PLO-coating. Incubeer het apparaat 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Gebruik de volgende dag een pipet van 200 microliter en plaats de punt in de put tegenover de kanaalopening om de lamininecoating uit de putten te verwijderen. Nadat u DPBS aan alle putten hebt toegevoegd, laat u de apparaten met DPBS in de Laminar Flow op kamertemperatuur voor celzaaien. Knip de SCM-vellen op de grootte van het apparaat terwijl u aan elke kant een paar millimeter overlaat.Na het steriliseren van de apparaten en SCM-vellen in een petrischaal met 10 milliliter 70% tot 100% ethanol gedurende 10 seconden, breng je de apparaten met een tang over op een zes-well plaat en de SCM-platen naar een petrischaaltje van 10 centimeter voor luchtdroging in de Laminar Flow. Plaats het apparaat op de rand zodat alle zijden ongeveer 30 minuten kunnen drogen. Coat de apparaten door één milliliter PLO-oplossing per put toe te voegen aan elk apparaat in de zes-putplaat.Zorg ervoor dat het apparaat bovenop de PLO-oplossing zweeft met de kanaal- en microgroefzijde naar beneden gericht in de vloeistof. Coat de SCM-vellen door 10 milliliter PLO-oplossing toe te voegen aan de petrischaal van 10 centimeter en gebruik de tang om de SCM-vellen in de vloeistof te duwen. Incubeer apparaten en SCM-vellen gedurende drie uur zoals eerder gedemonstreerd.Was de apparaten en SCM-vellen na drie uur twee keer gedurende vijf minuten met DPBS, gevolgd door nog een wasbeurt gedurende vijf minuten met steriel water. Breng vervolgens elk SCM-vel over op een individuele petrischaal van 10 centimeter om aan de lucht te drogen. Gebruik tijdens het werken onder een microscoop in de Laminar Flow een tang om het siliconenapparaat met het kanaal en de microgroef naar beneden in een hoek van 90 graden op het SCM-vel te monteren, zodat alle zijden zijn uitgelijnd.Druk lichtjes op het apparaat om ervoor te zorgen dat u niet alleen de buitenranden afdicht, maar ook rond putten, kanalen en microgroeven. Om het apparaat te coaten met laminine, in de Laminar Flow en onder de microscoop, voegt u 100 microliter van 20 microgram per milliliter oplossing van laminine toe aan de bovenste put met behulp van een pipet van 200 microliter. Observeer de vloeistof die van de bovenste put door het kanaal naar de onderste put gaat zonder enige lekkage rond de put en het kanaal.Voeg vervolgens 100 microliter laminine-oplossing toe aan de bodemput, herhaal dit aan de andere kant van de microgroeven en werk af met nog eens 100 microliter laminine aan één kant om een volumegradiënt te creëren tussen de twee gespiegelde zijden van het apparaat om de microgroeven te coaten en incubateer het apparaat vervolgens een nacht. Verwijder de volgende dag de coating van de putten met de pipet van 200 microliter door de punt in de put tegenover de kanaalopening te plaatsen, na dpbs aan alle putten te hebben toegevoegd, laat u de apparaten met DPBS in de laminaire stroom bij kamertemperatuur voor celzaaien. Om de neurale voorlopercellen of NPC's in het microfluïdische apparaat te platen, verwijdert u DPBS uit twee putten aan één kant van de microgroeven in het apparaat met behulp van een pipet van 200 microliter.Om in totaal 250.000 NPC's en 60 tot 100 microliter van dag 10 motorneuronmedium per apparaat te zaaien, zaai je rechtsboven de helft van de celsuspensie dicht bij de kanaalopening onder een hoek van 45 graden. Pauzeer een paar seconden om de celsuspensie door het kanaal te laten stromen voordat u de resterende helft van de celsuspensie in de onderste put toevoegt. Gebruik een pen om de gezaaide zijde te markeren als NPC of gelijkwaardig, voor eenvoudige oriëntatie van het apparaat zonder microscoop, en incubeer gedurende vijf minuten voor celbevestiging.Vul vervolgens langzaam de twee NPC-gezaaide putten aan met een extra dag 10 motorneuronmedium tot een totaal volume van 200 microliter per put. Verwijder met een pipet van 200 microliter DPBS uit de twee putjes aan de andere kant van de microgroeven tegenover de vers gezaaide NPC's. Voeg 200 microliter motorneuronmedia per put toe aan de ongeplaatste putten.Voeg vervolgens zes milliliter DPBS per schotel van 10 centimeter rond het apparaat toe om verdamping van het medium tijdens de incubatie te voorkomen. Om het medium te vervangen, verwijdert u langzaam media in beide putten met NPC's door de pipetpunt van 200 microliter aan de onderkant van de putwand tegenover de kanaalopening te plaatsen. Om te voorkomen dat een sterke mediumstroom de cellen op het kanaal beschadigt, voegt u langzaam 50 tot 100 microliter vers motorneuronmedium toe aan elke put door voortdurend te wisselen tussen de bovenste en onderste put.Herhaal het proces totdat elke put 200 microliter medium bevat. Verwijder op dag 17 van de differentiatie van motorneuronen het motorneuronmedium aan de ongerichte kant van de microgroeven in het apparaat met een pipet van 200 microliter en was de putten met DPBS. Zaai in totaal 200.000 menselijke primaire mesoangioblasten of MABs, in 60 tot 100 microliter groeimedium per apparaat door de helft van de celsuspensie in de bovenste put te zaaien.Pauzeer een paar seconden om de celsuspensie door het kanaal te laten stromen voordat de resterende helft van de celsuspensie in de onderste put wordt gezaaid, zoals eerder is aangetoond voor het platen van NPC's. Incubateer het apparaat gedurende vijf minuten voor celbevestiging. Vul vervolgens de twee vers MAB-gezaaide putten aan met een extra groeimedium en incubeer opnieuw zoals aangetoond.Om de chemotactiek en volumetrische gradiënt op de 21e dag van de differentiatie van motorneuronen te initiëren, voegt u 200 microliter per put van motorneuron neurobasaal medium met groeifactoren toe aan het Myotube-compartiment en voegt u vervolgens 100 microliter per put van motorneuron basaal medium zonder groeifactoren toe aan het motorneuroncompartiment. Het is belangrijk om het differentiatiepotentieel van de cellijnen te beoordelen voordat ze worden meegekweekt in microfluïdische apparaten. De fusie-index van MABs werd bepaald en ongeveer 8% werd geschat als voldoende voor co-cultuur.De gegenereerde motorneuronculturen waren 85 tot 95% positief voor motorneuronmarkers. Voor het karakteriseren en kwantificeren van de hoeveelheid neuromusculaire juncties of NMJ's, werd het aantal co-lokalisaties tussen het motorneuron en pre-synaptische markers neurofilament zware keten en synaptofysine en postsynaptische acetyleenreceptormarker alfa bungarotoxine geteld door elke ziektestapel en werd genormaliseerd bij een aantal myosine-zware keten gelabelde Myotubes aanwezig in de Z-stack. De NMJ's verschenen als één contactpunt NMJ's waar neuriet op één interactiepunt een cluster van een subtiele cholinereceptor aanraakte.Of als meerdere contactpunt NMJ's waar een neuriet uitwaaierde en zich bezighield met de subtiele cholinereceptorcluster over een groter oppervlak. Kwantificering van het percentage motorneuron geïnnoveerde Myotubes gaf aan dat niet alle Myotubes NMJ's bevatten. Bij activering van motorneuronen met kaliumchloride werd calciuminstroom waargenomen in de Fluo-4 gelabelde Myotubes, die een functionele verbinding met motorneuronneuronneuriet in de Myotube bevestigden, de toevoeging van NMJ-blokker d-tubocurarine of DTC aan het Myotube-compartiment resulteerde in een remming van calciuminstroom.Om het grootste succes met dit model te hebben, is het ongelooflijk belangrijk om een cellijnkwaliteitscontrole uit te voeren en de vorming van luchtbellen in de kanalen van het apparaat te voorkomen. Het combineren van de neuromusculaire junctie in een schotel met andere IPC directe celtypen bootst nog beter de in vitro situatie na, dit maakt het ook mogelijk om de rol van deze celtypen te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

De fibular Nerve Injury Methode: Een betrouwbare Assay kunnen identificeren en Test factoren die Repair neuromusculaire verbindingen

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Driedimensionale motorische zenuw organoïde generatie

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...