Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
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Les auteurs remercient Nikky Corthout et Sebastian Munck de LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) pour leurs conseils sur les enregistrements de fluorescence transitoire du calcium des cellules vivantes. Cette recherche a été soutenue par la Commission Fulbright en Belgique et au Luxembourg, la KU Leuven (C1 et Fonds « Opening the Future »), le VIB, l’Agence pour l’innovation par la science et la technologie (IWT; SBO-iPSCAF), le « Fonds pour la Recherche Scientifique Flandre » (FWO-Vlaanderen), Target ALS, l’ALS Liga België (Un remède contre la SLA), le Gouvernement Belge (Programme Interuniversité Attraction Poles P7/16 initié par l’Office Fédéral belge de la politique scientifique), la Fondation Thierry Latran et l’Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires (ABMM). T.V. et J.B. sont soutenus par des bourses de doctorat décernées par FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. détient un brevet sur l’utilisation d’inhibiteurs de HDAC dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth (US-2013227717-A1), est co-fondateur scientifique d’Augustine Therapeutics et membre de son conseil consultatif scientifique. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Le protocole décrit une méthode relativement facile à utiliser, qui génère des unités motrices humaines avec des NMJ fonctionnels dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce en moins de 30 jours. Il est décrit comment les NMJ peuvent être évalués morphologiquement par des techniques standard telles que l’ICC et le SEM et fonctionnellement par des enregistrements de calcium de cellules vivantes.
Un grand avantage de ce protocole est l’utilisation de la technologie des cellules souches. Cela permet une adaptabilité totale dans laquelle les NMJ peuvent être évalués à la fois dans la santé et la maladie, indépendamment du profil du donneur. Le modèle s’est déjà avéré efficace et bénéfique dans la recherche sur la SLA, où nous avons identifié des déficiences dans l’excroissance des neurites, la repousse et le nombre de NMJ comme de nouveaux phénotypes dus à des mutations du gène FUS18. Avec ce modèle, il est possible d’élargir la recherche pour inclure des formes sporadiques de SLA, dont l’étiologie est inconnue, en utilisant des CSPi de patients atteints de SLA sporadiques. Cela offre un avantage par rapport aux modèles animaux traditionnels, qui reposent sur la surexpression transgénique de gènes mutés pour récapituler la maladie humaine23,24. De plus, notre système entièrement humain permet une récapitulation potentielle de la physiologie et de la maladie spécifiques à l’homme. Des études antérieures ont démontré les différences entre la morphologie des NMJ chez les rongeurs et chez l’homme25, ce qui suggère qu’il faut faire preuve de prudence lors de l’utilisation de rongeurs pour traiter la pathologie humaine des NMJ. Bien que ce système soit une configuration in vitro relativement simple, qui n’a pas la complexité d’un modèle in vivo, il a été possible de démontrer que la morphologie nmJ affichée dans les dispositifs microfluidiques ressemblait aux NMJ des amputés humains25. De plus, ce modèle permet une évaluation de la NMJ pendant la formation et la maturation de la NMJ, révélant potentiellement des phénotypes précoces de la maladie, qui sont absents, non identifiables ou négligés dans les échantillons post-mortem humains.
Les MAB offrent une option valable pour générer des myotubes, bien que leur survie limitée à 10 jours soit un inconvénient du système. La survie des myotubes repose sur leur attachement à la surface, qui est probablement compromis par des contractions spontanées des myofibres. Après plus de 10 jours, la plupart des myotubes se seront détachés, rendant la culture NMJ inutilisable. Idéalement, les myotubes seraient également générés à partir d’iPSC. Cependant, les protocoles actuels se sont révélés difficiles à reproduire26 en raison de la variabilité de l’indice de fusion27,28,29,30.
En utilisant des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce, nous avons généré un système standardisé, qui est entièrement accessible. D’autres modèles NMJ existent31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Cependant, ils reposent généralement sur des compartiments uniques, qui n’ont pas le compartimentage et l’isolement fluidique entre les types de cellules, ou sur des récipients de culture sur mesure, ce qui réduit la disponibilité et potentiellement aussi la reproductibilité. Les dispositifs microfluidiques utilisés pour ce protocole peuvent être achetés avec des microgrooves de différentes longueurs, ce qui permet des analyses plus approfondies telles que le transport axonal43,44 ou l’axotomie18,45,46 investigations. L’isolement fluidique entre les compartiments permet en outre un traitement médicamenteux compartimenté des motoneurones ou des myotubes, ce qui peut être favorable au développement thérapeutique. De plus en plus d’entreprises spécialisées dans la microfluidique ont vu le jour, ce qui s’est ouvert à un large choix de conceptions et de fonctionnalités de dispositifs, favorisant ainsi l’accessibilité à la recherche in vitro.
En conclusion, nous avons développé un protocole fournissant une méthode fiable, polyvalente et facile pour cultiver des unités motrices humaines avec des NMJ fonctionnels.

Les NMJ facilitent la communication entre les motoneurones de la colonne vertébrale inférieure et les fibres musculaires squelettiques grâce à la libération de neurotransmetteurs1. Dans les troubles des motoneurones comme la SLA et la SMA, les NMJ dégénèrent, ce qui provoque une perturbation de la communication avec les muscles2,3,4,5,6,7. Il en résulte que les patients perdent progressivement leur fonction musculaire, ce qui les rend en fauteuil roulant et éventuellement dépendants du soutien respiratoire en raison de l’atrophie progressive des groupes musculaires vitaux comme le diaphragme. Les mécanismes sous-jacents exacts responsables de cette perte profonde de NMJ dans ces troubles sont inconnus. De nombreuses études ont été réalisées sur des modèles animaux transgéniques, ce qui nous a permis de mieux comprendre la pathogenèse de la dégénérescence NMJ5,6,8,9,10,11. Cependant, pour bien comprendre la pathologie et contrer la dénervation, il est important d’avoir un système humain, qui permet une accessibilité totale.
Ici, le protocole décrit un moyen relativement simple de générer des NMJ humains grâce à la co-culture de motoneurones dérivés de hiPSC et de myotubes primaires humains dérivés de MAB à l’aide de dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce. L’utilisation de la microfluidique pour polariser et isoler fluidiquement les somas et les axones des neurones est connue depuis la première description des chambres de Campenot12 à la fin des années 1970. Depuis lors, d’autres conceptions microfluidiques ont été fabriquées, y compris des options commerciales. Les dispositifs utilisés dans ce protocole contiennent deux compartiments, et chaque compartiment est constitué de deux puits reliés par un canal13. Les deux compartiments sont mis en miroir et reliés par plusieurs microgrooves. Ces microgrooves ont une taille qui facilite la croissance des neurites tout en maintenant l’isolation fluidique entre les deux compartiments grâce à une pression hydrostatique capillaire13,14. En utilisant ce système, il est possible de cultiver des motoneurones dans un compartiment et des cellules musculaires dans l’autre, chacun dans leur milieu de culture spécifique, tout en facilitant une connexion physique à travers les neurites passant à travers les microgrooves et s’engageant avec les cellules musculaires. Ce modèle fournit un système in vitro entièrement accessible et adaptable d’une unité motrice humaine, qui peut être utilisé pour étudier la pathologie NMJ précoce dans des maladies comme la SLA et la SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Les jonctions neuromusculaires (NMJ) sont des synapses spécialisées entre l’axone du motoneurone inférieur et le muscle facilitant l’engagement de la contraction musculaire. Dans les troubles des motoneurones, tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et l’amyotrophie spinale (SMA), les NMJ dégénèrent, entraînant une atrophie musculaire et une paralysie progressive. Le mécanisme sous-jacent de la dégénérescence NMJ est inconnu, en grande partie en raison de l’absence de modèles de recherche traduisibles. Cette étude visait à créer un modèle in vitro polyvalent et reproductible d’une unité motrice humaine avec des NMJ fonctionnels. Par conséquent, les motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) et les myotubes dérivés du mésoangioblaste primaire humain (MAB) ont été co-cultivés dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce. L’utilisation de micro-compartiments isolés de manière fluide permet le maintien de microenvironnements spécifiques aux cellules tout en permettant un contact de cellule à cellule à travers des microgrooves. En appliquant un gradient chimiotactique et volumétrique, la croissance des motoneurones-neurites à travers les microgrooves favorisant l’interaction myotube et la formation de NMJ ont été stimulées. Ces NMJ ont été identifiés immunocytochimiquement par colocalisation du marqueur présynaptique des motoneurones synaptophysine (SYP) et du marqueur du récepteur postsynaptique de l’acétylcholine (AChR) α-bungarotoxine (Btx) sur les myotubes et caractérisés morphologiquement par microscopie électronique à balayage (MEB). La fonctionnalité des NMJ a été confirmée en mesurant les réponses calciques dans les myotubes lors de la dépolarisation des motoneurones. L’unité motrice générée à l’aide de dispositifs microfluidiques standard et de la technologie des cellules souches peut faciliter la recherche future axée sur les NMJ dans les domaines de la santé et de la maladie.

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Nous décrivons une méthode pour générer des unités motrices humaines dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce en co-cultivant des motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme avec des myotubes primaires dérivés de mésoangioblastes humains, ce qui entraîne la formation de jonctions neuromusculaires fonctionnellement actives.

Génération d’unités motrices humaines avec des jonctions neuromusculaires fonctionnelles dans des dispositifs microfluidiques

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Cette méthode relativement simple peut aider la recherche axée sur les motoneurones et les jonctions neuromusculaires dans la santé et la maladie. Ce protocole utilise la technologie standard des cellules souches et des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce qui augmentent la reproductibilité. La déconnexion des motoneurones et des cellules musculaires est un phénomène précoce dans plusieurs maladies neuromusculaires.Un simple modèle humanisé pourrait aider à développer des stratégies pour contrer ce phénomène. Nous utilisons ce modèle pour étudier le trouble du motoneurone, la sclérose latérale amyotrophique, cependant, ce modèle peut également être utilisé pour d’autres troubles dans lesquels l’unité motrice est essentielle. Commencez par transférer l’appareil à l’aide de la pince du conteneur d’expédition à la boîte de Pétri contenant 10 millilitres d’éthanol à 70% à 100% pour la stérilisation pendant 10 secondes.Transférez l’appareil avec une pince sur un morceau de papier pour qu’il sèche à l’air libre dans le flux laminaire pendant environ 30 minutes. Une fois qu’un appareil est séché, utilisez des pinces pour déplacer chaque appareil vers une boîte de Petri individuelle de 10 centimètres. Pour recouvrir l’appareil de Poly-L-ornithine ou de PLO, ajoutez 100 microlitres de solution de PLO au puits supérieur et observez le fluide passant du puits supérieur à travers le canal vers le puits inférieur.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de PLO au puits inférieur et répétez de l’autre côté des micro-rainures. Terminez en ajoutant 100 microlitres de solution PLO d’un côté pour créer un gradient de volume entre les deux côtés en miroir de l’appareil pour recouvrir les micro rainures. Incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Après trois heures, lavez l’appareil trois fois pendant cinq minutes avec DPBS. Enduisez l’appareil de 20 microgrammes par millilitre de laminine et de milieu neurobasal en suivant la procédure similaire au revêtement PLO. Incuber l’appareil pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, utilisez une pipette de 200 microlitres et placez la pointe dans le puits opposé à l’ouverture du canal pour enlever le revêtement de laminine des puits. Après avoir ajouté du DPBS à tous les puits, laissez les appareils avec du DPBS dans le flux laminaire à température ambiante pour l’ensemencement des cellules. Coupez les feuilles SCM à la taille de l’appareil tout en laissant quelques millimètres de chaque côté.Après avoir stérilisé les appareils et les feuilles SCM dans une boîte de Petri contenant 10 millilitres de 70% à 100% d’éthanol pendant 10 secondes, transférez les appareils avec pinces sur une plaque à six puits et les feuilles SCM dans une boîte de Petri de 10 centimètres pour un séchage à l’air dans le flux laminaire. Positionnez l’appareil sur le bord pour permettre à tous les côtés de sécher pendant environ 30 minutes. Enduire les appareils en ajoutant un millilitre de solution de PLO par puits à chaque appareil dans la plaque de six puits.Assurez-vous que l’appareil flotte sur le dessus de la solution PLO avec le canal et le côté micro-rainure orientés vers le bas dans le liquide. Enduire les feuilles de SCM en ajoutant 10 millilitres de solution de PLO à la boîte de Petri de 10 centimètres, et utiliser les pinces pour pousser les feuilles de SCM dans le liquide. Incuber des dispositifs et des feuilles SCM pendant trois heures, comme démontré précédemment.Après trois heures, lavez les appareils et les feuilles SCM deux fois pendant cinq minutes avec DPBS, puis un autre lavage pendant cinq minutes avec de l’eau stérile. Ensuite, transférez chaque feuille de SCM dans une boîte de Petri individuelle de 10 centimètres pour sécher à l’air. Lorsque vous travaillez au microscope dans le flux laminaire, utilisez une pince pour monter le dispositif en silicone avec le canal et la micro-rainure vers le bas à un angle de 90 degrés sur la feuille SCM en veillant à ce que tous les côtés soient alignés.Appuyez légèrement sur l’appareil pour vous assurer de sceller non seulement les bords extérieurs, mais aussi autour des puits, des canaux et des micro-rainures. Pour recouvrir l’appareil de laminine, à l’intérieur du flux laminaire et au microscope, ajoutez 100 microlitres de 20 microgrammes par millilitre de solution de laminine dans le puits supérieur à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Observez le fluide passer du puits supérieur à travers le canal vers le puits inférieur sans aucune fuite autour du puits et du canal.Par la suite, ajoutez 100 microlitres de solution de laminine au puits inférieur, répétez de l’autre côté des micro rainures et terminez avec 100 microlitres supplémentaires de laminine d’un côté pour créer un gradient de volume entre les deux côtés en miroir de l’appareil pour recouvrir les micro rainures, puis incubé l’appareil pendant la nuit. Le lendemain, retirez le revêtement des puits avec la pipette de 200 microlitres en positionnant la pointe dans le puits en face de l’ouverture du canal, après avoir ajouté du DPBS à tous les puits, laissez les appareils avec DPBS dans le flux laminaire à température ambiante pour l’ensemencement cellulaire. Pour plaquer les cellules de progéniteurs neuronaux ou les PNJ dans le dispositif microfluidique, retirez le DPBS de deux puits d’un côté des micro-rainures de l’appareil à l’aide d’une pipette de 200 microlitres.Pour ensemencer un total de 250 000 PNJ et 60 à 100 microlitres du jour 10 du milieu motoneurone par appareil, en haut à droite, ensemencez la moitié de la suspension cellulaire près de l’ouverture du canal à un angle de 45 degrés. Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de circuler dans le canal avant d’ajouter la moitié restante de la suspension cellulaire dans le puits inférieur. Utilisez un stylo pour marquer le côté ensemencé comme PNJ ou équivalent, pour faciliter l’orientation de l’appareil sans microscope, et incubez pendant cinq minutes pour la fixation de la cellule.Ensuite, rechargez lentement les deux puits ensemencés par NPC avec un milieu de motoneurone supplémentaire de jour 10 jusqu’à un volume total de 200 microlitres par puits. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirer le DPBS des deux puits de l’autre côté des micro-rainures opposées aux PNJ fraîchement ensemencés. Ajouter 200 microlitres de milieu de motoneurone du jour 10 par puits aux puits non ensemencés.Ajoutez ensuite six millilitres de DPBS par plat de 10 centimètres autour de l’appareil pour éviter l’évaporation du milieu pendant l’incubation. Pour changer le milieu, retirez lentement le support dans les deux puits avec des PNJ en positionnant la pointe de la pipette de 200 microlitres sur le bord inférieur de la paroi du puits en face de l’ouverture du canal. Pour éviter qu’un fort écoulement de milieu n’endommage les cellules sur le canal, ajoutez lentement 50 à 100 microlitres de milieu de motoneurone frais à chaque puits en changeant continuellement entre le puits supérieur et le puits inférieur.Répétez le processus jusqu’à ce que chaque puits contienne 200 microlitres de milieu. Le jour 17 de la différenciation des motoneurones, retirez le milieu du motoneurone du côté non ensemencé des micro rainures de l’appareil avec une pipette de 200 microlitres et lavez les puits avec du DPBS. Ensemencez un total de 200 000 mésoangioblastes primaires humains ou MAB, dans 60 à 100 microlitres de milieu de croissance par dispositif en ensemençant la moitié de la suspension cellulaire dans le puits supérieur.Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de circuler dans le canal avant d’ensemencer la moitié restante de la suspension cellulaire dans le puits inférieur, comme démontré précédemment pour le placage des PNJ. Incubez le dispositif pendant cinq minutes pour la fixation de la cellule. Ensuite, complétez les deux puits fraîchement ensemencés maB avec un milieu de croissance supplémentaire et incubez à nouveau comme démontré.Pour initier la tactique de chimio et le gradient volumétrique le 21e jour de la différenciation des motoneurones, ajoutez 200 microlitres par puits de milieu neurobasal de motoneurone contenant des facteurs de croissance au compartiment myotube, puis ajoutez 100 microlitres par puits de milieu basal de motoneurone sans facteurs de croissance au compartiment de motoneurone. Il est important d’évaluer le potentiel de différenciation des lignées cellulaires avant de les co-cultiver dans des dispositifs microfluidiques. L’indice de fusion des MAB a été déterminé, et environ 8 % ont été estimés suffisants pour la co-culture.Les cultures de motoneurones générées étaient positives de 85 à 95 % pour les marqueurs de motoneurones. Pour caractériser et quantifier la quantité de jonctions neuromusculaires ou NMJ, le nombre de colocalisations entre le motoneurone et les marqueurs pré-synaptiques de la chaîne lourde du neurofilament et de la synaptophysine et du marqueur du récepteur de l’acétylène postsynaptique alpha bungarotoxine, a été compté dans chaque pile de maladie et a été normalisé à un certain nombre de myotubes marqués à chaîne lourde de myosine présents dans la pile Z. Les NMJ sont apparus comme des NMJ à point de contact unique où la neurite a touché un groupe d’un récepteur subtil de la choline à un point d’interaction.Ou en tant que NMJ à points de contact multiples où une neurite s’est répandue et s’est engagée avec un groupe subtil de récepteurs de choline sur une plus grande surface. Quantification du pourcentage de neurones moteurs innovés Les myotubes ont indiqué que tous les myotubes ne contenaient pas de NMJ. Lors de l’activation des motoneurones avec du chlorure de potassium, un afflux de calcium a été observé dans les myotubes marqués Fluo-4, ce qui a confirmé une connexion fonctionnelle à la neurite du motoneurone dans le myotube, l’ajout de d-tubocurarine, bloqueur NMJ, ou DTC au compartiment Myotube a entraîné une inhibition de l’afflux de calcium.Pour avoir le plus grand succès avec ce modèle, il est extrêmement important d’effectuer un contrôle de la qualité de la lignée cellulaire et d’éviter la formation de bulles d’air dans les canaux de l’appareil. La combinaison de la jonction neuromusculaire dans une boîte avec d’autres types de cellules directes IPC imite encore mieux la situation in vitro, ce qui permet également d’étudier le rôle de ces types de cellules.

Research

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