Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Die Autoren danken Nikky Corthout und Sebastian Munck von LiMoNe, Forschungsgruppe Molekulare Neurobiologie (VIB-KU Leuven) für ihren Rat zu livezelligen Kalzium-Transientenfluoreszenzaufnahmen. Diese Forschung wurde von der Fulbright-Kommission für Belgien und Luxemburg, der KU Leuven (C1 und Fonds "Opening the Future"), dem VIB, der Agentur für Innovation durch Wissenschaft und Technologie (IWT; SBO-iPSCAF), der "Fund for Scientific Research Flanders" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, die ALS Liga België (A Cure for ALS), die belgische Regierung (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 initiiert vom belgischen Bundesamt für Wissenschaftspolitik), die Thierry Latran Foundation und die "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. und J.B. werden durch Ph.D.-Stipendien unterstützt, die von FWO-Vlaanderen vergeben werden.

L.V.D.B. hat ein Patent auf die Verwendung von HDAC-Inhibitoren bei der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit (US-2013227717-A1), ist wissenschaftlicher Mitbegründer von Augustine Therapeutics und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Das Protokoll beschreibt eine relativ einfach zu bedienende Methode, die in weniger als 30 Tagen menschliche motorische Einheiten mit funktionellen NMJs in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten erzeugt. Es wird beschrieben, wie die NMJs morphologisch durch Standardtechniken wie ICC und REM und funktionell durch Live-Cell-Calcium-Aufnahmen bewertet werden können.
Ein großer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung der Stammzelltechnologie. Dies ermöglicht eine vollständige Anpassungsfähigkeit, bei der NMJs unabhängig vom Spenderprofil sowohl gesundheitlich als auch krank bewertet werden können. Das Modell hat sich bereits in der ALS-Forschung als erfolgreich und vorteilhaft erwiesen, wo wir Beeinträchtigungen des Neuritenwachstums, des Nachwachsens und der NMJ-Zahlen als neuartige Phänotypen aufgrund von Mutationen im FUS-Gen identifiziert haben18. Mit diesem Modell ist es möglich, die Forschung auf sporadische Formen von ALS auszuweiten, bei denen die Ätiologie unbekannt ist, indem iPS-Zellen von sporadischen ALS-Patienten verwendet werden. Dies bietet einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Tiermodellen, die auf einer transgenen Überexpression mutierter Gene beruhen, um menschliche Krankheiten zu rekapitulieren23,24. Darüber hinaus ermöglicht unser vollständig menschliches System eine mögliche Rekapitulation der humanspezifischen Physiologie und Krankheit. Frühere Studien zeigten die Unterschiede zwischen der NAGEtier- und der menschlichen NMJ-Morphologie25, was darauf hindeutet, dass bei der Verwendung von Nagetieren zur Behandlung der menschlichen NMJ-Pathologie Vorsicht geboten ist. Obwohl es sich bei diesem System um einen relativ einfachen In-vitro-Aufbau handelt, dem die Komplexität eines In-vivo-Modells fehlt, konnte gezeigt werden, dass die in den mikrofluidischen Geräten gezeigte NMJ-Morphologie NMJs von menschlichen Amputaten ähnelt25. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell eine NMJ-Bewertung während der NMJ-Bildung und -Reifung und deckt möglicherweise frühe Krankheitsphänotypen auf, die in menschlichen Post-Mortem-Proben fehlen, nicht identifizierbar oder übersehen werden.
MABs bieten eine gültige Option zur Erzeugung von Myotuben, obwohl ihr begrenztes Überleben von 10 Tagen ein Nachteil des Systems ist. Das Myotube-Überleben hängt von ihrer Anhaftung an der Oberfläche ab, die wahrscheinlich durch spontane Kontraktionen der Myofiber beeinträchtigt wird. Nach mehr als 10 Tagen haben sich die meisten Myotubes gelöst, was die NMJ-Kultur unbrauchbar macht. Idealerweise würden die Myotuben auch aus iPS-Zellen erzeugt. Aktuelle Protokolle haben sich jedoch aufgrund der Variabilität des Fusionsindex als schwierig erwiesen2627,28,29,30.
Durch die Verwendung kommerziell erhältlicher mikrofluidischer Geräte haben wir ein standardisiertes System generiert, das vollständig zugänglich ist. Andere NMJ-Modelle existieren31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Sie verlassen sich jedoch typischerweise auf einzelne Kompartimente, denen die Kompartimentierung und fluidische Isolierung zwischen Zelltypen fehlt, oder auf maßgeschneiderte Kulturgefäße, was die Verfügbarkeit und möglicherweise auch die Reproduzierbarkeit verringert. Die für dieses Protokoll verwendeten mikrofluidischen Geräte können mit Mikrobohrungen unterschiedlicher Länge erworben werden, was weitere Analysen wie axonaler Transport43,44 oder Axotomie18,45,46 Untersuchungen ermöglicht. Die fluidische Isolierung zwischen den Kompartimenten ermöglicht darüber hinaus eine kompartimentierte medikamentöse Behandlung von Motoneuronen oder Myotuben, was in der Therapieentwicklung günstig sein kann. Weitere Unternehmen, die sich auf Mikrofluidik spezialisiert haben, sind entstanden, was sich für eine große Auswahl an Gerätedesign und -funktionen geöffnet hat, was die Zugänglichkeit für die In-vitro-Forschung weiter fördert.
Zusammenfassend haben wir ein Protokoll entwickelt, das eine zuverlässige, vielseitige und einfache Methode zur Kultivierung menschlicher motorischer Einheiten mit funktionalen NMJs bietet.

NMJs erleichtern die Kommunikation zwischen unteren spinalen Motoneuronen und Skelettmuskelfasern durch die Freisetzung von Neurotransmittern1. Bei Motoneuronerkrankungen wie ALS und SMA degenerieren die NMJs, was zu einer Störung der Kommunikation mit den Muskeln führt2,3,4,5,6,7. Dies führt dazu, dass die Patienten allmählich ihre Muskelfunktion verlieren, was dazu führt, dass sie an den Rollstuhl gebunden sind und schließlich aufgrund der fortschreitenden Atrophie lebenswichtiger Muskelgruppen wie des Zwerchfells auf die Atemwegserhaltung angewiesen sind. Die genauen zugrunde liegenden Mechanismen, die für diesen tiefgreifenden Verlust von NMJs bei diesen Störungen verantwortlich sind, sind unbekannt. Viele Studien wurden an transgenen Tiermodellen durchgeführt, was uns einige Einblicke in die Pathogenese der NMJ-Degeneration gegeben hat5,6,8,9,10,11. Um die Pathologie vollständig zu verstehen und der Denervierung entgegenzuwirken, ist es jedoch wichtig, ein menschliches System zu haben, das volle Zugänglichkeit ermöglicht.
Hier beschreibt das Protokoll eine relativ einfache Möglichkeit, menschliche NMJs durch die Co-Kultivierung von hiPSC-abgeleiteten Motoneuronen und humanen primären MAB-abgeleiteten Myotuben unter Verwendung kommerziell erhältlicher mikrofluidischer Geräte zu erzeugen. Die Verwendung von Mikrofluidik zur Polarisierung und fluidischen Isolierung der Somas und Axone von Neuronen ist seit der erstbeschriebenen Beschreibung der "Campenot"-Kammern12 in den späten 1970er Jahren bekannt. Seitdem wurden mehr mikrofluidische Designs hergestellt, einschließlich kommerzieller Optionen. Die in diesem Protokoll verwendeten Geräte enthalten zwei Fächer, und jedes Fach besteht aus zwei Vertiefungen, die mit einem Kanal13 verbunden sind. Die beiden Fächer sind verspiegelt und mit mehreren Mikrobohrungen verbunden. Diese Mikrorillen haben eine Größe, die das Neuritenwachstum erleichtert und gleichzeitig die fluidische Isolierung zwischen den beiden Kompartimenten durch einen kapillaren hydrostatischen Druck aufrechterhält13,14. Mit diesem System ist es möglich, Motoneuronen in einem Kompartiment und Muskelzellen in dem anderen zu kultivieren, jeweils in ihrem spezifischen Kulturmedium, während sie gleichzeitig eine physische Verbindung durch Neuriten ermöglichen, die durch die Mikrogrooves gehen und sich mit den Muskelzellen beschäftigen. Dieses Modell bietet ein vollständig zugängliches und anpassungsfähiges In-vitro-System einer menschlichen motorischen Einheit, mit dem die frühe NMJ-Pathologie bei Krankheiten wie ALS und SMA untersucht werden kann.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Neuromuskuläre Verbindungen (NMJs) sind spezialisierte Synapsen zwischen dem Axon des unteren Motoneurons und dem Muskel, die das Eingreifen der Muskelkontraktion erleichtern. Bei Motoneuronerkrankungen wie amyotropher Lateralsklerose (ALS) und spinaler Muskelatrophie (SMA) degenerieren NMJs, was zu Muskelatrophie und fortschreitender Lähmung führt. Der zugrunde liegende Mechanismus der NMJ-Degeneration ist unbekannt, was vor allem auf das Fehlen übersetzbarer Forschungsmodelle zurückzuführen ist. Diese Studie zielte darauf ab, ein vielseitiges und reproduzierbares In-vitro-Modell einer menschlichen motorischen Einheit mit funktionellen NMJs zu erstellen. Daher wurden humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC)-abgeleitete Motoneuronen und humane primäre Mesoangioblasten (MAB)-abgeleitete Myotuben in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten kokulturiert. Die Verwendung von fluidisch isolierten Mikrokompartimenten ermöglicht die Aufrechterhaltung zellspezifischer Mikroumgebungen und ermöglicht gleichzeitig den Kontakt von Zelle zu Zelle durch Mikrobohrungen. Durch die Anwendung eines chemotaktischen und volumetrischen Gradienten wurde das Wachstum von Motoneuron-Neuriten durch die Mikrorillen, die die Myotube-Interaktion und die Bildung von NMJs fördern, stimuliert. Diese NMJs wurden immunzytochemisch durch Kolokalisation von Motoneuronen-präsynaptischem Marker Synaptophysin (SYP) und postsynaptischem Acetylcholinrezeptor (AChR) Marker α-Bungarotoxin (Btx) auf Myotuben identifiziert und morphologisch mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) charakterisiert. Die Funktionalität der NMJs wurde durch die Messung der Kalziumreaktionen in Myotuben bei der Depolarisation der Motoneuronen bestätigt. Die motorische Einheit, die mit standardisierten mikrofluidischen Geräten und Stammzelltechnologie erzeugt wird, kann die zukünftige Forschung unterstützen, die sich auf NMJs in Gesundheit und Krankheit konzentriert.

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung menschlicher motorischer Einheiten in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten durch Kokulturierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Motoneuronen mit humanen primären Mesoangioblasten-abgeleiteten Myotuben, was zur Bildung funktionell aktiver neuromuskulärer Verbindungen führt.

Erzeugung humanmotorischer Einheiten mit funktionellen neuromuskulären Verbindungen in mikrofluidischen Geräten

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Diese relativ einfache Methode kann bei der Forschung helfen, die sich auf Motoneuronen und neuromuskuläre Verbindungen in Gesundheit und Krankheit konzentriert. Dieses Protokoll verwendet Standard-Stammzelltechnologie und kommerziell erhältliche mikrofluidische Geräte, was die Reproduzierbarkeit erhöht. Die Trennung von Motoneuronen und Muskelzellen ist ein frühes Phänomen bei mehreren neuromuskulären Erkrankungen.Ein einfaches humanisiertes Modell könnte helfen, Strategien zu entwickeln, um diesem Phänomen entgegenzuwirken. Wir verwenden dieses Modell, um die Motoneuronstörung, die amyotrophe Lateralsklerose, zu untersuchen, dieses Modell kann jedoch auch für andere Erkrankungen verwendet werden, bei denen die motorische Einheit wesentlich ist. Beginnen Sie mit dem Transfer des Geräts mit der Pinzette vom Versandbehälter in die Petrischale mit 10 Millilitern 70% bis 100% Ethanol zur Sterilisation für 10 Sekunden.Übertragen Sie das Gerät mit einer Pinzette auf ein Blatt Papier, um es in der Laminar Flow für ca. 30 Minuten an der Luft zu trocknen. Sobald ein Gerät getrocknet ist, verwenden Sie eine Pinzette, um jedes Gerät zu einer einzelnen 10-Zentimeter-Petrischale zu bewegen. Um das Gerät mit Poly-L-Ornithin oder PLO zu beschichten, fügen Sie 100 Mikroliter PLO-Lösung in den oberen Brunnen hinzu und beobachten Sie, wie die Flüssigkeit vom oberen Brunnen durch den Kanal zum unteren Brunnen gelangt.Fügen Sie dann 100 Mikroliter PLO-Lösung in den bodenigen Brunnen hinzu und wiederholen Sie ihn auf der anderen Seite der Mikrorillen. Abschließend fügen Sie 100 Mikroliter PLO-Lösung auf einer Seite hinzu, um einen Volumengradienten zwischen den beiden verspiegelten Seiten des Geräts zu erzeugen, um die Mikrorillen zu beschichten. Drei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.Nach drei Stunden waschen Sie das Gerät dreimal für fünf Minuten mit DPBS. Beschichten Sie das Gerät mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin und neurobasalem Medium, indem Sie das Verfahren ähnlich der PLO-Beschichtung befolgen. Inkubieren Sie das Gerät über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Verwenden Sie am nächsten Tag eine 200-Mikroliter-Pipette und positionieren Sie die Spitze im Brunnen gegenüber der Kanalöffnung, um die Laminin-Beschichtung von den Vertiefungen zu entfernen. Nachdem Sie DPBS zu allen Vertiefungen hinzugefügt haben, lassen Sie die Geräte mit DPBS in der Laminar Flow bei Raumtemperatur für die Zellaussaat. Schneiden Sie die SCM-Blätter auf die Größe des Geräts ab, während Sie auf jeder Seite einige Millimeter belassen.Nach dem Sterilisieren der Geräte und SCM-Platten in einer Petrischale mit 10 Millilitern 70% bis 100% Ethanol für 10 Sekunden werden die Geräte mit einer Pinzette auf eine Sechs-Well-Platte und die SCM-Platten auf eine 10-Zentimeter-Petrischale zur Lufttrocknung in der Laminar Flow übertragen. Positionieren Sie das Gerät auf der Kante, damit alle Seiten etwa 30 Minuten trocknen können. Beschichten Sie die Geräte, indem Sie jedem Gerät in der Sechs-Well-Platte einen Milliliter PLO-Lösung pro Vertiefung hinzufügen.Stellen Sie sicher, dass das Gerät auf der Oberseite der PLO-Lösung schwebt, wobei der Kanal und die Mikronutseite nach unten in die Flüssigkeit zeigen. Beschichten Sie die SCM-Platten, indem Sie 10 Milliliter PLO-Lösung in die 10-Zentimeter-Petrischale geben, und drücken Sie die SCM-Blätter mit der Pinzette in die Flüssigkeit. Inkubieren Sie Geräte und SCM-Platten drei Stunden lang, wie zuvor gezeigt.Nach drei Stunden waschen Sie die Geräte und SCM-Blätter zweimal für fünf Minuten mit DPBS, gefolgt von einer weiteren Wäsche für fünf Minuten mit sterilem Wasser. Dann übertragen Sie jedes SCM-Blatt in eine einzelne 10-Zentimeter-Petrischale zur Lufttrocknung. Während Sie unter einem Mikroskop in der Laminar Flow arbeiten, verwenden Sie eine Pinzette, um das Silikongerät mit dem Kanal und der Mikronutseite nach unten in einem Winkel von 90 Grad auf der SCM-Platte zu montieren, um sicherzustellen, dass alle Seiten ausgerichtet sind.Drücken Sie leicht auf das Gerät, um sicherzustellen, dass nicht nur die äußeren Kanten, sondern auch die Vertiefungen, Kanäle und Mikrorillen abgedichtet werden. Um das Gerät mit Laminin zu beschichten, fügen Sie im Laminar Flow und unter dem Mikroskop 100 Mikroliter à 20 Mikrogramm pro Milliliter Lamininlösung in den oberen Brunnen mit einer 200 Mikroliter Pipette hinzu. Beobachten Sie, wie die Flüssigkeit vom oberen Brunnen durch den Kanal zum unteren Brunnen gelangt, ohne dass das Bohrloch und der Kanal austreten.Anschließend fügen Sie 100 Mikroliter Lamininlösung in den Bodenschacht hinzu, wiederholen Sie ihn auf der anderen Seite der Mikrorillen und beenden Sie mit zusätzlichen 100 Mikrolitern Laminin auf einer Seite, um einen Volumengradienten zwischen den beiden verspiegelten Seiten des Geräts zu erzeugen, um die Mikrorillen zu beschichten, und inkubieren Sie das Gerät dann über Nacht. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtung von den Vertiefungen mit der 200-Mikroliter-Pipette, indem Sie die Spitze in der Vertiefung gegenüber der Kanalöffnung positionieren, nachdem Sie DPBS zu allen Vertiefungen hinzugefügt haben, lassen Sie die Geräte mit DPBS in der Laminar Flow bei Raumtemperatur für die Zellaussaat. Um die neuronalen Vorläuferzellen oder NPCs im mikrofluidischen Gerät zu plattieren, entfernen Sie DPBS aus zwei Vertiefungen auf einer Seite der Mikrorillen im Gerät mit einer 200-Mikroliter-Pipette.Um insgesamt 250.000 NPCs und 60 bis 100 Mikroliter des Tages 10 Motoneuronmedium pro Gerät zu säen, in der oberen rechten Vertiefung, säen Sie die Hälfte der Zellsuspension in der Nähe der Kanalöffnung in einem Winkel von 45 Grad. Halten Sie einige Sekunden inne, damit die Zellsuspension durch den Kanal fließen kann, bevor Sie die verbleibende Hälfte der Zellsuspension in die untere Vertiefung geben. Verwenden Sie einen Stift, um die ausgesäte Seite als NPC oder gleichwertig zu markieren, um das Gerät ohne Mikroskop leicht zu orientieren, und inkubieren Sie fünf Minuten lang für die Zellbefestigung.Als nächstes füllen Sie langsam die beiden NPC-seeded Wells mit einem zusätzlichen Tag 10 Motoneuronmedium auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikroliter pro Vertiefung. Entfernen Sie DPBS mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus den beiden Vertiefungen auf der anderen Seite der Mikrorillen gegenüber den frisch gesäten NPCs. Fügen Sie 200 Mikroliter des Tages 10 Motoneuron-Medien pro Vertiefung zu den ungesetzten Vertiefungen hinzu.Fügen Sie dann sechs Milliliter DPBS pro 10-Zentimeter-Schüssel um das Gerät herum hinzu, um die Verdunstung des Mediums während der Inkubation zu verhindern. Um das Medium zu wechseln, entfernen Sie langsam Medien in beiden Vertiefungen mit NPCs, indem Sie die 200 Mikroliter Pipettenspitze am unteren Rand der Vertiefungswand gegenüber der Kanalöffnung positionieren. Um zu verhindern, dass ein starker Mittelfluss die Zellen auf dem Kanal schädigt, fügen Sie langsam 50 bis 100 Mikroliter frisches Motoneuronmedium zu jeder Vertiefung hinzu, indem Sie kontinuierlich zwischen dem oberen und unteren Brunnen wechseln.Wiederholen Sie den Vorgang, bis jede Vertiefung 200 Mikroliter Medium enthält. Entfernen Sie am Tag 17 der Motoneurondifferenzierung das Motoneuronmedium auf der ungesetzten Seite der Mikrorillen im Gerät mit einer 200-Mikroliter-Pipette und waschen Sie die Vertiefungen mit DPBS. Säen Sie insgesamt 200.000 menschliche primäre Mesoangioblasten oder MABs in 60 bis 100 Mikroliter Wachstumsmedium pro Gerät, indem Sie die Hälfte der Zellsuspension in der oberen Vertiefung säen.Halten Sie einige Sekunden inne, damit die Zellsuspension durch den Kanal fließen kann, bevor Sie die verbleibende Hälfte der Zellsuspension in den Bodenbohrloch säen, wie zuvor für die Beschichtung von NPCs gezeigt. Füllen Sie dann die beiden frisch mit MAB bepflanzten Vertiefungen mit einem zusätzlichen Wachstumsmedium auf und inkubieren Sie erneut wie gezeigt.Um die Chemo-Taktik und den volumetrischen Gradienten am 21. Tag der Motoneurondifferenzierung zu initiieren, fügen Sie dem Myotube-Kompartiment 200 Mikroliter pro Vertiefung des neuronenneuronbasalen Mediums, das Wachstumsfaktoren enthält, hinzu und fügen Sie dann 100 Mikroliter pro Vertiefung des Motoneuron-Basalmediums ohne Wachstumsfaktoren zum Motoneuronkompartiment hinzu. Es ist wichtig, das Differenzierungspotenzial der Zelllinien zu bewerten, bevor sie in mikrofluidischen Geräten kokulturiert werden. Der Fusionsindex von MABs wurde bestimmt, und etwa 8% wurden als ausreichend für die Kokultur geschätzt.Die erzeugten Motoneuronkulturen waren zu 85 bis 95% positiv für Motoneuronmarker. Zur Charakterisierung und Quantifizierung der Menge an neuromuskulären Verbindungen oder NMJs wurde die Anzahl der Kolokalisationen zwischen dem Motoneuron und den präsynaptischen Markern Neurofilament Heavy Chain und Synaptophysin und postsynaptischer Acetylenrezeptormarker alpha Bungarotoxin durch jeden Krankheitsstapel gezählt und an einer Reihe von myosinlastigen, mit Myotuben markierten Myotuben im Z-Stack normalisiert. Die NMJs erschienen als Single-Contact-Point-NMJs, bei denen der Neurit an einem Interaktionspunkt einen Cluster eines subtilen Cholinrezeptors berührte.Oder als NMJs mit mehreren Kontaktpunkten, bei denen sich ein Neurit auffächerte und über eine größere Oberfläche mit dem subtilen Cholinrezeptorcluster interagierte. Die Quantifizierung des Prozentsatzes der von Motoneuronen innovierten Myotubes zeigte, dass nicht alle Myotubes NMJs enthielten. Bei der Aktivierung des Motoneurons mit Kaliumchlorid wurde ein Kalziumeintrag in die Fluo-4-markierten Myotubes beobachtet, was eine funktionelle Verbindung durch den Motoneuronneuriten im Myotube bestätigte, die Zugabe von NMJ-Blocker d-Tubocurarin oder DTC zum Myotube-Kompartiment führte zu einer Hemmung des Kalziumeintrags.Um mit diesem Modell den größten Erfolg zu haben, ist es unglaublich wichtig, eine Zelllinienqualitätsprüfung durchzuführen und die Bildung von Luftblasen in den Kanälen des Geräts zu vermeiden. Die Kombination der neuromuskulären Verbindung in einer Schale mit anderen IPC-Direktzelltypen ahmt die In-vitro-Situation noch besser nach, dies ermöglicht es auch, die Rolle dieser Zelltypen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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