Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

המחברים מודים ניקי קורתאוט וסבסטיאן Munck מ LiMoNe, קבוצת מחקר נוירוביולוגיה מולקולרית (VIB-KU Leuven) על עצתם על הקלטות פלואורסצנטיות חולפת סידן תאים חיים. מחקר זה נתמך על ידי ועדת פולברייט לבלגיה ולוקסמבורג, KU Leuven (C1 וקרן "פתיחת העתיד"), VIB, הסוכנות לחדשנות על ידי מדע וטכנולוגיה (IWT; SBO-iPSCAF), "הקרן למחקר מדעי פלנדריה" (FWO-Vlaanderen), TARGET ALS, ה-ALS Liga België (תרופה ל- ALS), ממשלת בלגיה (תוכנית פולנים משיכה בין-אוניברסיטאית P7/16 ביוזמת משרד מדיניות המדע הפדרלי בבלגיה), קרן תיירי לטרון ו"האגודה Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. ו J.B. נתמכים על ידי מלגות Ph.D. שהוענקו על ידי FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. יש פטנט על השימוש מעכבי HDAC במחלת Charcot-Marie-שן (US-2013227717-A1), הוא מייסד שותף מדעי של אוגוסטין Therapeutics, וחבר בוועדה המדעית המייעצת שלה. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול מתאר שיטה קלה יחסית לשימוש, המייצרת יחידות מוטוריות אנושיות עם NMJs פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית בפחות מ -30 יום. הוא מתואר כיצד ניתן להעריך את NMJs באופן מורפולוגי באמצעות טכניקות סטנדרטיות כגון ICC ו- SEM ופונקציונלית באמצעות הקלטות סידן של תאים חיים.
יתרון גדול של פרוטוקול זה הוא השימוש בטכנולוגיית תאי גזע. זה מאפשר הסתגלות מלאה שבה NMJs ניתן להעריך הן בריאות ומחלות, ללא תלות בפרופיל התורם. המודל הוכיח כבר מוצלח ומועיל במחקר ALS, שם זיהינו ליקויים במספרי נויריט, גידול מחדש ו- NMJ כפנוטיפים חדשניים עקב מוטציות בגן FUS18. עם מודל זה, ניתן להרחיב את המחקר כך שיכלול צורות ספורדיות של ALS, שם האטיולוגיה אינה ידועה, באמצעות IPSCs מחולים ALS ספורדיים. זה מספק יתרון על פני מודלים בעלי חיים מסורתיים, אשר מסתמכים על ביטוי יתר מהונדס של גנים מוטציה כדי recapitulate מחלות אנושיות23,24. בנוסף, המערכת האנושית המלאה שלנו מאפשרת recapitulation פוטנציאלי של פיזיולוגיה ומחלות ספציפיות לאדם. מחקרים קודמים הדגימו את ההבדלים בין מכרסם לבין מורפולוגיה אנושית NMJ25, אשר מציע כי יש ליישם זהירות בעת שימוש מכרסמים לטיפול בפתולוגיה NMJ אנושית. למרות שמערכת זו היא התקנה במבחנה פשוטה יחסית, אשר חסרה את המורכבות של מודל in vivo, ניתן היה להוכיח כי המורפולוגיה NMJ המוצגת במכשירים microfluidic דומה NMJs של קטיעה אנושית25. יתר על כן, מודל זה מאפשר הערכת NMJ במהלך היווצרות NMJ והתבגרות, פוטנציאל לחשוף פנוטיפים מחלה מוקדמת, אשר נעדרים, בלתי מזוהה, או התעלמו בדגימות שלאחר המוות אנושי.
MABs לספק אפשרות תקפה כדי ליצור myotubes, אם כי ההישרדות המוגבלת שלהם של 10 ימים היא חיסרון של המערכת. ההישרדות myotube מסתמך על החיבור שלהם אל פני השטח, אשר ככל הנראה נפגע על ידי התכווצויות ספונטניות של myofibers. לאחר יותר מעשרה ימים, רוב המיוטיובים יתנתקו, מה שהופך את תרבות NMJ לבלתי שמיש. באופן אידיאלי, myotubes ייווצרו iPSCs גם כן. עם זאת, הפרוטוקולים הנוכחיים הוכחו כקשים לשחזור26 בשל שונות במדד ההיתוך27,28,29,30.
באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית, יצרנו מערכת סטנדרטית, אשר נגישה באופן מלא. דגמי NMJ אחרים קיימים31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. עם זאת, הם מסתמכים בדרך כלל על תאים בודדים, אשר חסרים מידור ובידוד נוזלי בין סוגי תאים, או על כלי תרבות בהתאמה אישית, אשר מוריד את הזמינות ואולי גם את הרבייה. ניתן לרכוש את המכשירים המיקרופלואידיים המשמשים לפרוטוקול זה עם מיקרוגרובים באורכים שונים, המאפשרים ניתוח נוסף כגון הובלה אקסונית43,44 או אקסוטומיה18,45,46 חקירות. הבידוד הנוזלי בין התאים מאפשר עוד יותר טיפול תרופתי ממודר של נוירונים מוטוריים או מיוטיוב, אשר יכול להיות חיובי בפיתוח הטיפול. חברות נוספות המתמחות במיקרופלואידיקה צמחו, שנפתחו למבחר גדול של עיצוב ותכונות של מכשירים, מה שמקדם עוד יותר את הנגישות למחקר במבחנה.
לסיכום, פיתחנו פרוטוקול המספק שיטה אמינה, רב-תכליתית וקלה לתרבות יחידות מוטוריות אנושיות עם NMJs פונקציונליים.

NMJs להקל על התקשורת בין נוירונים מוטורי עמוד השדרה התחתון סיבי שריר השלד באמצעות שחרור של נוירוטרנסמיטורים1. בהפרעות נוירון מוטוריות כמו ALS ו- SMA, NMJs מתנוונים, מה שגורם להפרעה בתקשורת עם השרירים2,3,4,5,6,7. התוצאה היא שחולים מאבדים בהדרגה את תפקוד השרירים שלהם, מה שגורם להם להיות קשורים לכיסא גלגלים ובסופו של דבר תלויים בתמיכה נשימתית עקב ניוון מתקדם של קבוצות שרירים חיוניות כמו הסרעפת. המנגנונים הבסיסיים המדויקים האחראים לאובדן העמוק הזה של NMJs בהפרעות אלה אינם ידועים. מחקרים רבים נעשו על מודלים של בעלי חיים מהונדסים, אשר נתן לנו כמה תובנות על הפתוגנזה של ניוון NMJ5,6,8,9,10,11. עם זאת, כדי להבין באופן מלא את הפתולוגיה ולנטרל את denervation, חשוב שתהיה מערכת אנושית, המאפשרת נגישות מלאה.
כאן, הפרוטוקול מתאר דרך פשוטה יחסית ליצור NMJs אנושי באמצעות פולחן משותף של נוירונים מוטוריים שמקורם hiPSC ומיוטיובים שמקורם MAB ראשוני אנושי באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית. השימוש במיקרופלואידיקה כדי לקוטב ולבודד באופן נוזלי את הסומסה והאקסונים של נוירונים ידוע מאז התיאור הראשון של תאי 'קמפנוט' 12 בסוף שנות השבעים. מאז, עיצובים מיקרופלואידיים נוספים מפוברקים, כולל אפשרויות מסחריות. ההתקנים המשמשים בפרוטוקול זה מכילים שני תאים, וכל תא מורכב משתי בארות המחוברות לערוץ13. שני התאים משוקפים ומחוברים למספר מיקרוגרובים. מיקרוגרובים אלה יש גודל המאפשר צמיחת נוריט תוך שמירה על בידוד נוזלי בין שני התאים באמצעות לחץ הידרוסטטי נימי13,14. באמצעות מערכת זו, ניתן לתרבות נוירונים מוטוריים בתא אחד ותאי שריר בתא השני, כל אחד במדיום התרבות הספציפי שלהם, תוך עדיין להקל על חיבור פיזי באמצעות neurites עובר דרך microgrooves ומעורבות עם תאי השריר. מודל זה מספק מערכת במבחנה נגישה ומותאמת לחלוטין של יחידה מוטורית אנושית, אשר ניתן להשתמש בה כדי ללמוד פתולוגיה NMJ מוקדם במחלות כמו ALS ו- SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

צמתים עצביים-שריריים (NMJs) הם סינפסות מיוחדות בין האקסון של הנוירון המוטורי התחתון לבין השריר המקלה על מעורבות התכווצות השרירים. בהפרעות נוירון מוטוריות, כגון טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), NMJs להתנוון, וכתוצאה מכך ניוון שרירים ושיתוק פרוגרסיבי. המנגנון הבסיסי של ניוון NMJ אינו ידוע, בעיקר בשל היעדר מודלים מחקריים לתרגום. מחקר זה נועד ליצור מודל הפריה רב-תכליתי ושחזורי של יחידת מנוע אנושית עם NMJs פונקציונליים. לכן, תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים על ידי האדם (hiPSC) נגזר נוירונים מוטוריים ומוזיאנגיובלסט ראשוני אנושי (MAB) שמקורם myotubes היו תרבית משותפת במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית. השימוש בתאים זעירים מבודדים באופן נוזלי מאפשר תחזוקה של מיקרו-סביבה ספציפית לתא תוך מתן אפשרות למגע בין תא לתא באמצעות מיקרוגרובים. על ידי החלת שיפוע כימי ונפחי, הצמיחה של נוירונים מוטוריים-neurites באמצעות microgrooves קידום אינטראקציה myotube ואת היווצרות של NMJs היו מגורה. NMJs אלה זוהו אימונוציטוכימית באמצעות לוקליזציה משותפת של נוירון מוטורי סמן סינפטופיזין (SYP) וסמן קולטן אצטילכולין פוסט-סינפטי (AChR) α-בנגרוטוקסין (Btx) על מיוטיובים ומאופיין מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). הפונקציונליות של NMJs אושרה על ידי מדידת תגובות סידן myotubes עם depolarization של הנוירונים המוטוריים. היחידה המוטורית שנוצרת באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים סטנדרטיים וטכנולוגיית תאי גזע יכולה לסייע במחקר עתידי המתמקד ב- NMJs בבריאות ובמחלות.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

אנו מתארים שיטה ליצירת יחידות מוטוריות אנושיות במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית על ידי שיתוף פולחן נוירונים מוטוריים המושרה תאי גזע פלוריפוטנטים עם מיוטיובים ראשוניים אנושיים וכתוצאה מכך היווצרות של צמתים עצביים שריריים פעילים מבחינה תפקודית.

ייצור יחידות מוטוריות אנושיות עם צמתים נוירו-שריריים פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

שיטה פשוטה יחסית זו יכולה לעזור במחקר התמקדות נוירונים מוטוריים וצמתים עצביים שריריים בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה משתמש בטכנולוגיית תאי גזע סטנדרטית ובמכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית אשר מגבירים את יכולת הרבייה. ניתוק של נוירונים מוטוריים ותאי שריר הוא תופעה מוקדמת במספר מחלות נוירו-שריריות.מודל אנושי פשוט יכול לעזור לפתח אסטרטגיות כדי לנטרל את התופעה. אנו משתמשים במודל זה כדי לחקור את הפרעת הנוירון המוטורי, טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם זאת, מודל זה יכול לשמש גם להפרעות אחרות שבהן היחידה המוטורית חיונית. התחל על ידי העברת המכשיר באמצעות מלקחיים מן המכולה לצלחת פטרי המכיל 10 מיליליטר של 70% עד 100% אתנול לעיקור במשך 10 שניות.מעבירים את המכשיר עם מלקחיים לפיסת נייר לאוויר יבש בזרם למינאר במשך כ -30 דקות. לאחר הייבוש של המכשיר, יש להשתמש במלקחיים כדי להעביר כל מכשיר לצלחת פטרי בודדת של 10 ס"מ. כדי לצפות את המכשיר בפולי-ל-אורניתין או אש"ף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון אש"ף לבאר העליונה וצפו בנוזל העובר מהבאר העליונה דרך הערוץ לבאר התחתונה.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון אש"ף לבאר התחתונה, ולחזור על הצד השני של חריצי מיקרו. סיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של פתרון אש"ף בצד אחד כדי ליצור מעבר צבע של עוצמת הקול בין שני הצדדים המשתקפים של המכשיר כדי לצפות את חריצי המיקרו. דגירה במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.לאחר שלוש שעות, לשטוף את המכשיר שלוש פעמים במשך חמש דקות עם DPBS. יש לצפות את המכשיר ב-20 מיקרוגרם למין מיליליטר ומדיום עצבי על ידי ביצוע ההליך בדומה לציפוי אש"ף. לדגור את המכשיר לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.למחרת להשתמש פיפטה 200 microliter ולמקם את הקצה בבאר מול פתיחת הערוץ כדי להסיר את ציפוי למינין מן הבארות. לאחר הוספת DPBS לכל הבארות, להשאיר את המכשירים עם DPBS בזרם למינאר בטמפרטורת החדר עבור זריעת תאים. חותכים את גליונות SCM לגודל המכשיר תוך השארת כמה מילימטרים בכל צד.לאחר עיקור המכשירים וגליונות SCM בצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של 70% עד 100% אתנול במשך 10 שניות, להעביר את המכשירים עם מלקחיים לצלחת שש באר ואת יריעות SCM צלחת פטרי 10 ס"מ לייבוש אוויר בזרם למינאר. מקם את ההתקן על הקצה כדי לאפשר לכל הצדדים להתייבש במשך כ -30 דקות. יש לצפות את המכשירים על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון אש"ף לבאר לכל מכשיר בלוח ששת הבארות.ודא שהמכשיר צף על גבי פתרון אש"ף עם צד הערוץ והחריץ הזעיר הפונה כלפי מטה אל תוך הנוזל. מצפים את יריעות ה-SCM על ידי הוספת 10 מיליליטר של תמיסת אש"ף לצלחת פטרי באורך 10 ס"מ, והשתמשו במלקחיים כדי לדחוף את יריעות ה-SCM לנוזל. התקני דגירה וגליונות SCM במשך שלוש שעות כפי שהודגם בעבר.לאחר שלוש שעות, לשטוף את המכשירים ואת יריעות SCM פעמיים במשך חמש דקות עם DPBS ואחריו לשטוף שוב במשך חמש דקות עם מים סטריליים. לאחר מכן מעבירים כל גיליון SCM לצלחת פטרי בודדת בגודל 10 ס"מ לייבוש אוויר. בעת עבודה תחת מיקרוסקופ ב-Laminar Flow, השתמש במלקחיים כדי להרכיב את התקן הסיליקון עם צד הערוץ והחריץ הזעיר כלפי מטה בזווית של 90 מעלות על גיליון ה- SCM המבטיח שכל הצדדים מיושרים.לחץ קלות כלפי מטה על ההתקן כדי לוודא לאטום לא רק קצוות החיצוניים, אלא גם סביב בארות, ערוצים וחריצים זעירים. כדי לצפות את המכשיר עם למינין, בתוך זרימת למינאר ומתחת למיקרוסקופ, להוסיף 100 microliters של 20 מיקרוגרם לפתרון מיליליטר של למינין בבאר העליונה באמצעות 200 pipette מיקרוליטר. שימו לב לנוזל העובר מהבאר העליונה דרך הערוץ לבאר התחתונה ללא דליפה סביב הבאר והתעל.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון למינין לבאר התחתונה, לחזור על הצד השני של חריצי מיקרו ולסיים עם 100 microliters נוסף של למינין בצד אחד כדי ליצור שיפוע נפח בין שני הצדדים שיקוף של המכשיר כדי לצפות את חריצי מיקרו, ולאחר מכן לדגור על המכשיר בן לילה. למחרת, להסיר את הציפוי מן הבארות עם 200 pipette microliters על ידי מיקום הקצה בבאר מול פתיחת הערוץ, לאחר הוספת DPBS לכל הבארות, להשאיר את המכשירים עם DPBS בזרימה למינאר בטמפרטורת החדר עבור זריעת תאים. כדי לפלס את תאי אבות העצבים או NPCs במכשיר microfluidic, להסיר DPBS משתי בארות בצד אחד של חריצי מיקרו במכשיר באמצעות 200 pipette microliter.כדי לזרוע בסך הכל 250, 000 NPCs ו 60 עד 100 microliters של יום 10 בינוני נוירון מוטורי לכל מכשיר, בחלק הימני העליון, זרע מחצית מתלה התא קרוב לפתיחת הערוץ בזווית של 45 מעלות. השהה למשך מספר שניות כדי לאפשר להשעיית התא לזרום דרך הערוץ לפני הוספת החצי הנותר של ההשעיה של התא בבאר התחתונה. השתמש בעט כדי לסמן את הצד הזרע כ- NPC או שווה ערך, לכיוון קל של ההתקן ללא מיקרוסקופ, ודגור במשך חמש דקות עבור התקשרות לתא.לאחר מכן, לאט לאט למלא את שתי בארות זרע NPC עם יום נוסף 10 נוירון מוטורי בינוני לנפח כולל של 200 microliters לבאר. באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטרים, הסר DPBS משתי הבארות בצד השני של חריצי המיקרו שמול NPCs שזה עתה זרעו. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיית נוירונים מוטוריים ליום 10 לבארות הבלתי מנוצחות.לאחר מכן להוסיף שישה מיליליטר של DPBS לכל צלחת 10 ס"מ סביב המכשיר כדי למנוע אידוי של המדיום במהלך הדגירה. כדי לשנות את המדיום, הסר לאט את המדיה בשתי הבארות עם NPCs על-ידי מיקום קצה הפיפטה של 200 מיקרוליטרים בקצה התחתון של קיר הבאר מול פתח הערוץ. כדי למנוע זרימה בינונית חזקה מלפגוע בתאים בערוץ, הוסף לאט 50 עד 100 מיקרוליטרים של נוירון מוטורי טרי בינוני לכל באר על ידי שינוי מתמיד בין הבאר העליונה והתחתון.חזור על התהליך עד שכל באר מכילה 200 מיקרוליטרים של בינוני. ביום 17 של בידול הנוירון המוטורי, להסיר את הנוירון המוטורי מדיום בצד הבלתי מנוצח של חריצי מיקרו במכשיר עם 200 pipette microliter לשטוף את בארות עם DPBS. זרע בסך הכל 200, 000 mesoangioblasts ראשוני אנושי או MABs, ב 60 עד 100 microliters של בינוני צמיחה לכל מכשיר על ידי זריעת מחצית השעיית התא בבאר העליונה.השהה למשך מספר שניות כדי לאפשר להשעיית התא לזרום דרך הערוץ לפני זריעת החצי הנותר של ההשעיה של התא בבאר התחתונה, כפי שהודגם קודם לכן עבור ציפוי NPC. לאחר מכן למלא את שתי בארות זרע MAB טרי עם מדיום צמיחה נוסף דגירה שוב כפי שהוכח.כדי ליזום את טקטיקת הכימותרפיה ואת שיפוע נפח ביום ה -21 של בידול הנוירון המוטורי, להוסיף 200 microliters לכל באר של נוירון מוטורי בינוני עצבי המכיל גורמי גדילה לתא Myotube, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters לכל באר של מדיום בסיס נוירון מוטורי ללא גורמי גדילה לתא הנוירון המוטורי. חשוב להעריך את פוטנציאל הבידול של קווי התא לפני שיתוף פולחן אותם במכשירים microfluidic. מדד ההיתוך של MABs נקבע, וכ-8% הוערך כמספיק לתרבות משותפת.תרביות הנוירונים המוטוריים שנוצרו היו 85 עד 95% חיוביות עבור סמני נוירונים מוטוריים. לאפיון וכימות כמות הצמתים הנוירו-שריריים או NMJs, מספר ההקלות המשותפות בין הנוירון המוטורי לסמנים טרום-סינפטיים שרשרת כבדה של נוירופילמנט וסינפטופיסין וסמן קולטן אצטילן פוסט-סינפטי אלפא בנגרוטוקסין, נספר דרך כל מחסנית מחלה ונורמל במספר שרשרת כבדה מיוזין שכותרתה מיוטיובים הנמצאים בערימת Z. NMJs הופיע כנקודת מגע אחת NMJs שבו neurite נגע אשכול של קולטן כולין עדין בנקודת אינטראקציה אחת.או כנקודת מגע מרובה NMJs שבו נויריט התפרס ועסק עם אשכול קולטן כולין עדין על פני משטח גדול יותר. כימות של אחוז הנוירון המוטורי המחדש Myotubes הצביע על כך שלא כל Myotubes הכיל NMJs. עם הפעלת נוירון מוטורי עם אשלגן כלורי, זרם סידן נצפה ב- Fluo-4 שכותרתו Myotubes, אשר אישר חיבור פונקציונלי באמצעות נוירון מוטורי neurite ב Myotube, התוספת של חוסם NMJ d-טובוקרין, או DTC לתא Myotube הביא עיכוב של זרם סידן.כדי לקבל את ההצלחה הגדולה ביותר עם דגם זה חשוב מאוד לבצע בדיקת איכות קו התא כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בערוצים של המכשיר. שילוב הצומת neuromuscular בצלחת עם סוגי תאים ישירים IPC אחרים מחקה אפילו טוב יותר את מצב במבחנה, זה גם מאפשר ללמוד את התפקיד של סוגי תאים אלה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

בידוד פונקציונלי של יחידות מנוע יחיד של שריר גסטרו-קסטרונומיוס חולדה

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...