Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

लेखकों ने लिमोन से निक्की कॉर्थआउट और सेबेस्टियन मुंक, रिसर्च ग्रुप मॉलिक्यूलर न्यूरोबायोलॉजी (VIB-KU Leuven) को लाइव-सेल कैल्शियम क्षणिक प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग पर उनकी सलाह के लिए धन्यवाद दिया। इस शोध को बेल्जियम और लक्समबर्ग, केयू ल्यूवेन (सी 1 और "ओपनिंग द फ्यूचर" फंड) के लिए फुलब्राइट कमीशन द्वारा समर्थित किया गया था, वीआईबी, विज्ञान और प्रौद्योगिकी द्वारा नवाचार के लिए एजेंसी (आईडब्ल्यूटी); SBO-iPSCAF), "वैज्ञानिक अनुसंधान फ़्लैंडर्स के लिए फंड" (FWO-Vlaanderen), लक्ष्य ALS, ALS लिगा बेल्जियम (ALS के लिए एक इलाज), बेल्जियम सरकार (Interuniversity आकर्षण डंडे कार्यक्रम P7/16 बेल्जियम संघीय विज्ञान नीति कार्यालय द्वारा शुरू), Thierry Latran फाउंडेशन और "एसोसिएशन Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM)। T.V. और J.B. FWO-Vlaanderen द्वारा सम्मानित पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं।

L.V.D.B के पास Charcot-Marie-Tooth रोग (US-2013227717-A1) में एचडीएसी अवरोधकों के उपयोग पर पेटेंट है, जो ऑगस्टीन थेरेप्यूटिक्स के वैज्ञानिक सह-संस्थापक हैं, और इसके वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के सदस्य हैं। अन्य लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत आसान-से-उपयोग विधि का वर्णन करता है, जो 30 दिनों से भी कम समय में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक एनएमजे के साथ मानव मोटर इकाइयों को उत्पन्न करता है। यह वर्णन किया गया है कि कैसे NMJs को आईसीसी और SEM जैसी मानक तकनीकों के माध्यम से रूपात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है और लाइव-सेल कैल्शियम रिकॉर्डिंग के माध्यम से कार्यात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का एक बड़ा लाभ स्टेम सेल तकनीक का उपयोग है। यह पूर्ण अनुकूलन क्षमता के लिए अनुमति देता है जिसमें एनएमजे का मूल्यांकन स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में किया जा सकता है, स्वतंत्र रूप से दाता प्रोफ़ाइल से। मॉडल पहले से ही एएलएस अनुसंधान में सफल और फायदेमंद साबित हुआ है, जहां हमने एफयूएस जीन 18 में उत्परिवर्तन के कारण उपन्यास फेनोटाइप के रूप में न्यूराइट आउटग्रोथ, रीग्रोथ और एनएमजे नंबरों में हानि की पहचान की है। इस मॉडल के साथ, एएलएस के छिटपुट रूपों को शामिल करने के लिए अनुसंधान का विस्तार करना संभव है, जहां एटियलजि अज्ञात है, छिटपुट एएलएस रोगियों से आईपीएससी का उपयोग करके। यह पारंपरिक पशु मॉडल पर एक लाभ प्रदान करता है, जो मानव रोग 23,24 को दोहराने के लिए उत्परिवर्तित जीन के ट्रांसजेनिक ओवरएक्सप्रेशन पर भरोसा करता है। इसके अलावा, हमारी पूरी तरह से मानव प्रणाली मानव-विशिष्ट शरीर विज्ञान और बीमारी के संभावित पुनरावृत्ति के लिए अनुमति देती है। पिछले अध्ययनों ने कृंतक और मानव एनएमजे आकृति विज्ञान 25 के बीच के अंतर का प्रदर्शन किया, जो बताता है कि मानव एनएमजे पैथोलॉजी को संबोधित करने के लिए कृन्तकों का उपयोग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। यद्यपि यह प्रणाली एक सापेक्ष सरल इन विट्रो सेटअप है, जिसमें इन विवो मॉडल की जटिलता का अभाव है, यह प्रदर्शित करना संभव था कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में प्रदर्शित एनएमजे आकृति विज्ञान मानव विच्छेदन 25 के एनएमजे जैसा दिखता है। इसके अलावा, यह मॉडल एनएमजे गठन और परिपक्वता के दौरान एनएमजे मूल्यांकन की अनुमति देता है, संभावित रूप से प्रारंभिक रोग फेनोटाइप का खुलासा करता है, जो मानव पोस्टमार्टम नमूनों में अनुपस्थित, अज्ञात या अनदेखी करते हैं।
एमएबी मायोट्यूब उत्पन्न करने के लिए एक वैध विकल्प प्रदान करते हैं, हालांकि 10 दिनों का उनका सीमित अस्तित्व सिस्टम का नुकसान है। मायोट्यूब अस्तित्व सतह के प्रति उनके लगाव पर निर्भर करता है, जो संभवतः मायोफाइबर के सहज संकुचन से समझौता किया जाता है। 10 से अधिक दिनों के बाद, अधिकांश मायोट्यूब अलग हो जाएंगे, एनएमजे संस्कृति को अनुपयोगी बना देंगे। आदर्श रूप से, मायोट्यूब को आईपीएससी से भी उत्पन्न किया जाएगा। हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल संलयन सूचकांक 27,28,29,30 में परिवर्तनशीलता के कारण 26 को पुन: पेश करना मुश्किल साबित हुआ है।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके, हमने एक मानकीकृत प्रणाली उत्पन्न की, जो पूरी तरह से सुलभ है। अन्य NMJ मॉडल मौजूद हैं31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. हालांकि, वे आमतौर पर एकल डिब्बों पर भरोसा करते हैं, जिसमें सेल प्रकारों के बीच या कस्टम-निर्मित संस्कृति जहाजों के बीच कंपार्टमेंटलाइजेशन और तरल पदार्थ अलगाव की कमी होती है, जो उपलब्धता को कम करता है और संभावित रूप से पुनरुत्पादकता भी। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को विभिन्न लंबाई के माइक्रोग्रूव्स के साथ खरीदा जा सकता है, जो आगे के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जैसे कि चेताक्षीय परिवहन 43,44 या एक्सोटॉमी 18,45,46 जांच। डिब्बों के बीच तरल पदार्थ अलगाव आगे मोटर न्यूरॉन्स या मायोट्यूब के कंपार्टमेंटलाइज्ड ड्रग उपचार को सक्षम बनाता है, जो चिकित्सा विकास में अनुकूल हो सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स में विशेषज्ञता रखने वाली अधिक कंपनियां उभरी हैं, जो डिवाइस डिजाइन और सुविधाओं के बड़े चयन के लिए खुल गई हैं, आगे इन विट्रो अनुसंधान के लिए पहुंच को बढ़ावा देती हैं।
अंत में, हमने कार्यात्मक NMJs के साथ मानव मोटर इकाइयों को संस्कृति करने के लिए एक विश्वसनीय, बहुमुखी और आसान विधि प्रदान करने वाला एक प्रोटोकॉल विकसित किया है।

NMJs न्यूरोट्रांसमीटर 1 की रिहाई के माध्यम से कम रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल की मांसपेशी तंतुओं के बीच संचार की सुविधा प्रदान करते हैं। एएलएस और एसएमए जैसे मोटर न्यूरॉन विकारों में, एनएमजे पतित हो जाते हैं, जो मांसपेशियों के साथ संचार में व्यवधान पैदा करता है2,3,4,5,6,7। इसके परिणामस्वरूप रोगियों ने धीरे-धीरे अपनी मांसपेशियों के कार्य को खो दिया, जिससे उन्हें व्हीलचेयर-बाध्य होना पड़ता है और अंततः डायाफ्राम जैसे महत्वपूर्ण मांसपेशी समूहों के प्रगतिशील शोष के कारण श्वसन जीवन-समर्थन पर निर्भर होता है। इन विकारों में एनएमजे के इस गहन नुकसान के लिए जिम्मेदार सटीक अंतर्निहित तंत्र अज्ञात हैं। ट्रांसजेनिक पशु मॉडल पर कई अध्ययन किए गए हैं, जिसने हमें एनएमजे अध: पतन 5,6,8,9,10,11 के रोगजनन में कुछ अंतर्दृष्टि दी है। हालांकि, पैथोलॉजी को पूरी तरह से समझने और denervation का मुकाबला करने के लिए, एक मानव प्रणाली होना महत्वपूर्ण है, जो पूर्ण पहुंच की अनुमति देता है।
यहां, प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके hiPSC-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और मानव प्राथमिक MAB-व्युत्पन्न मायोट्यूब के सह-संवर्धन के माध्यम से मानव NMJs उत्पन्न करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तरीके का वर्णन करता है। न्यूरॉन्स के सोमा और अक्षतंतुओं को ध्रुवीकृत और तरल रूप से अलग करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग 1970 के दशक के अंत में 'कैम्पेनॉट' कक्षों 12 के पहले विवरण के बाद से जाना जाता है। तब से, वाणिज्यिक विकल्पों सहित अधिक माइक्रोफ्लुइडिक डिजाइन बनाए गए हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों में दो डिब्बे होते हैं, और प्रत्येक डिब्बे में एक चैनल 13 से जुड़े दो कुएं होते हैं। दो डिब्बों को प्रतिबिंबित किया जाता है और कई माइक्रोग्रूव के साथ जोड़ा जाता है। इन माइक्रोग्रूव्स का एक आकार होता है जो एक केशिका हाइड्रोस्टेटिक दबाव 13,14 के माध्यम से दो डिब्बों के बीच तरल अलगाव को बनाए रखते हुए न्यूराइट विकास की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रणाली का उपयोग करके, एक डिब्बे में मोटर न्यूरॉन्स और दूसरे में मांसपेशियों की कोशिकाओं को संस्कृति करना संभव है, प्रत्येक अपने विशिष्ट संस्कृति माध्यम में, जबकि अभी भी माइक्रोग्रूव्स से गुजरने वाले न्यूराइट्स के माध्यम से एक शारीरिक संबंध की सुविधा प्रदान करता है और मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ संलग्न होता है। यह मॉडल मानव मोटर इकाई की एक पूरी तरह से सुलभ और अनुकूलनीय इन विट्रो सिस्टम प्रदान करता है, जिसका उपयोग एएलएस और एसएमए जैसी बीमारियों में प्रारंभिक एनएमजे पैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (NMJs) कम मोटर न्यूरॉन के अक्षतंतु और मांसपेशियों के संकुचन की सगाई की सुविधा प्रदान करने वाली मांसपेशियों के बीच विशेष synapses हैं। मोटर न्यूरॉन विकारों में, जैसे कि एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) और स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए), एनएमजे पतित हो जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों में शोष और प्रगतिशील पक्षाघात होता है। एनएमजे अध: पतन का अंतर्निहित तंत्र अज्ञात है, मोटे तौर पर अनुवाद योग्य अनुसंधान मॉडल की कमी के कारण। इस अध्ययन का उद्देश्य कार्यात्मक NMJs के साथ एक मानव मोटर इकाई के विट्रो मॉडल में एक बहुमुखी और पुनरुत्पादक बनाना था। इसलिए, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSC) - व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स और मानव प्राथमिक मेसोएंजियोब्लास्ट (एमएबी) - व्युत्पन्न मायोट्यूब को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सह-सुसंस्कृत किया गया था। तरल रूप से अलग-थलग माइक्रो-डिब्बों का उपयोग सेल-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट के रखरखाव के लिए अनुमति देता है, जबकि माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से सेल-टू-सेल संपर्क की अनुमति देता है। एक कीमोटैक्टिक और वॉल्यूमेट्रिक ग्रेडिएंट को लागू करके, मायोट्यूब इंटरैक्शन को बढ़ावा देने वाले माइक्रोग्रूव्स के माध्यम से मोटर न्यूरॉन-न्यूराइट्स के विकास और एनएमजे के गठन को उत्तेजित किया गया था। इन NMJs को मोटर न्यूरॉन presynaptic मार्कर synaptophysin (SYP) और पोस्टसिनेप्टिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर (ACHR) मार्कर α-bungarotoxin (Btx) के सह-स्थानीयकरण के माध्यम से immunocytochemically की पहचान की गई थी मायोट्यूब पर और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करके रूपात्मक रूप से विशेषता थी। NMJs की कार्यक्षमता मोटर न्यूरॉन्स के विध्रुवीकरण पर मायोट्यूब में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने के द्वारा पुष्टि की गई थी। मानक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों और स्टेम सेल प्रौद्योगिकी का उपयोग करके उत्पन्न मोटर इकाई स्वास्थ्य और बीमारी में एनएमजे पर ध्यान केंद्रित करने वाले भविष्य के शोध में सहायता कर सकती है।

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

हम मानव प्राथमिक मेसोएंजियोब्लास्ट-व्युत्पन्न मायोट्यूब के साथ मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स को सह-संवर्धित करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मानव मोटर इकाइयों को उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक रूप से सक्रिय न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का गठन होता है।

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के साथ मानव मोटर इकाइयों का उत्पादन

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Microfluidic सह संस्कृति उपकरणों का प्रयोग करना टूथ रोगाणु INNERVATION विकास का विश्लेषण

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We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

सिस्टिक तंत्रिका क्रश चोट के चूहे मॉडल में कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए 3 डी काइनेमेटिक विश्लेषण

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

त्रि-आयामी मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड जनरेशन

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

चूहा मध्य मीडिया गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी की एकल मोटर इकाइयों का कार्यात्मक अलगाव

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के इम्यूनोफ्लोरेटेंट और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एकल कंकाल मांसपेशी फाइबर का विच्छेदन

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...