Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Gli autori ringraziano Nikky Corthout e Sebastian Munck di LiMoNe, Research Group Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) per i loro consigli sulle registrazioni di fluorescenza transitoria del calcio a cellule vive. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Commissione Fulbright in Belgio e Lussemburgo, KU Leuven (C1 e Fondo "Opening the Future"), VIB, l'Agenzia per l'innovazione per la scienza e la tecnologia (IWT; SBO-iPSCAF), il "Fondo per la ricerca scientifica nelle Fiandre" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, la ALS Liga België (Una cura per la SLA), il governo belga (Programma interuniversitario dei poli di attrazione P7/16 avviato dall'Ufficio federale belga per la politica scientifica), la Fondazione Thierry Latran e l'"Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. e J.B. sono supportati da borse di dottorato assegnate da FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. ha un brevetto sull'uso di inibitori HDAC nella malattia di Charcot-Marie-Tooth (US-2013227717-A1), è co-fondatore scientifico di Augustine Therapeutics e membro del suo comitato consultivo scientifico. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Il protocollo descrive un metodo relativamente facile da usare, che genera unità motorie umane con NMJ funzionali in dispositivi microfluidici disponibili in commercio in meno di 30 giorni. Viene descritto come gli NMJ possono essere valutati morfologicamente attraverso tecniche standard come ICC e SEM e funzionalmente attraverso registrazioni di calcio a cellule vive.
Un grande vantaggio di questo protocollo è l'uso della tecnologia delle cellule staminali. Ciò consente una piena adattabilità in cui gli NMJ possono essere valutati sia in salute che in malattia, indipendentemente dal profilo del donatore. Il modello si è già dimostrato efficace e utile nella ricerca sulla SLA, dove abbiamo identificato le menomazioni nella crescita dei neuriti, nella ricrescita e nei numeri NMJ come nuovi fenotipi dovuti a mutazioni nel gene FUS18. Con questo modello, è possibile espandere la ricerca per includere forme sporadiche di SLA, in cui l'eziologia è sconosciuta, utilizzando iPSC da pazienti sporadici con SLA. Ciò fornisce un vantaggio rispetto ai modelli animali tradizionali, che si basano sulla sovraespressione transgenica di geni mutati per ricapitolare la malattia umana23,24. Inoltre, il nostro sistema completamente umano consente una potenziale ricapitolazione della fisiologia e della malattia specifiche dell'uomo. Studi precedenti hanno dimostrato le differenze tra la morfologia NMJ del roditore e umana25, il che suggerisce che è necessario prestare attenzione quando si utilizzano roditori per affrontare la patologia NMJ umana. Sebbene questo sistema sia una configurazione in vitro relativamente semplice, che manca della complessità di un modello in vivo, è stato possibile dimostrare che la morfologia NMJ visualizzata nei dispositivi microfluidici assomigliava a NMJ di amputati umani25. Inoltre, questo modello consente la valutazione NMJ durante la formazione e la maturazione di NMJ, rivelando potenzialmente fenotipi di malattia precoci, che sono assenti, non identificabili o trascurati nei campioni umani post-mortem.
I MAB forniscono una valida opzione per generare miotubi, sebbene la loro limitata sopravvivenza di 10 giorni sia uno svantaggio del sistema. La sopravvivenza del miotubo si basa sul loro attaccamento alla superficie, che è probabilmente compromesso da contrazioni spontanee delle miofibre. Dopo più di 10 giorni, la maggior parte dei miotubi si sarà staccata, rendendo inutilizzabile la cultura NMJ. Idealmente, i miotubi sarebbero generati anche da iPSC. Tuttavia, i protocolli attuali si sono dimostrati difficili da riprodurre26 a causa della variabilità dell'indice di fusione27,28,29,30.
Utilizzando dispositivi microfluidici disponibili in commercio, abbiamo generato un sistema standardizzato, che è completamente accessibile. Esistono altri modelli NMJ31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Tuttavia, in genere si basano su singoli compartimenti, che mancano della compartimentazione e dell'isolamento fluidico tra i tipi di cellule, o su vasi di coltura su misura, il che riduce la disponibilità e potenzialmente anche la riproducibilità. I dispositivi microfluidici utilizzati per questo protocollo possono essere acquistati con microgroovi di varie lunghezze, che consentono ulteriori analisi come il trasporto assonale43,44 o l'assotomia18,45,46 indagini. L'isolamento fluidico tra i compartimenti consente inoltre il trattamento farmacologico compartimentato di motoneuroni o miotubi, che può essere favorevole nello sviluppo della terapia. Sono emerse altre aziende specializzate in microfluidica, che si sono aperte a un'ampia selezione di design e funzionalità dei dispositivi, promuovendo ulteriormente l'accessibilità per la ricerca in vitro.
In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo che fornisce un metodo affidabile, versatile e facile per coltivare unità motorie umane con NMJ funzionali.

Gli NMJ facilitano la comunicazione tra i motoneuroni spinali inferiori e le fibre muscolari scheletriche attraverso il rilascio di neurotrasmettitori1. Nei disturbi del motoneurone come la SLA e la SMA, gli NMJ degenerano, causando un'interruzione della comunicazione con i muscoli2,3,4,5,6,7. Ciò si traduce in pazienti che perdono gradualmente la loro funzione muscolare, il che li fa essere legati alla sedia a rotelle e alla fine dipendenti dal supporto vitale respiratorio a causa della progressiva atrofia dei gruppi muscolari vitali come il diaframma. Gli esatti meccanismi sottostanti responsabili di questa profonda perdita di NMJ in questi disturbi sono sconosciuti. Molti studi sono stati condotti su modelli animali transgenici, che ci hanno dato alcune informazioni sulla patogenesi della degenerazione NMJ5,6,8,9,10,11. Tuttavia, per comprendere appieno la patologia e contrastare la denervazione, è importante avere un sistema umano, che consenta la piena accessibilità.
Qui, il protocollo descrive un modo relativamente semplice per generare NMJ umani attraverso la co-coltura di motoneuroni derivati da hiPSC e miotubi primari umani derivati da MAB utilizzando dispositivi microfluidici disponibili in commercio. L'uso della microfluidica per polarizzare e isolare fluidicamente i somi e gli assoni dei neuroni è noto sin dalla prima descrizione delle camere "Campenot"12 alla fine del 1970. Da allora, sono stati fabbricati più progetti microfluidici, comprese le opzioni commerciali. I dispositivi utilizzati in questo protocollo contengono due scomparti e ogni compartimento è costituito da due pozzi collegati con un canale13. I due scomparti sono specchiati e collegati con diversi microsalchi. Questi microsacchiotti hanno una dimensione che facilita la crescita dei neuriti mantenendo l'isolamento fluidico tra i due compartimenti attraverso una pressione idrostatica capillare13,14. Utilizzando questo sistema, è possibile coltivare motoneuroni in un compartimento e cellule muscolari nell'altro, ciascuno nel proprio specifico terreno di coltura, pur facilitando una connessione fisica attraverso i neuriti che passano attraverso i microsonda e si impegnano con le cellule muscolari. Questo modello fornisce un sistema in vitro completamente accessibile e adattabile di un'unità motoria umana, che può essere utilizzato per studiare la patologia NMJ precoce in malattie come la SLA e la SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Le giunzioni neuromuscolari (NMJ) sono sinapsi specializzate tra l'assone del motoneurone inferiore e il muscolo che facilitano l'impegno della contrazione muscolare. Nei disturbi del motoneurone, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e l'atrofia muscolare spinale (SMA), gli NMJ degenerano, con conseguente atrofia muscolare e paralisi progressiva. Il meccanismo alla base della degenerazione NMJ è sconosciuto, in gran parte a causa della mancanza di modelli di ricerca traducibili. Questo studio mirava a creare un modello in vitro versatile e riproducibile di un'unità motoria umana con NMJ funzionali. Pertanto, i motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e i miotubi derivati dal mesoangioblasto primario umano (MAB) sono stati co-coltivati in dispositivi microfluidici disponibili in commercio. L'uso di microcomparti fluidicamente isolati consente il mantenimento di microambienti specifici per cellula, consentendo al contempo il contatto cellula-cellula attraverso microsopracci. Applicando un gradiente chemiotattico e volumetrico, è stata stimolata la crescita dei motoneuroni-neuriti attraverso i microsopravati che promuovono l'interazione miotubica e la formazione di NMJ. Questi NMJ sono stati identificati immunocitochimicamente attraverso la co-localizzazione del marcatore presinaptico del motoneurone sinaptofisina (SYP) e del marcatore del recettore postsinaptico dell'acetilcolina (AChR) α-bungarotossina (Btx) sui miotubi e caratterizzati morfologicamente utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). La funzionalità degli NMJ è stata confermata misurando le risposte al calcio nei miotubi dopo la depolarizzazione dei motoneuroni. L'unità motoria generata utilizzando dispositivi microfluidici standard e la tecnologia delle cellule staminali può aiutare la ricerca futura incentrata sugli NMJ in salute e malattia.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Descriviamo un metodo per generare unità motorie umane in dispositivi microfluidici disponibili in commercio co-coltivando motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane con miotubi primari derivati da mesoangioblasti umani con conseguente formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive.

Generazione di unità motorie umane con giunzioni neuromuscolari funzionali in dispositivi microfluidici

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Questo metodo relativamente semplice può aiutare la ricerca concentrandosi sui motoneuroni e sulle giunzioni neuromuscolari nella salute e nella malattia. Questo protocollo utilizza la tecnologia standard delle cellule staminali e dispositivi microfluidici disponibili in commercio che aumentano la riproducibilità. La disconnessione dei motoneuroni e delle cellule muscolari è un fenomeno precoce in diverse malattie neuromuscolari.Un semplice modello umanizzato potrebbe aiutare a sviluppare strategie per contrastare questo fenomeno. Usiamo questo modello per studiare il disturbo del motoneurone, la sclerosi laterale amiotrofica, tuttavia, questo modello può essere utilizzato anche per altri disturbi in cui l'unità motoria è essenziale. Inizia trasferendo il dispositivo utilizzando la pinza dal contenitore di spedizione alla capsula di Petri contenente 10 millilitri di etanolo dal 70% al 100% per la sterilizzazione per 10 secondi.Trasferire il dispositivo con pinza su un pezzo di carta per asciugare all'aria nel flusso laminare per circa 30 minuti. Una volta che un dispositivo è stato asciugato, utilizzare una pinza per spostare ogni dispositivo su una singola capsula di Petri di 10 centimetri. Per rivestire il dispositivo con Poly-L-ornitina o PLO, aggiungere 100 microlitri di soluzione PLO al pozzo superiore e osservare il fluido che passa dal pozzo superiore attraverso il canale al pozzo inferiore.Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione PLO al pozzetto inferiore e ripetere sull'altro lato delle micro scanalature. Completa aggiungendo 100 microlitri di soluzione PLO su un lato per creare un gradiente di volume tra i due lati specchiati del dispositivo per rivestire le micro scanalature. Incubare per tre ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo tre ore, lavare il dispositivo tre volte per cinque minuti con DPBS. Rivestire il dispositivo con 20 microgrammi per millilitro laminina e mezzo neurobasale seguendo la procedura simile al rivestimento PLO. Incubare il dispositivo durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il giorno seguente utilizzare una pipetta da 200 microlitri e posizionare la punta nel pozzetto opposto all'apertura del canale per rimuovere il rivestimento laminina dai pozzetti. Dopo aver aggiunto DPBS a tutti i pozzetti, lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a temperatura ambiente per la semina cellulare. Tagliare i fogli SCM alle dimensioni del dispositivo lasciando alcuni millimetri su ciascun lato.Dopo aver sterilizzato i dispositivi e i fogli SCM in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di etanolo dal 70% al 100% per 10 secondi, trasferire i dispositivi con pinza su una piastra a sei pozzetti e i fogli SCM su una capsula di Petri di 10 centimetri per l'essiccazione all'aria nel flusso laminare. Posizionare il dispositivo sul bordo per consentire a tutti i lati di asciugarsi per circa 30 minuti. Rivestire i dispositivi aggiungendo un millilitro di soluzione PLO per pozzetto a ciascun dispositivo nella piastra a sei pozzetti.Assicurarsi che il dispositivo galleggi sulla parte superiore della soluzione PLO con il canale e il lato micro scanalatura rivolti verso il basso nel liquido. Rivestire i fogli SCM aggiungendo 10 millilitri di soluzione PLO alla capsula di Petri da 10 centimetri e utilizzare la pinza per spingere verso il basso i fogli SCM nel liquido. Incubare dispositivi e fogli SCM per tre ore come dimostrato in precedenza.Dopo tre ore, lavare i dispositivi e i fogli SCM due volte per cinque minuti con DPBS seguito da un altro lavaggio per cinque minuti con acqua sterile. Quindi trasferire ogni foglio SCM su una singola capsula di Petri da 10 centimetri per asciugare all'aria. Mentre si lavora al microscopio nel flusso laminare, utilizzare una pinza per montare il dispositivo in silicone con il canale e la micro scanalatura rivolti verso il basso con un angolo di 90 gradi sul foglio SCM assicurando che tutti i lati siano allineati.Premere leggermente verso il basso sul dispositivo per assicurarsi di sigillare non solo i bordi esterni, ma anche intorno a pozzetti, canali e micro scanalature. Per rivestire il dispositivo con laminina, all'interno del flusso laminare e al microscopio, aggiungere 100 microlitri di 20 microgrammi per millilitro di soluzione di laminina nel pozzo superiore utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Osservare il fluido che passa dal pozzo superiore attraverso il canale al pozzo inferiore senza alcuna perdita intorno al pozzo e al canale.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione di laminina sul pozzetto inferiore, ripetere sull'altro lato delle micro scanalature e finire con ulteriori 100 microlitri di laminina su un lato per creare un gradiente di volume tra i due lati specchiati del dispositivo per rivestire le micro scanalature, quindi incubare il dispositivo durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere il rivestimento dai pozzetti con la pipetta da 200 microlitri posizionando la punta nel pozzo opposto all'apertura del canale, dopo aver aggiunto DPBS a tutti i pozzetti, lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a temperatura ambiente per la semina cellulare. Per placcare le cellule progenitrici neurali o gli NPC nel dispositivo microfluidico, rimuovere DPBS da due pozzetti su un lato delle micro scanalature nel dispositivo utilizzando una pipetta da 200 microlitri.Per seminare un totale di 250.000 NPC e da 60 a 100 microlitri del mezzo motoneurone del giorno 10 per dispositivo, nel pozzo in alto a destra, seminare metà della sospensione cellulare vicino all'apertura del canale con un angolo di 45 gradi. Sospendere per alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di aggiungere la metà rimanente della sospensione cellulare nel pozzetto inferiore. Utilizzare una penna per contrassegnare il lato seminato come NPC o equivalente, per un facile orientamento del dispositivo senza microscopio, e incubare per cinque minuti per il fissaggio cellulare.Quindi, rabboccare lentamente i due pozzetti seminati NPC con un ulteriore mezzo motoneurone del giorno 10 per un volume totale di 200 microlitri per pozzetto. Usando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere DPBS dai due pozzetti dall'altra parte delle micro scanalature opposte agli NPC appena seminati. Aggiungere 200 microlitri del giorno 10 media di motoneuroni per pozzetto ai pozzetti non seminati.Quindi aggiungere sei millilitri di DPBS per piatto da 10 centimetri attorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del mezzo durante l'incubazione. Per cambiare il mezzo, rimuovere lentamente i supporti in entrambi i pozzetti con NPC posizionando la punta della pipetta da 200 microlitri sul bordo inferiore della parete del pozzo di fronte all'apertura del canale. Per evitare che un forte flusso medio danneggi le cellule sul canale, aggiungere lentamente da 50 a 100 microlitri di mezzo motoneurone fresco a ciascun pozzetto cambiando continuamente tra il pozzetto superiore e inferiore.Ripetere il processo fino a quando ogni pozzetto contiene 200 microlitri di mezzo. Il giorno 17 della differenziazione del motoneurone, rimuovere il mezzo del motoneurone sul lato non seminato delle micro scanalature nel dispositivo con una pipetta da 200 microlitri e lavare i pozzetti con DPBS. Semina un totale di 200.000 mesoangioblasti primari umani o MAB, in 60-100 microlitri di terreno di coltura per dispositivo seminando metà della sospensione cellulare nel pozzo superiore.Pausa di alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di seminare la metà rimanente della sospensione cellulare nel pozzetto inferiore, come dimostrato in precedenza per la placcatura degli NPC. Incubare il dispositivo per cinque minuti per il fissaggio cellulare. Quindi rabboccare i due pozzetti appena seminati MAB con un mezzo di crescita aggiuntivo e incubare di nuovo come dimostrato.Per iniziare la tattica della chemio e il gradiente volumetrico il 21 ° giorno della differenziazione del motoneurone, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di mezzo neurobasale del motoneurone contenente fattori di crescita al compartimento del miotubo, quindi aggiungere 100 microlitri per pozzetto di mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita al compartimento del motoneurone. È importante valutare il potenziale di differenziazione delle linee cellulari prima di co-coltivarle in dispositivi microfluidici. È stato determinato l'indice di fusione dei MAB e circa l'8% è stato stimato sufficiente per la co-coltura.Le colture di motoneuroni generate erano positive dall'85 al 95% per i marcatori del motoneurone. Per caratterizzare e quantificare la quantità di giunzioni neuromuscolari o NMJ, il numero di co-localizzazioni tra il motoneurone e i marcatori pre-sinaptici a catena pesante del neurofilamento e sinaptofisina e marcatore del recettore dell'acetilene postsina alfa bungarotossina, è stato contato attraverso ogni pila di malattie ed è stato normalizzato in un numero di Myotubes marcati a catena pesante di miosina presenti nello stack Z. Gli NMJ sono apparsi come NMJ a punto di contatto singolo in cui il neurite ha toccato un gruppo di un sottile recettore della colina in un punto di interazione.O come NMJ a punto di contatto multiplo in cui un neurite si è sfogato e si è impegnato con un sottile cluster di recettori della colina su una superficie più ampia. La quantificazione della percentuale di Myotubes innovati dai motoneuroni ha indicato che non tutti i miotubi contenevano NMJ. Dopo l'attivazione del motoneurone con cloruro di potassio, l'afflusso di calcio è stato osservato nei myotubi marcati Fluo-4, che hanno confermato una connessione funzionale attraverso il neurite del motoneurone nel miotubo, l'aggiunta del bloccante NMJ d-tubocurarina, o DTC al compartimento del miotubo ha provocato un'inibizione dell'afflusso di calcio.Per avere il maggior successo con questo modello è incredibilmente importante eseguire un controllo di qualità della linea cellulare ed evitare la formazione di bolle d'aria nei canali del dispositivo. Combinando la giunzione neuromuscolare in un piatto con altri tipi di cellule dirette IPC imita ancora meglio la situazione in vitro, questo permette anche di studiare il ruolo di questi tipi di cellule.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Ricerca

Neuroscienze

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Il nervo del perone Metodo Injury: Un test affidabile di individuare e testare i fattori che Repair neuromuscolari giunzioni

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Isolamento funzionale di unità motorie singole del muscolo gastrocnomio mediale del ratto

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...