Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

著者らは、LiMoNeのニッキー・コルトゥートとセバスチャン・マンク、研究グループ分子神経生物学(VIB-KUルーヴェン)に、生細胞カルシウム一過性蛍光記録に関するアドバイスに感謝する。この研究は、ベルギーとルクセンブルクのフルブライト委員会、KUルーヴェン(C1と「未来を開く」基金)、VIB、科学技術イノベーション庁(IWT)によって支援されました。SBO-iPSCAF)、「科学研究フランダース基金」(FWO-ヴラアンドレレン)、ターゲットALS、ALSリーガルギア(ALSの治療法)、ベルギー政府(ベルギー連邦科学政策局が開始した大学間アトラクションポールプログラムP7/16)、ティエリー・ラトラン財団、および「協会ベルジュ・コントレス・レ・マジェ・ニューカル・ムスル(AB)」T.V.とJ.Bは、FWO-ヴランドヘレンによって授与された博士号フェローシップによってサポートされています。

L.V.D..Bは、シャルコー・マリー・トゥース病(US-2013227717-A1)におけるHDAC阻害剤の使用に関する特許を取得しており、オーガスティン・セラピューティクスの科学的共同創設者であり、科学諮問委員会のメンバーです。他の著者は、競合する利益を宣言しません。

このプロトコルは、30日以内に市販のマイクロ流体デバイスで機能的なNmJを持つヒトモーターユニットを生成する比較的使いやすい方法を記述する。これは、NMJがICCおよびSEMなどの標準的な技術を通じて形態学的に評価され、生細胞カルシウム記録を通じて機能的にどのように評価することができるかを説明する。
このプロトコルの大きな利点は、幹細胞技術の使用です。これにより、ドナープロファイルとは無関係に、健康と病気の両方でNMJを評価できる完全な適応性が可能になります。このモデルはALS研究で既に成功し、有益であることが証明されており、FUS gene18の突然変異による新しい表現型として神経突起の成長、再成長、NMJの数の障害を同定しました。このモデルでは、病因が不明なALSの散発的な形態を、散発的なALS患者のiPSCを用いることで、研究を拡大することが可能である。これは、ヒト疾患を再現するために変異遺伝子のトランスジェニック過剰発現に依存する従来の動物モデルに対する利点を提供する23,24。さらに、当社の完全な人間のシステムは、人間固有の生理学や病気の潜在的な再現を可能にします。これまでの研究では、げっ歯類とヒトNMJ形態25の違いが示されており、げっ歯類を使用してヒトNMJ病理に対処する際には注意を払う必要があることを示唆しています。このシステムはインビボモデルの複雑さを欠く比較的単純なインビトロセットアップであるが、マイクロ流体デバイスに表示されるNMJ形態がヒト切断体25のNMJに似ていることを実証することが可能であった。さらに、このモデルは、NMJ形成および成熟中のNMJ評価を可能にし、ヒト死後のサンプルに存在しない、識別できない、または見落とされている初期の疾患の型を明らかにする可能性がある。
MABsは、10日の限られた生存期間はシステムの欠点であるが、myotubesを生成するための有効なオプションを提供する。筋管の生存は、筋線維の自発的な収縮によって損なわれる可能性が高い表面への愛着に依存している。10日を超えた後、ほとんどのミオチューブは切り離され、NMJ文化は使用できなくなります。理想的には、iPSCからもミオチューブが生成されます。しかし、現在のプロトコルは、融合指数27,28,29,30の変動により再現が困難であることが証明されています。
市販のマイクロ流体装置を用いることで、完全にアクセス可能な標準化システムを生成しました。その他のNMJモデルは31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42が存在する。しかし、通常、それらは、細胞タイプ間の区画化および流動性分離を欠く単一のコンパートメント、またはカスタムメイドの培養容器に依存しており、可用性を低下させ、再現性を低下させる可能性がある。このプロトコルに使用されるマイクロ流体装置は、軸索輸送43,44またはaxotomy18,45,46調査などのさらなる分析を可能にする、様々な長さのマイクログルーブで購入することができます。コンパートメント間の流体分離は、運動ニューロンまたはミオチューブのいずれかによる区分化薬物治療をさらに可能にし、治療の開発に有利であり得る。マイクロ流体を専門とする企業が増え、デバイスの設計と機能を豊富に選択し、インビトロ研究のアクセシビリティをさらに高めています。
結論として、我々は、機能的なNmJと人間のモーターユニットを培養する信頼性の高い、汎用性と簡単な方法を提供するプロトコルを開発しました。

NJSは、神経伝達物質1の放出を通じて、下部脊髄運動ニューロンと骨格筋線維との間のコミュニケーションを促進する。ALSやSMAのような運動ニューロン障害では、NmJは縮退し、筋肉とのコミュニケーションに混乱を引き起こす2、3、4、5、6、7。これは、患者が徐々に筋肉機能を失うことになり、車椅子に縛られ、最終的には横隔膜のような重要な筋肉群の進行性萎縮のために呼吸生命維持に依存する。これらの障害におけるこの深いNJの喪失の原因となる正確な根本的なメカニズムは不明である。トランスジェニック動物モデルに関する多くの研究が行われ、NMJ変性症の病因に関するいくつかの洞察が得られた5,6,8,9,10,11。しかし、病理を十分に理解し、脱性を打ち消すためには、完全なアクセシビリティを可能にする人間のシステムを持つことが重要です。
ここで、プロトコルは、市販のマイクロ流体デバイスを使用してhiPSC由来の運動ニューロンおよびヒト一次MAB由来ミオチューブの共培養を通じてヒトMJを生成する比較的簡単な方法を記述する。ニューロンのソマと軸索を偏光し、流動的に分離するためのマイクロ流体の使用は、1970年代後半の「カンペノン」室12の最初の記述以来知られている。それ以来、商業オプションを含む、より多くのマイクロ流体設計が製造されています。このプロトコルで使用されるデバイスは、2つのコンパートメントを含み、各コンパートメントは、channel13で接続された2つのウェルで構成されています。2つのコンパートメントはミラー化され、いくつかのマイクロ溝と接続されている。これらのマイクログルーブは毛管の静水圧13,14を通して2つのコンパートメント間の流体分離を維持しながら、神経突起成長を促進するサイズを有する。このシステムを使用すると、運動ニューロンを一方のコンパートメントで培養し、筋肉細胞を他の1つのコンパートメントで培養し、それぞれが特定の培養培地で培養し、マイクログルーブを通過して筋肉細胞と係合する神経突起を介した物理的な接続を促進することができる。このモデルはALSおよびSMAのような病気の初期NMJ病理学を研究するために使用することができる人間の運動単位の完全にアクセス可能で、適応可能なインビトロシステムを提供する。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

神経筋接合部 (NmJs) は、下の運動ニューロンの軸索と筋肉の収縮の関与を促進する筋肉の間の特殊なシナプスです。筋萎縮性側索硬化症(ALS)や脊髄筋萎縮症(SMA)などの運動ニューロン障害では、NMJが退化し、筋肉萎縮および進行性麻痺を生じる。NMJ変性の根本的なメカニズムは、主に翻訳可能な研究モデルの欠如のために不明である。本研究は、機能的なNJを搭載した人間のモーターユニットの汎用性と再現性のある インビトロ モデルを作成することを目的とした。そこで、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来の運動ニューロンとヒト一次メソアンジオ芽細胞(MAB)由来のミオチューブを、市販のマイクロ流体デバイスで共培養した。流動分離されたマイクロコンパートメントを使用することで、細胞特異的な微小環境の維持を可能にし、マイクログルーブを介して細胞間接触を可能にする。化学式および体積勾配を適用することにより、ミオチューブ相互作用を促進するマイクログルーブを介した運動ニューロン-神経ニューライトの成長およびNmJの形成が刺激された。これらのNJは、筋管内で運動ニューロンシナプス前マーカーシナプトフィシン(SYP)とポストナプティックアセチルコリン受容体(AChR)マーカー α-ブンガロトキシン(Btx)の共局在化を通じて免疫細胞化学的に同定され、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて形態学的に特徴付けられた。NJの機能性は、運動ニューロンの脱分極時にミオチューブ中のカルシウム応答を測定することによって確認された。標準的なマイクロ流体装置と幹細胞技術を用いて発生するモーターユニットは、健康と疾患のNmJに焦点を当てた将来の研究を支援することができます。

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

この比較的簡単な方法は、健康と病気の運動ニューロンと神経筋接合に焦点を当てた研究を助けることができます。.このプロトコルは、標準的な幹細胞技術と、再現性を高める市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。運動ニューロンと筋肉細胞の切断は、いくつかの神経筋疾患における初期の現象である。単純な人間化モデルは、この現象に対抗するための戦略を開発するのに役立つ可能性があります。このモデルは運動ニューロン障害、筋萎縮性側索硬化症を調べるのに使用しますが、このモデルは運動ユニットが不可欠な他の疾患にも使用できます。まず、輸送容器から70%の10ミリリットルから100%エタノールを含むペトリ皿に鉗子を使用してデバイスを10秒間殺菌します。鉗子を使った装置を紙に移し、層流で約30分間空気乾燥させます。デバイスを乾燥させたら、鉗子を使用して各デバイスを個々の10センチメートルのペトリ皿に移動させます。Poly-L-オルニチンまたはPLOでデバイスをコーティングするには、上部ウェルに100マイクロリットルのPLO溶液を加え、上部ウェルから下ウェルに流れる流体を観察します。次に、100マイクロリットルのPLO溶液を底ウェルに加え、マイクロ溝の反対側で繰り返します。1つの側に100マイクロリットルのPLO溶液を加えて、マイクロ溝をコーティングする装置の2つのミラー面の間にボリューム勾配を作成して終了します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で3時間インキュベートする。3時間後、DPBSで5分間デバイスを洗います。PLOコーティングと同様の手順に従って、1ミリリットルラミニンおよび神経基底培地あたり20マイクログラムでデバイスをコーティングします。37°Cと5%の二酸化炭素で一晩デバイスをインキュベートします。翌日は200マイクロリットルのピペットを使用し、先端をチャネル開口部とは正反対の位置に置き、井戸からラミニンコーティングを除去します。DPBSをすべてのウェルに添加した後、セルシードのための室温で層流にDPBSを持つデバイスを残します。SCMシートをデバイスのサイズに切り、両側に数ミリメートルを残します。70%から100%エタノールの10ミリリットルを含むペトリ皿のデバイスとSCMシートを10秒間殺菌した後、鉗子を6ウェルプレートに、SCMシートを10センチメートルのペトリ皿に移して、ラミナーフローで空気乾燥させます。側面を約30分間乾燥させるために、デバイスを端に置きます。6ウェルプレートの各デバイスに、井戸ごとに1ミリリットルのPLO溶液を加えてデバイスをコーティングします。デバイスが、チャネルとマイクロ溝側が液体に下向きのPLOソリューションの上に浮かんでいるかどうかを確認します。10センチメートルのペトリ皿に10ミリリットルのPLO溶液を加えてSCMシートをコーティングし、鉗子を使用してSCMシートを液体に押し込みます。前に示したように、デバイスとSCMシートを3時間インキュベートします。3時間後、デバイスとSCMシートをDPBSで5分間2回洗浄し、続いて滅菌水で5分間別の洗浄を行います。その後、各SCMシートを個々の10センチメートルのペトリ皿に移して空気乾燥させます。層流で顕微鏡で作業している間、鉗子を使用して、チャネルとマイクロ溝を90度の角度でSCMシートに取り付け、すべての側面が整列していることを確認します。デバイスを軽く押し下げて、外縁だけでなく、井戸、チャネル、マイクロ溝の周りも確実に密封します。ラミニンでデバイスをコーティングするには、ラミナーフローの内側と顕微鏡の下で、200マイクロリットルピペットを使用して、ラミニンの溶液あたり20マイクログラムの100マイクログラムを上部ウェルに追加します。上面から下まで流れる流体を、井戸とチャンネルの周りを漏らすことなくよく観察します。その後、100マイクロリットルのラミニン溶液を底ウェルに加え、マイクロ溝の反対側で繰り返し、片側にラミニンを100マイクロリットル追加して仕上げ、デバイスの2つのミラー側の間に体積勾配を作成してマイクロ溝をコーティングし、一晩デバイスをインキュベートします。翌日、200マイクロリットルのピペットでウェルからコーティングを取り除き、先端をチャネル開口部の反対側に配置し、DPBSを全てのウェルに加えた後、セルシード用の室温で層流にDPBSを付けた装置を残します。マイクロ流体装置内の神経前駆細胞またはNPCをプレートするには、200マイクロリットルピペットを使用して、デバイス内のマイクロ溝の片側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。1デバイスあたり合計250,000NPCと60〜100マイクロリットルの10〜100マイクロリットルの運動ニューロン媒体を播種するために、右上ウェルでは、45度の角度でチャネル開口部に近い細胞懸濁液の種子半分。数秒間一時停止して、セルの懸濁液がチャネルを流れ、残りの半分のセル懸濁液を下のウェルに加えます。ペンを使用して、シード面をNPCまたは同等の装置としてマークし、顕微鏡なしでデバイスを容易に向き、細胞の取り付けのために5分間インキュベートします。次に、2つのNPCシードウェルを追加の10日の運動ニューロン培地でゆっくりと上げ、井戸あたり200マイクロリットルの総容量を増やします。200マイクロリットルピペットを使用して、新たに播種されたNPCとは反対のマイクロ溝の反対側にある2つの井戸からDPBSを取り除きます。その後、インキュベーション中に媒体の蒸発を防ぐために、デバイスの周りに10センチメートル皿あたり6ミリリットルのDPBSを加えます。媒体を変更するには、チャネル開口部の反対側のウェルウォールの下端に200マイクロリットルのピペットチップを配置することによって、NPCを持つ両方のウェルのメディアをゆっくりと取り除きます。強い媒体の流れがチャネル上の細胞を損傷するのを防ぐために、上と下の間を絶えずよく変化させることによって、新鮮な運動ニューロン媒体の50〜100マイクロリットルを各ウェルにゆっくりと加える。各ウェルに200マイクロリットルの培地が含まれるまで、このプロセスを繰り返します。運動ニューロン分化の17日目に、200マイクロリットルピペットでマイクロ溝の未播の側の運動ニューロン培地を取り除き、DPBSでウェルを洗浄する。細胞懸濁液の半分を上部ウェルに播種することにより、1デバイスあたり60〜100マイクロリットルの成長培地で、合計200,000人のヒト一次メソアンジオ芽細胞またはMABをシードします。メッキNPCの前に示したように、細胞懸濁液の残りの半分を底ウェルに播種する前に、細胞懸濁液がチャネルを流れるように数秒間一時停止します。その後、2つの新しいMABシードの井戸を追加の成長培地で上げ、実証されているように再びインキュベートします。運動ニューロン分化の21日目に化学戦術と体積勾配を開始するには、成長因子を含む運動ニューロン神経基底培地のウェルあたり200マイクロリットルをMyotubeコンパートメントに加え、運動ニューロンコンパートメントに成長因子を含まない運動ニューロン基底培地のウェルあたり100マイクロリットルを加える。細胞株をマイクロ流体デバイスで共培養する前に分化電位を評価することが重要です。MABsの融合指数を決定し、約8%が共培養に十分であると推定した。生成された運動ニューロン培養は、運動ニューロンマーカーに対して85〜95%陽性であった。神経筋接合部またはNJの量を特徴付け、定量化するために、神経ニューロンとシナプス前マーカーの間の共局在化の数は、神経線維層重鎖およびシナプトフィシンおよびシナプトフィシンおよびポストナプチレン受容体マーカーαブンガロトキシンとの間の共局在化の数を、各疾患スタックを通じてカウントされ、Myotubeの多数のミオシン重鎖標識されたMyotubesで正規化された。NJは、神経突起が1つの相互作用点で微妙なコリン受容体のクラスターに触れた単一の接触点NmJとして登場しました.または、神経突起がファンアウトし、より大きな表面上の微妙なコリン受容体クラスターに従事した複数の接触点NmJsとして.運動ニューロンの革新性の割合の定量化は、すべてのMyotubesがNmJを含んでいないことを示した。塩化カリウムによる運動ニューロンの活性化に際して、カルシウム流入がFluo-4標識されたMyotubesで観察され、これは、ミオチューブ内の神経ニューライトに機能的な接続を確認し、NMJブロッカーd-tubocurarineを加え、またはDTCをミオチューブコンパートメントに添加し、カルシウム流入を阻害した。このモデルで最大の成功を収めるには、細胞ラインの品質チェックを実行し、デバイスのチャネルで気泡が形成されないようにすることが非常に重要です。他のIPC直接細胞タイプと皿の神経筋接合を組み合わせることで、インビトロの状況をさらに模倣し、これはまた、これらの細胞タイプの役割を研究することができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

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なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

腓骨神経損傷方法：神経筋接合部を修復信頼性の高い同定するためのアッセイおよびテスト要因

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

三次元運動神経オルガノイド発生

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

ラット内側胃腸筋単一運動ユニットの機能的分離

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...