Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

저자는 리모네, 연구 그룹 분자 신경 생물학 (VIB-KU 루벤)에서 니키 코르투트와 세바스찬 멍크에게 라이브 셀 칼슘 과도 형광 기록에 대한 조언을 감사드립니다. 이 연구는 벨기에와 룩셈부르크에 풀 브라이트위원회에 의해 지원되었다, KU 루벤 (C1과 "미래를 여는" 기금), VIB, 과학 기술에 의해 혁신기구 (IWT; SBO-iPSCAF), "과학 연구 플랑드르 기금" (FWO-블라안데렌), 대상 ALS, ALS 리가 벨지에 (ALS에 대한 치료), 벨기에 정부 (벨기에 연방 과학 정책 사무소에 의해 시작 된 대학 명소 폴란드 프로그램 P7/16), 티에리 라트란 재단과 "협회 벨지 레 메네아 레 말라키". T.V. 및 J.B FWO-블라안데렌이 수여하는 박사 펠로우십의 지원을 받습니다.

L.V.D..B 샤르코트 마리 치아 질병(US-201327717-A1)에서 HDAC 억제제의 사용에 대한 특허를 보유하고 있으며, 어거스틴 테라피의 과학적인 공동 창립자이며 과학 자문위원회 의 원으로 활동하고 있습니다. 다른 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 30일 이내에 시판되는 미세 유체 장치에서 기능성 NMJ를 사용하여 인간 모터 유닛을 생성하는 비교적 사용하기 쉬운 방법을 설명합니다. 그것은 NMJs가 ICC와 SEM과 같은 표준 기술을 통해 그리고 살아있는 세포 칼슘 기록을 통해 기능적으로 어떻게 형태적으로 평가될 수 있는지 설명됩니다.
이 프로토콜의 큰 장점은 줄기 세포 기술의 사용입니다. 이를 통해 NMJ가 기증자 프로필과 독립적으로 건강과 질병 모두에서 평가될 수 있는 완전한 적응성을 허용합니다. 이 모델은 ALS 연구에서 이미 성공적이고 유익한 것으로 입증되었으며, FUS gene18의 돌연변이로 인해 뉴라이트 아웃성장, 재성장 및 NMJ 번호의 장애를 새로운 표현형으로 확인했습니다. 이 모형을 사용하여, 산발적인 ALS 환자에서 iPSC를 사용하여, 병인이 알려지지 않은 ALS의 산발적인 양식을 포함하는 연구를 확장할 수 있습니다. 이것은 인간 질병을 다시 항복하기 위하여 돌연변이된 유전자의 형질 전환과 발현에 의존하는 전통적인 동물 모형에 비해 이점을 제공합니다23,24. 또한, 우리의 완전한 인간 시스템은 인간 특정 생리학 및 질병의 잠재적 인 회수를 허용합니다. 이전 연구는 설치류와 인간 NMJ 형태 사이의 차이점을 보여 주었다25, 이는 인간의 NMJ 병리학을 해결하기 위해 설치류를 사용할 때 주의구현해야한다는 것을 시사한다. 이 시스템은 생체 내 모델의 복잡성이 결여된 비교적 간단한 체외 설정이지만, 미세유체 장치에 표시되는 NMJ 형태가 인간 절단의 NMJ와 유사하다는 것을 입증할 수 있었다25. 더욱이, 이 모형은 NMJ 형성 및 성숙 도중 NMJ 평가를 허용합니다, 잠재적으로 초기 질병 표현형을 드러내는, 결석, 식별할 수 없는, 또는 인간 사후 견본에서 간과합니다.
MAB는 10일의 제한된 생존이 시스템의 단점이지만 myotube를 생성하는 유효한 옵션을 제공합니다. 근사 생존은 표면에 부착에 의존, 이는 가능성이 근섬유의 자발적인 수축에 의해 손상된다. 10일 이상 이후에 대부분의 myotube가 분리되어 NMJ 문화를 사용할 수 없게 됩니다. 이상적으로, myotube는 또한 iPSCs에서 생성될 것입니다. 그러나, 현재의 프로토콜은 융합 지수27,28,29,30의 변동성으로 인해 재현하기 어렵다는 것이 입증되었습니다.
시판되는 마이크로유체 장치를 사용하여 완전히 액세스할 수 있는 표준화된 시스템을 생성했습니다. 다른 NMJ 모델은 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42가 존재한다. 그러나, 그(것)들은 일반적으로 세포 모형 사이 구획화 그리고 유동적인 격리가 결여된 단 하나 구획에 의지합니다, 또는 주문을 받아 만들어진 배양 용기에, 가용성을 낮추고 잠재적으로 또한 재현성을 낮춥니다. 이 프로토콜에 사용되는 미세 유체 장치는 다양한 길이의 마이크로 그루브로 구입할 수 있으며 축산 운송43,44 또는 axotomy18,45,46 조사와 같은 추가 분석을 가능하게합니다. 구획 사이의 유체 적 격리는 치료 개발에 유리할 수 있는 운동 뉴런 또는 근투의 구획화된 약물 치료를 더욱 가능하게 합니다. 마이크로 유체 학 전문 의 더 많은 회사가 등장했다, 이는 장치 디자인 및 기능의 큰 선택을 열어, 더 체외 연구에 대한 접근성을 촉진.
결론적으로, 우리는 기능적 NMJs와 인간 모터 단위를 배양하는 신뢰할 수있는, 다재 다능하고 쉬운 방법을 제공하는 프로토콜을 개발했다.

NMJs는 신경 전달 물질의 방출을 통해 낮은 척추 운동 뉴런과 골격 근육 섬유 사이의 통신을 용이하게1. ALS 및 SMA 같이 운동 신경 무질서에서, NMJs는 근육과의 통신에 있는 중단을 일으키는 원인이 되는 퇴화2,3,4,5,6,7. 이것은 환자가 점차적으로 그들의 근육 기능을 분실귀착되는 결과, 그(것)들을 휠체어 에 묶는 원인이 되고 결국 다이어프램 같이 중요한 근육 단의 진보적인 위축 때문에 호흡 생활 지원에 의존하게 합니다. 이 무질서에 있는 NMJs의 이 심오한 손실에 책임 있는 정확한 근본적인 기계장치는 불명합니다. 많은 연구는 트랜스 제 동물 모델에 수행 되었습니다., NMJ 변성의 발병에 대 한 몇 가지 통찰력을 준 5,6,8,9,10,11. 그러나 병리학을 완전히 이해하고 기만에 대응하기 위해 완전한 접근성을 허용하는 인간 시스템을 갖는 것이 중요합니다.
여기서, 프로토콜은 시판되는 마이크로 유체 장치를 사용하여 hiPSC 유래 모터 뉴런 및 인간 1차 MAB 유래 근구의 공동 배양을 통해 인간 NMJ를 생성하는 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 뉴런의 소마와 축축을 편광하고 유동적으로 분리하기 위해 미세 유체의 사용은 1970 년대 후반에 'Campenot'챔버12의 첫 번째 설명 부터 알려져있다. 그 이후로 상업적 옵션을 포함하여 더 많은 미세 유체 설계가 제작되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 장치에는 두 개의 구획이 포함되어 있으며 각 구획은 channel13과 연결된 두 개의 우물로 구성됩니다. 두 구획은 미러로 되어 여러 마이크로그루브로 연결됩니다. 이러한 마이크로그루브에는 모세관 유압 13,14를 통해 두 구획 간의 유체 절연을 유지하면서 중성기 성장을 용이하게 하는 크기가 있습니다. 이 시스템을 사용하여, 다른 하나의 구획및 근육 세포에 모터 뉴런을 배양 할 수 있습니다, 그들의 특정 배양 배지에 각각, 여전히 마이크로 그루브를 통과하고 근육 세포와 참여 중성염을 통해 물리적 연결을 촉진하면서. 이 모델은 ALS 및 SMA와 같은 질병의 초기 NMJ 병리학을 연구하는 데 사용할 수있는 인간 모터 장치의 완전히 접근 가능하고 적응 가능한 체외 시스템을 제공합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

신경 근육 접합부 (NMJs)는 하부 운동 뉴런의 축록스와 근육 수축의 참여를 촉진하는 근육 사이의 전문 시냅스입니다. 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 척추 근육 위축(SMA)과 같은 운동 신경 장애에서 NMJ는 퇴화하여 근육 위축과 점진적 마비를 초래합니다. NMJ 퇴화의 기본 메커니즘은 알 수 없습니다., 주로 번역 가능한 연구 모델의 부족으로 인해. 이 연구는 기능성 NMJ가 있는 인간 모터 유닛의 다재다능하고 재현 가능한 체외 모델을 만드는 것을 목표로 했습니다. 따라서 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)-유래 모터 뉴런 및 인간 1차 중혈관지블라스트(MAB)-유래 심포우투는 시판적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 공동 배양되었다. 유동적으로 분리된 마이크로 구획을 사용하면 세포별 마이크로환경을 유지관리하면서 마이크로그루브를 통해 세포간 접촉을 허용할 수 있습니다. 화학 및 체적 그라데이션을 적용함으로써, 심오튜브 상호 작용과 NMJs의 형성을 촉진하는 마이크로그루브를 통해 모터 뉴런 뉴라이트의 성장이 자극되었다. 이들 NMJs는 운동 뉴런 전시냅틱 마커 시냅토피신(SYP)과 포스트냅스 아세틸콜린 수용체(AChR) 마커 α-분가로톡신(Btx)의 공동 국소화를 통해 면역세포화학적으로 확인되었으며, 스캐닝 전자 현미경(SEM)을 이용한 형태학적 특성화. NMJs의 기능은 운동 뉴런의 탈극성 시 심오튜브에서 칼슘 반응을 측정하여 확인되었습니다. 표준 미세 유체 장치와 줄기 세포 기술을 사용하여 생성 된 모터 장치는 건강과 질병에 있는 NMJs에 초점을 맞춘 미래 연구를 도울 수 있습니다.

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

이 비교적 간단한 방법은 건강과 질병에 있는 운동 신경 및 신경 근육 접합에 집중하는 연구를 도울 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 줄기 세포 기술과 재현성을 증가 시판되는 미세 유체 장치를 사용합니다. 모터 뉴런과 근육 세포의 단절은 여러 신경 근육 질환의 초기 현상입니다.단순한 인간화 모델은 이 현상을 대응하기 위한 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 운동 신경 장애, 근위축성 측삭 경화증을 조사하기 위하여 이 모형을 이용합니다, 그러나, 이 모형은 또한 모터 장치가 필수적인 그밖 무질서를 위해 사용될 수 있습니다. 먼저 선적 용기에서 10밀리리터를 함유한 페트리 접시에 10밀리리터를 함유한 페트리 접시로 장치를 10초 동안 살균하는 것으로 시작한다.집게가 있는 장치를 종이로 옮겨 라미나르 플로우에서 약 30분 동안 공기건조시다. 장치가 건조되면 집게를 사용하여 각 장치를 개별 10센티미터 페트리 접시로 이동합니다. 폴리 L-올니틴 또는 PLO로 장치를 코팅하려면 100 마이크로리터의 PLO 용액을 상단에 잘 추가하고 채널을 통해 상부에서 바닥까지 잘 전달되는 유체를 관찰합니다.그런 다음, 100 마이크로리터의 PLO 용액을 바닥에 잘 넣고 마이크로 홈의 반대편에서 반복한다. 한쪽에 100 마이크로리터의 PLO 솔루션을 추가하여 마이크로 홈을 코팅하는 장치의 두 미러 사이드 사이에 볼륨 그라데이션을 생성합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3시간 동안 배양합니다.3시간 후 DPBS로 5분간 세 번 세척합니다. PLO 코팅과 유사한 절차를 따라 밀리리터 라미닌 및 신경 물질 배지당 20 마이크로그램으로 장치를 코팅합니다. 밤새 장치를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.다음 날은 200 마이크로리터 파이펫을 사용하고 우물에서 라미닌 코팅을 제거하기 위해 채널 개구부와 반대되는 우물에 팁을 배치합니다. 모든 우물에 DPBS를 추가한 후, 세포 파종을 위해 실온에서 라미나르 흐름에 DPBS를 사용하여 장치를 둡니다. 양쪽에 몇 밀리미터를 남기면서 SCM 시트를 장치 크기로 잘라냅니다.10초 동안 70%에서 100%에탄올의 10밀리리터가 포함된 페트리 접시에 장치와 SCM 시트를 살균한 후, 집게가 있는 장치를 6웰 플레이트로 옮기고 SCM 시트는 10센티미터 페트리 접시로 옮겨 라미나르 플로우에서 공기 건조를 위한 것입니다. 장치를 가장자리에 배치하여 모든 면이 약 30 분 동안 건조 할 수 있도록합니다. 6웰 플레이트의 각 장치에 잘 당 PLO 용액 1밀리리터를 추가하여 장치를 코팅합니다.채널과 마이크로 홈 측이 액체를 아래로 향하여 PLO 용액 위에 장치가 떠 있는지 확인합니다. 10센티미터 페트리 접시에 PLO 용액 10밀리리터를 추가하여 SCM 시트를 코팅하고, 포셉을 사용하여 SCM 시트를 액체로 밀어 넣습니다. 이전에 설명한 대로 3시간 동안 장치 와 SCM 시트를 인큐베이션합니다.3시간 후, DPBS로 5분간 장치와 SCM 시트를 두 번 세척한 다음 멸균물로 5분간 세척합니다. 그런 다음 각 SCM 시트를 개별 10센티미터 페트리 접시에 공기 건조로 옮기합니다. 라미나르 플로우의 현미경으로 작업하는 동안, 모든 면이 정렬되도록 SCM 시트에 90도 각도로 채널 및 마이크로 홈 측면으로 실리콘 장치를 장착하는 집게를 사용합니다.장치를 가볍게 눌러 외부 가장자리뿐만 아니라 우물, 채널 및 마이크로 홈 을 밀봉해야합니다. 라미닌으로 장치를 코팅하려면, 라미나르 흐름 내부와 현미경 아래, 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 상단에 잘 상단에 라미닌의 밀리리터 용액 당 20 마이크로 그램의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 우물과 채널 주위에 누출없이 잘 하단에 채널을 통해 잘 상단에서 전달 유체를 관찰.이어서, 100 마이크로리터의 라미닌 용액을 잘 바닥에 추가하고, 마이크로 홈의 반대편에서 반복하고, 한쪽에 라미닌의 100 마이크로리터를 추가로 마무리하여 장치의 두 미러사이드 사이에 볼륨 그라데이션을 만들어 마이크로 홈을 코팅한 다음 하룻밤 동안 장치를 인큐베이팅한다. 다음 날, 모든 우물에 DPBS를 추가한 후, 채널 개구부 맞은편에 팁을 배치하여 200 마이크로리터 파이펫으로 우물에서 코팅을 제거하고, 세포 파종용 실온에서 라미나르 흐름에 DPBS를 사용하여 장치를 둡니다. 미세 유체 장치에서 신경 전구 세포 또는 NPC를 플레이트하려면 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 장치의 마이크로 홈의 한쪽에 있는 두 개의 우물에서 DPBS를 제거합니다.장치당 250, 000 NPC 및 60~100마이크로리터를 기기당 10마이크로리터를 시드하기 위해, 오른쪽 상단에 있는 셀 서스펜션의 절반은 45도 각도로 채널 개구부에 가깝다. 셀 서스펜션이 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지한 후 나머지 절반은 낮은 셀 서스펜션을 잘 추가합니다. 펜을 사용하여 시드 측을 NPC 또는 동등한 면으로 표시하여 현미경이 없는 장치의 쉬운 방향을 위해, 셀 부착을 위해 5분 동안 배양합니다.다음으로, 2개의 NPC 시드 우물을 10일 모터 뉴런 배지로 천천히 위로 올려 서 주며, 총 부피200 마이크로리터가 잘 들어섭다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여, 갓 시드 된 NPC반대마이크로 홈의 반대편에있는 두 우물에서 DPBS를 제거.그런 다음 잠복 하는 동안 매체의 증발을 방지 하기 위해 장치 주위에 10 센티미터 접시 당 DPBS의 6 밀리 리터를 추가 합니다. 매체를 변경하려면 채널 개구부 맞은편 웰 월의 하단 가장자리에 200 마이크로리터 파이펫 팁을 배치하여 NPC를 사용하여 두 우물모두에서 미디어를 천천히 제거합니다. 채널의 세포에 강한 중간 흐름이 손상되는 것을 방지하기 위해, 상하와 하부 사이를 지속적으로 변경하여 각각의 웰에 신선한 모터 뉴런 배지의 50~100 마이크로리터를 천천히 추가합니다.각 우물에 200 마이크로리터가 들어서면 공정을 반복합니다. 모터 뉴런 분화의 17일째에, 200 마이크로리터 파이펫으로 장치의 마이크로 홈의 시드되지 않은 측의 모터 뉴런 배지를 제거하고 DPBS로 우물을 세척한다. 총 200, 000 인간 1차 중전지 폭발 또는 MABs를 시드하여, 상단의 세포 현탁액의 절반을 잘 시드하여 장치당 60~100마이크로리터의 성장 배지를 시드한다.세포 현탁액이 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지하여 NPC를 도금하기 위해 앞에서 입증된 바와 같이, 하단에 있는 셀 서스펜션의 나머지 절반을 시드하기 전에 채널을 통해 흐르도록 합니다. 그런 다음 두 개의 갓 MAB 시드 우물을 추가 성장 매체로 위로 올려 입증 된 대로 다시 배양하십시오.운동 뉴런 분화의 21일째에 화학 전술과 체피 그라데이션을 시작하려면, 운동 뉴런 컴파트먼트에 성장 인자를 함유한 운동 뉴런 신경물질 배지의 웰당 200마이크로리터를 추가한 다음, 운동 뉴런 컴파트먼트에 성장 인자 없이 운동 뉴런 기저 배지의 웰당 100마이크로리터를 추가한다. 미세 유체 장치에서 공동 배양하기 전에 세포주의 분화 잠재력을 평가하는 것이 중요합니다. MAB의 융합 지수가 결정되었고, 약 8%가 공동 배양에 충분하다고 추정되었다.생성된 운동 신경 배양은 운동 신경 마커에 대해 85~95%의 양성이었다. 신경근육 접합체 또는 NMJ의 양을 특성화하고 정량화하기 위해, 운동 뉴런과 시냅틱 마커 간의 공동 국소화 의 수는 신경필라멘트 중체인과 시냅토피신 및 포스트냅틱 아세틸렌 수용체 마커 알파 분가로톡신 사이의 공동 국소화수를 각 질환 스택을 통해 계산되어 내 osin-무거운 사슬의 수로 정상화되었다. NMJs는 단일 접촉 지점 NMJ로 나타났으며, 중성염은 한 상호 작용 지점에서 미묘한 콜린 수용체의 클러스터에 닿았습니다.또는 뉴라이트가 더 큰 표면 위에 미묘한 콜린 수용체 클러스터와 교전된 다중 컨택포인트 NMJs로. 운동 뉴런의 백분율의 정량화는 모든 Myotubes가 NMJ를 포함하지 않는 것을 나타냈다. 염화칼륨을 통한 운동 뉴런 활성화시, 플루오-4 라벨이 부착된 묘튜브에서 칼슘 유입이 관찰되었으며, 이는 묘튜브의 운동 뉴런 뉴라이트에 대한 기능적 연결을 확인했으며, NMJ 차단제 d-tubocurarine 또는 DTC를 묘튜브 구획에 첨가하여 칼슘 유입을 억제하는 결과를 낳았다.이 모델로 가장 큰 성공을 거두기 위해 셀라인 품질 검사를 수행하고 장치 채널에서 기포가 형성되는 것을 피하는 것이 매우 중요합니다. 다른 IPC 직접 세포 유형과 접시에 신경 근육 접합을 결합하면 체외 상황이 더 잘 모방, 이것은 또한 이러한 세포 유형의 역할을 연구 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

연구

신경과학

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

3차원 모터 신경 오르간성 생성

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

쥐 내측 위트로테미즘 근육의 단일 모터 단위의 기능적 격리

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...