Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Os autores agradecem a Nikky Corthout e Sebastian Munck da LiMoNe, Grupo de Pesquisa Neurobiologia Molecular (VIB-KU Leuven) por seus conselhos sobre gravações de fluorescência transitória de cálcio de células vivas. Esta pesquisa foi apoiada pela Comissão Fulbright para a Bélgica e luxemburguês, KU Leuven (C1 e "Abrindo o Futuro" Fundo), o VIB, a Agência de Inovação pela Ciência e Tecnologia (IWT; SBO-iPSCAF), o "Fundo de Pesquisa Científica Flandres" (FWO-Vlaanderen), a Target ALS, a ALS Liga België (A Cura para a ALS), o Governo belga (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 iniciado pelo Escritório Federal de Política científica belga), pela Fundação Thierry Latran e pela "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. e J.B. são apoiados por bolsas de doutorado concedidas pela FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. tem uma patente sobre o uso de inibidores de HDAC na doença de Charcot-Marie-Tooth (EUA-2013227717-A1), é um co-fundador científico da Augustine Therapeutics, e membro de seu conselho consultivo científico. Os outros autores não declaram interesses concorrentes.

O protocolo descreve um método relativamente fácil de usar, que gera unidades motoras humanas com NMJs funcionais em dispositivos microfluidos disponíveis comercialmente em menos de 30 dias. Descreve-se como os NMJs podem ser avaliados morfologicamente através de técnicas padrão como ICC e SEM e funcionalmente através de gravações de cálcio de células vivas.
Uma grande vantagem deste protocolo é o uso da tecnologia de células-tronco. Isso permite a adaptabilidade total na qual os NMJs podem ser avaliados tanto em saúde quanto em doenças, independentemente do perfil do doador. O modelo já se mostrou bem sucedido e benéfico em pesquisas de ELA, onde identificamos prejuízos no crescimento de neurite, recrescimento e números de NMJ como novos fenótipos devido a mutações no gene FUS18. Com esse modelo, é possível ampliar a pesquisa para incluir formas esporádicas de ELA, onde a etiologia é desconhecida, utilizando iPSCs de pacientes esporádicos de ELA. Isso fornece uma vantagem sobre os modelos animais tradicionais, que dependem da superexpressão transgênica de genes mutantes para recapitular a doença humana23,24. Além disso, nosso sistema totalmente humano permite a recapitulação potencial da fisiologia e doenças específicas do homem. Estudos anteriores demonstraram as diferenças entre a morfologia do roedor e o NMJ humano25, o que sugere que a cautela deve ser implementada ao usar roedores para abordar a patologia do NMJ humano. Embora este sistema seja uma configuração in vitro relativamente simples, que carece da complexidade de um modelo in vivo, foi possível demonstrar que a morfologia NMJ exibida nos dispositivos microfluidos se assemelhava a NMJs de amputados humanos25. Além disso, este modelo permite a avaliação do NMJ durante a formação e maturação do NMJ, potencialmente revelando fenótipos precoces da doença, ausentes, não identificáveis ou negligenciados em amostras humanas pós-morte.
Os MABs fornecem uma opção válida para gerar miotubes, embora sua sobrevivência limitada de 10 dias seja uma desvantagem do sistema. A sobrevivência do miotube depende de seu apego à superfície, que provavelmente está comprometida por contrações espontâneas dos miofibers. Após mais de 10 dias, a maioria dos myotubes terá se destacado, tornando a cultura NMJ inutilizável. Idealmente, os miotubes seriam gerados a partir de iPSCs também. No entanto, os protocolos atuais têm se mostrado difíceis de reproduzir26 devido à variabilidade no índice de fusão27,28,29,30.
Usando dispositivos microfluidos disponíveis comercialmente, geramos um sistema padronizado, totalmente acessível. Outros modelos NMJ existem31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. No entanto, eles normalmente dependem de compartimentos únicos, que não possuem a compartimentação e isolamento fluido entre os tipos de células, ou em vasos de cultura personalizados, o que diminui a disponibilidade e potencialmente também a reprodutibilidade. Os dispositivos microfluidos utilizados para este protocolo podem ser adquiridos com microvalôos de vários comprimentos, o que permite análises posteriores como transporte axonal43,44 ou axotomia18,45,46 investigações. O isolamento fluido entre os compartimentos permite ainda o tratamento compartimentalizado de medicamentos de neurônios motores ou miotubes, o que pode ser favorável no desenvolvimento da terapia. Mais empresas especializadas em microfluidos surgiram, que se abriram para uma grande seleção de design e recursos de dispositivos, promovendo ainda mais a acessibilidade para pesquisas in vitro.
Em conclusão, desenvolvemos um protocolo que fornece um método confiável, versátil e fácil de cultivar unidades motoras humanas com NMJs funcionais.

Os NMJs facilitam a comunicação entre neurônios motores espinhais inferiores e fibras musculares esqueléticas através da liberação de neurotransmissores1. Em distúrbios do neurônio motor como ELA e SMA, os NMJs degeneram, o que causa uma interrupção na comunicação com os músculos2,3,4,5,6,7. Isso resulta em pacientes gradualmente perdendo sua função muscular, o que faz com que eles sejam cadeirantes e eventualmente dependentes de suporte respiratório de vida devido à atrofia progressiva de grupos musculares vitais como o diafragma. Os mecanismos subjacentes exatos responsáveis por essa profunda perda de NMJs nesses transtornos são desconhecidos. Muitos estudos têm sido feitos em modelos animais transgênicos, o que nos deu algumas informações sobre a patogênese da degeneração do NMJ5,6,8,9,10,11. No entanto, para entender completamente a patologia e neutralizar a denervação, é importante ter um sistema humano, que permita plena acessibilidade.
Aqui, o protocolo descreve uma maneira relativamente simples de gerar NMJs humanos através da co-cultivo de neurônios motores derivados do hiPSC e miótubos primários derivados do MAB usando dispositivos microfluidos disponíveis comercialmente. O uso de microfluidos para polarizar e isolar fluidamente as somas e axônios dos neurônios é conhecido desde a primeira descrição das câmaras 'Campenot'12 no final da década de 1970. Desde então, mais projetos microfluidos foram fabricados, incluindo opções comerciais. Os dispositivos utilizados neste protocolo contêm dois compartimentos, e cada compartimento consiste em dois poços conectados a um canal13. Os dois compartimentos são espelhados e conectados com vários microgrooves. Esses microgrooves têm um tamanho que facilita o crescimento de neurita, mantendo o isolamento fluido entre os dois compartimentos através de uma pressão hidrostática capilar13,14. Utilizando esse sistema, é possível cultivar neurônios motores em um compartimento e células musculares no outro, cada um em seu meio de cultura específica, ao mesmo tempo em que facilita uma conexão física através de neurites que passam pelos microrregiões e se envolvem com as células musculares. Este modelo fornece um sistema in vitro totalmente acessível e adaptável de uma unidade motora humana, que pode ser usado para estudar a patologia inicial do NMJ em doenças como ELA e SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

As junções neuromusculares (NMJs) são sinapses especializadas entre o axônio do neurônio motor inferior e o músculo facilitando o engajamento da contração muscular. Em distúrbios do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) e atrofia muscular espinhal (SMA), os NMJs degeneram, resultando em atrofia muscular e paralisia progressiva. O mecanismo subjacente da degeneração do NMJ é desconhecido, em grande parte devido à falta de modelos de pesquisa traduzíveis. Este estudo teve como objetivo criar um modelo in vitro versátil e reprodutível de uma unidade motora humana com NMJs funcionais. Portanto, os neurônios motores derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e os miótubos derivados do mesoangioblast (MAB) foram co-cultivados em dispositivos microfluidos disponíveis comercialmente. O uso de micropartidamentos fluidamente isolados permite a manutenção de microambientes específicos para células, permitindo o contato celular-célula através de microgrooves. Aplicando-se um gradiente quimotactic e volumoso, estimularam-se o crescimento dos neurônios-neuritos motores através dos microvalôos que promovem a interação do miotube e a formação de NMJs. Estes NMJs foram identificados imunocitoquimicamente através da co-localização do marcador pré-sináptico de neurônio motor sinaptofisina (SYP) e do marcador de asttilcolina pós-sinóptica (AChR) marcador α-bungarotoxina (Btx) em miotubes e caracterizado morfologicamente usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). A funcionalidade dos NMJs foi confirmada medindo respostas de cálcio nos miotubes após a despolarização dos neurônios motores. A unidade motora gerada usando dispositivos microfluidos padrão e tecnologia de células-tronco pode ajudar futuras pesquisas com foco em NMJs em saúde e doenças.

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Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Descrevemos um método para gerar unidades motoras humanas em dispositivos microfluidos comercialmente disponíveis, co-culminando neurônios motores pluripotentes induzidos por células-tronco com miótubos primários derivados do mesoangioblast, resultando na formação de junções neuromusculares funcionalmente ativas.

Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Este método relativamente simples pode ajudar a pesquisa com foco em neurônios motores e junções neuromusculares em saúde e doenças. Este protocolo usa tecnologia padrão de células-tronco e dispositivos microfluidos disponíveis comercialmente, o que aumenta a reprodutibilidade. A desconexão de neurônios motores e células musculares é um fenômeno precoce em várias doenças neuromusculares.Um modelo simples humanizado poderia ajudar a desenvolver estratégias para combater esse fenômeno. Utilizamos esse modelo para investigar a desordem do neurônio motor, a esclerose lateral amiotrófica, porém, esse modelo também pode ser usado para outras desordens em que a unidade motora é essencial. Comece transferindo o dispositivo usando as fórceps do contêiner de transporte para a placa de Petri contendo 10 mililitros de 70% a 100% de etanol para esterilização por 10 segundos.Transfira o dispositivo com fórceps para um pedaço de papel para secar no Fluxo Laminar por cerca de 30 minutos. Uma vez que um dispositivo é seco, use fórceps para mover cada dispositivo para uma placa de Petri individual de 10 centímetros. Para revestir o dispositivo com Poli-L-ornithine ou PLO, adicione 100 microliters de solução de OLP para a parte superior bem e observe o fluido passando de cima bem através do canal até o poço inferior.Em seguida, adicione 100 microliters de solução de OLP ao fundo bem, e repita do outro lado das micro ranhuras. Finalize adicionando 100 microliters de solução PLO de um lado para criar um gradiente de volume entre os dois lados espelhados do dispositivo para revestir as micro ranhuras. Incubar por três horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Depois de três horas, lave o dispositivo três vezes por cinco minutos com DPBS. Cubra o dispositivo com 20 microgramas por laminina mililitro e meio neurobásal seguindo o procedimento semelhante ao revestimento da OLP. Incubar o dispositivo durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte use uma pipeta de 200 microliter e posicione a ponta no poço oposto à abertura do canal para remover o revestimento de laminina dos poços. Depois de adicionar DPBS a todos os poços, deixe os dispositivos com DPBS no Fluxo Laminar à temperatura ambiente para semeadura celular. Corte as folhas de SCM para o tamanho do dispositivo, deixando alguns milímetros de cada lado.Depois de esterilizar os dispositivos e as folhas de SCM em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de 70% a 100% de etanol por 10 segundos, transfira os dispositivos com fórceps para uma placa de seis poços e as folhas de SCM para uma placa de Petri de 10 centímetros para secagem de ar no Lam Flowinar. Posicione o dispositivo na borda para permitir que todos os lados sequem por cerca de 30 minutos. Cubra os dispositivos adicionando um mililitro de solução PLO por poço a cada dispositivo na placa de seis poços.Certifique-se de que o dispositivo está flutuando em cima da solução PLO com o lado do canal e do micro sulco voltado para baixo no líquido. Cubra as folhas de SCM adicionando 10 mililitros de solução de OLP à placa de Petri de 10 centímetros e use os fórceps para empurrar as folhas de SCM para o líquido. Incubar dispositivos e folhas de SCM por três horas, como demonstrado anteriormente.Após três horas, lave os dispositivos e as folhas de SCM duas vezes por cinco minutos com DPBS seguido de outra lavagem por cinco minutos com água estéril. Em seguida, transfira cada folha de SCM para uma placa de Petri individual de 10 centímetros para secar o ar. Enquanto estiver trabalhando sob um microscópio no Fluxo Laminar, use fórceps para montar o dispositivo de silicone com o canal e o lado micro sulco para baixo em um ângulo de 90 graus na folha SCM, garantindo que todos os lados estejam alinhados.Pressione levemente para baixo no dispositivo para ter certeza de selar não apenas bordas externas, mas também em torno de poços, canais e micro ranhuras. Para revestir o dispositivo com laminina, dentro do Fluxo Laminar e sob o microscópio, adicione 100 microlitros de 20 microgramas por solução mililitro de laminina no poço superior usando uma pipeta de 200 microliteres. Observe o fluido passando do topo bem através do canal até o poço inferior sem qualquer vazamento ao redor do poço e do canal.Posteriormente, adicione 100 microliters de solução de laminina ao fundo bem, repita do outro lado das micro ranhuras e finalize com 100 microliters adicionais de laminina de um lado para criar um gradiente de volume entre os dois lados espelhados do dispositivo para cobrir as micro ranhuras, em seguida, incubar o dispositivo durante a noite. No dia seguinte, remova o revestimento dos poços com a pipeta de 200 microliters posicionando a ponta no bem oposto à abertura do canal, depois de adicionar DPBS a todos os poços, deixe os dispositivos com DPBS no Fluxo Laminar à temperatura ambiente para semeadura celular. Para emplacar as células progenitoras neurais ou NPCs no dispositivo microfluido, remova DPBS de dois poços de um lado das micro ranhuras no dispositivo usando uma pipeta de 200 microliter.Para semear um total de 250.000 NPCs e 60 a 100 microliters do dia 10 neurônio motor médio por dispositivo, no poço superior direito, metade da suspensão celular perto da abertura do canal em um ângulo de 45 graus. Pare por alguns segundos para permitir que a suspensão da célula flua através do canal antes de adicionar a metade restante da suspensão da célula no poço inferior. Use uma caneta para marcar o lado semeado como NPC ou equivalente, para fácil orientação do dispositivo sem microscópio, e incubar por cinco minutos para fixação celular.Em seguida, rechague lentamente os dois poços semeados NPC com um médio de neurônio motor adicional de 10 dias para um volume total de 200 microliters por poço. Usando uma pipeta de 200 microliteres, remova DPBS dos dois poços do outro lado das micro ranhuras opostas aos NPCs recém-semeados. Adicione 200 microliters do dia 10 de mídia de neurônio motor por poço aos poços não semeados.Em seguida, adicione seis mililitros de DPBS por prato de 10 centímetros ao redor do dispositivo para evitar a evaporação do meio durante a incubação. Para alterar o meio, remova lentamente a mídia em ambos os poços com NPCs, posicionando a ponta de pipeta de 200 microliters na borda inferior da parede do poço em frente à abertura do canal. Para evitar que um forte fluxo médio danifique as células do canal, adicione lentamente 50 a 100 microliters de médio neurônio motor fresco para cada poço, mudando continuamente entre o topo e o fundo bem.Repita o processo até que cada poço contenha 200 microliters de meio. No dia 17 da diferenciação do neurônio motor, remova o meio do neurônio motor no lado não semeado das micro ranhuras do dispositivo com uma pipeta de 200 microliter e lave os poços com DPBS. Semente um total de 200.000 mesoangioblasts ou MABs primários humanos, em 60 a 100 microliters de meio de crescimento por dispositivo, semeando metade da suspensão celular no poço superior.Pare por alguns segundos para permitir que a suspensão da célula flua pelo canal antes de semear a metade restante da suspensão da célula na parte inferior, como demonstrado anteriormente para emplacamento NPCs. Incubar o dispositivo por cinco minutos para fixação celular. Em seguida, reestree os dois poços recém-semeados de MAB com um meio de crescimento adicional e incubar novamente como demonstrado.Para iniciar a tática de quimioterapia e gradiente volumétrico no 21º dia da diferenciação do neurônio motor, adicione 200 microliters por poço de meio neurobásal de neurônio motor contendo fatores de crescimento ao compartimento do Myotube, em seguida, adicione 100 microliters por poço de meio basal do neurônio motor sem fatores de crescimento ao compartimento do neurônio motor. É importante avaliar o potencial de diferenciação das linhas celulares antes de co-culminá-las em dispositivos microfluidos. O índice de fusão de MABs foi determinado, e estima-se que cerca de 8% foram suficientes para a cocultura.As culturas de neurônios motores gerados foram 85 a 95% positivas para marcadores de neurônios motores. Para caracterizar e quantificar a quantidade de junções neuromusculares ou NMJs, o número de co-localizações entre o neurônio motor e marcadores pré-sinápticos de cadeia pesada de neurofilamento e sinaptofisina e marcador de astêndio sulinápico marcador alfa bungarotoxin, foi contado através de cada pilha de doenças e foi normalizado em uma série de miotubes rotulados myotubes de cadeia pesada de miotubes rotulados na pilha Z. Os NMJs apareceram como NMJs de ponto de contato único onde neurite tocou em um aglomerado de um receptor de colina sutil em um ponto de interação.Ou como múltiplos NMJs de ponto de contato onde um neurite se espalhou e se envolveu com um aglomerado de receptores de colina sutil sobre uma superfície maior. A quantificação da porcentagem de neurônio motor inovou myotubes indicaram que nem todos os Myotubes continham NMJs. Após a ativação do neurônio motor com cloreto de potássio, o fluxo de cálcio foi observado nos Myotubes rotulados fluo-4, que confirmaram uma conexão funcional através da neurita do neurônio motor no Myotube, a adição do bloqueador de NMJ d-tubocurarine, ou DTC ao compartimento do Myotube resultou em uma inibição do fluxo de cálcio.Para ter o maior sucesso com este modelo é incrivelmente importante realizar uma verificação de qualidade da linha celular e evitar a formação de bolhas de ar nos canais do dispositivo. Combinando a junção neuromuscular em um prato com outros tipos de células diretas IPC imita ainda melhor a situação in vitro, isso também permite estudar o papel desses tipos celulares.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

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The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Neurociência

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Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

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Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

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The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

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Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

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Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

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Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

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Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...