Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Авторы благодарят Никки Кортхаута и Себастьяна Мунка из LiMoNe, исследовательской группы молекулярной нейробиологии (VIB-KU Leuven) за их советы по записям переходной флуоресценции кальция живыми клетками. Это исследование было поддержано Комиссией Фулбрайта в Бельгии и Люксембурге, KU Leuven (C1 и Фонд «Открывая будущее»), VIB, Агентством по инновациям в области науки и техники (IWT; SBO-iPSCAF), «Фонд научных исследований Фландрии» (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), правительство Бельгии (Межуниверситетская программа привлечения полюсов P7/16, инициированная Бельгийским федеральным управлением по научной политике), Фонд Тьерри Латрана и «Ассоциация belge contre les Maladies neuro-Musculaires» (ABMM). T.V. и J.B. поддерживаются стипендиями Ph.D., присуждаемыми FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. имеет патент на использование ингибиторов HDAC при болезни Шарко-Мари-Тута (US-2013227717-A1), является научным соучредителем Augustine Therapeutics и членом ее научно-консультативного совета. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Протокол описывает относительно простой в использовании метод, который генерирует двигательные единицы человека с функциональными NMJ в коммерчески доступных микрофлюидных устройствах менее чем за 30 дней. Описано, как NMJ могут быть оценены морфологически с помощью стандартных методов, таких как ICC и SEM, и функционально с помощью записей кальция живых клеток.
Большим преимуществом данного протокола является использование технологии стволовых клеток. Это обеспечивает полную адаптивность, при которой НМЮ могут быть оценены как по здоровью, так и по заболеванию, независимо от профиля донора. Модель уже оказалась успешной и полезной в исследованиях БАС, где мы идентифицировали нарушения в росте нейритов, восстановлении роста и числах NMJ как новых фенотипов из-за мутаций в гене FUS18. С помощью этой модели можно расширить исследования, включив в них спорадические формы БАС, где этиология неизвестна, используя ИПСК у спорадических пациентов с БАС. Это дает преимущество перед традиционными животными моделями, которые полагаются на трансгенную сверхэкспрессию мутированных генов для повторения болезни человека23,24. Кроме того, наша полностью человеческая система позволяет потенциально повторять специфическую для человека физиологию и болезнь. Предыдущие исследования продемонстрировали различия между морфологией NMJ грызунов и человека25, что говорит о том, что необходимо соблюдать осторожность при использовании грызунов для лечения патологии NMJ человека. Хотя эта система представляет собой относительно простую установку in vitro, которой не хватает сложности модели in vivo, можно было продемонстрировать, что морфология NMJ, отображаемая в микрофлюидных устройствах, напоминала NMJ ампутатов человека25. Кроме того, эта модель позволяет оценивать NMJ во время формирования и созревания NMJ, потенциально выявляя ранние фенотипы заболевания, которые отсутствуют, неидентифицируемы или упускаются из виду в посмертных образцах человека.
MABs обеспечивают допустимый вариант генерации миотубов, хотя их ограниченная выживаемость в 10 дней является недостатком системы. Выживание myotube зависит от их прикрепления к поверхности, что, вероятно, скомпрометировано спонтанными сокращениями миофиберов. Через более чем 10 дней большинство миотубов отсоединятся, что сделает культуру NMJ непригодной для использования. В идеале миотубы также должны генерироваться из iPSCs. Однако современные протоколы оказалось трудно воспроизвести26 из-за изменчивости индекса слияния27,28,29,30.
Используя коммерчески доступные микрофлюидные устройства, мы создали стандартизированную систему, которая является полностью доступной. Другие модели NMJ существуют31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Тем не менее, они обычно полагаются на одиночные отсеки, в которых отсутствует компартментализация и жидкостная изоляция между типами клеток, или на изготовленные на заказ сосуды для культивирования, что снижает доступность и, возможно, также воспроизводимость. Микрофлюидные устройства, используемые для этого протокола, могут быть приобретены с микроплотами различной длины, что позволяет проводить дальнейший анализ, такой как аксональный транспорт43,44 или аксотомия18,45,46 исследований. Жидкостная изоляция между компартментами дополнительно позволяет проводить компартментированную медикаментозную обработку двигательных нейронов или миотрубок, что может быть благоприятным в развитии терапии. Появилось больше компаний, специализирующихся на микрофлюидике, которые открылись для большого выбора дизайна и функций устройств, что еще больше способствовало доступности исследований in vitro.
В заключение, мы разработали протокол, обеспечивающий надежный, универсальный и простой метод культивирования двигательных единиц человека с функциональными NMJ.

NMJ облегчают связь между нижними спинальными двигательными нейронами и волокнами скелетных мышц посредством высвобождения нейротрансмиттеров1. При нарушениях двигательных нейронов, таких как БАС и СМА, NMJ дегенерируют, что вызывает нарушение связи с мышцами2,3,4,5,6,7. Это приводит к тому, что пациенты постепенно теряют свою мышечную функцию, что приводит к тому, что они прикованы к инвалидной коляске и в конечном итоге зависят от респираторного жизнеобеспечения из-за прогрессирующей атрофии жизненно важных групп мышц, таких как диафрагма. Точные основные механизмы, ответственные за эту глубокую потерю NMJ при этих расстройствах, неизвестны. Многие исследования были проведены на трансгенных животных моделях, которые дали нам некоторое представление о патогенезе дегенерации NMJ5,6,8,9,10,11. Однако, чтобы полностью понять патологию и противодействовать денервации, важно иметь человеческую систему, которая обеспечивает полную доступность.
Здесь протокол описывает относительно простой способ генерации человеческих NMJ путем совместного культивирования моторных нейронов, полученных из hiPSC, и первичных миотуб человека, полученных из MAB, с использованием коммерчески доступных микрофлюидных устройств. Использование микрофлюидики для поляризации и жидкостной изоляции сом и аксонов нейронов было известно с момента первого описания камер «Кампено»12 в конце 1970-х годов. С тех пор было изготовлено больше микрофлюидных конструкций, включая коммерческие варианты. Устройства, используемые в этом протоколе, содержат два отсека, и каждый отсек состоит из двух колодцев, соединенных каналом13. Два отсека зеркальны и соединены несколькими микрогрузами. Эти микрорезы имеют размер, который облегчает рост нейритов, сохраняя при этом текучую изоляцию между двумя отсеками через капиллярное гидростатическое давление13,14. Используя эту систему, можно культивировать двигательные нейроны в одном компартменте и мышечные клетки в другом, каждый в своей специфической питательной среде, в то же время облегчая физическую связь через нейриты, проходящие через микрорезы и взаимодействующие с мышечными клетками. Эта модель обеспечивает полностью доступную и адаптируемую систему in vitro двигательной единицы человека, которая может быть использована для изучения ранней патологии NMJ при таких заболеваниях, как БАС и СМА.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Нервно-мышечные соединения (NMJ) представляют собой специализированные синапсы между аксоном нижнего двигательного нейрона и мышцей, облегчающими вовлечение мышечного сокращения. При нарушениях двигательных нейронов, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС) и спинальная мышечная атрофия (СМА), NMJ дегенерируют, что приводит к мышечной атрофии и прогрессирующему параличу. Основной механизм дегенерации NMJ неизвестен, в основном из-за отсутствия переводимых исследовательских моделей. Это исследование было направлено на создание универсальной и воспроизводимой in vitro модели двигательной единицы человека с функциональными NMJ. Таким образом, моторные нейроны, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), и миотубы, полученные из первичных мезоангиобластов человека (MAB), были совместно культивированы в коммерчески доступных микрофлюидных устройствах. Использование псевдоизолированных микрокомпараторов позволяет поддерживать клеточную специфическую микросреду, допуская при этом межклеточный контакт через микроплощадки. Путем применения хемотаксического и объемного градиента стимулировали рост двигательных нейронов-нейритов через микрогрузы, способствующие взаимодействию миотруб и образованию NMJ. Эти NMJ были идентифицированы иммуноцитохимически путем совместной локализации пресинаптического маркера двигательных нейронов синаптофизина (SYP) и маркера постсинаптического ацетилхолинового рецептора (AChR) α-бунгаротоксина (Btx) на миотрубках и морфологически охарактеризованы с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM). Функциональность NMJ была подтверждена измерением кальциевых реакций в миотрубах при деполяризации двигательных нейронов. Двигательный блок, созданный с использованием стандартных микрофлюидных устройств и технологии стволовых клеток, может помочь будущим исследованиям, ориентированным на NMJ в области здравоохранения и болезней.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Описан способ генерации двигательных единиц человека в коммерчески доступных микрофлюидных устройствах путем совместного культивирования индуцированных человеком плюрипотентных двигательных нейронов, полученных из стволовых клеток, с первичными миотрубками человека, полученными из мезоангиобластов, что приводит к образованию функционально активных нервно-мышечных соединений.

Генерация двигательных единиц человека с функциональными нервно-мышечными соединениями в микрофлюидных устройствах

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Этот относительно простой метод может помочь исследованиям, сосредоточенным на двигательных нейронах и нервно-мышечных соединениях в здоровье и болезни. Этот протокол использует стандартную технологию стволовых клеток и коммерчески доступные микрофлюидные устройства, которые повышают воспроизводимость. Отключение двигательных нейронов и мышечных клеток является ранним явлением при нескольких нервно-мышечных заболеваниях.Простая гуманизированная модель могла бы помочь разработать стратегии противодействия этому явлению. Мы используем эту модель для исследования расстройства двигательных нейронов, бокового амиотрофического склероза, однако эта модель также может быть использована для других расстройств, при которых двигательная единица имеет важное значение. Начните с переноса устройства с помощью щипцов из транспортного контейнера в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров от 70% до 100% этанола для стерилизации в течение 10 секунд.Переложите устройство щипцами на лист бумаги, чтобы высохнуть на воздухе в Ламинарном потоке в течение примерно 30 минут. После того, как устройство высушено, используйте щипцы, чтобы переместить каждое устройство в отдельную 10-сантиметровую чашку Петри. Чтобы покрыть устройство поли-L-орнитином или ПЛО, добавьте 100 микролитров раствора ООП в верхнюю скважину и наблюдайте за жидкостью, проходящей из верхней скважины через канал в нижнюю скважину.Затем добавьте 100 микролитров раствора PLO в нижний колодец и повторите с другой стороны микро канавок. Закончите, добавив 100 микролитров раствора PLO с одной стороны, чтобы создать градиент объема между двумя зеркальными сторонами устройства для покрытия микро-канавок. Инкубировать в течение трех часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Через три часа трижды мойте прибор в течение пяти минут с помощью DPBS. Покройте устройство 20 микрограммами на миллилитр ламинина и нейробазальной среды, следуя процедуре, аналогичной покрытию PLO. Инкубируйте устройство в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.На следующий день используйте пипетку на 200 микролитров и расположите наконечник в скважине напротив отверстия канала, чтобы удалить ламининовое покрытие из скважин. После добавления DPBS во все колодцы оставьте устройства с DPBS в Laminar Flow при комнатной температуре для посева клеток. Вырежьте листы SCM до размера устройства, оставив по несколько миллиметров с каждой стороны.После стерилизации устройств и листов SCM в чашке Петри, содержащей 10 миллилитров от 70% до 100% этанола в течение 10 секунд, перенесите устройства с щипцами на шестилуночную пластину, а листы SCM на 10-сантиметровую чашку Петри для сушки на воздухе в Ламинарном потоке. Расположите устройство на краю, чтобы все стороны высохли в течение примерно 30 минут. Нанесите покрытие на устройства, добавив один миллилитр раствора PLO на каждую скважину к каждому устройству в шестилуночной пластине.Убедитесь, что устройство плавает поверх раствора PLO с каналом и стороной микро-канавки, обращенной вниз к жидкости. Покройте листы SCM, добавив 10 миллилитров раствора PLO в 10-сантиметровую чашку Петри, и используйте щипцы, чтобы протолкнуть листы SCM в жидкость. Инкубируйте устройства и листы SCM в течение трех часов, как было продемонстрировано ранее.Через три часа дважды вымойте устройства и простыни SCM в течение пяти минут с DPBS, а затем еще раз помойте в течение пяти минут стерильной водой. Затем переложите каждый лист SCM на индивидуальную 10-сантиметровую чашку Петри на сушку на воздухе. Во время работы под микроскопом в Laminar Flow используйте щипцы для крепления силиконового устройства с каналом и микро-канавкой стороной вниз под углом 90 градусов на лист SCM, гарантируя, что все стороны выровнены.Слегка прижмите к устройству, чтобы убедиться, что вы герметизируете не только внешние края, но и колодцы, каналы и микро-канавки. Чтобы покрыть устройство ламинином, внутри Laminar Flow и под микроскопом добавьте 100 микролитров по 20 микрограммов на миллилитр раствора ламинина в верхнюю лунку с помощью пипетки 200 микролитров. Наблюдайте за жидкостью, проходящей из верхней скважины через канал в нижнюю скважину без каких-либо утечек вокруг скважины и канала.Затем добавляют 100 микролитров раствора ламинина в нижнюю лунку, повторяют на другой стороне микроборозы и заканчивают дополнительными 100 микролитрами ламинина с одной стороны, чтобы создать градиент объема между двумя зеркальными сторонами устройства для покрытия микробороздок, затем инкубируют устройство в течение ночи. На следующий день снимите покрытие со скважин пипеткой объемом 200 микролитров, расположив наконечник в скважине напротив отверстия канала, после добавления DPBS ко всем скважинам, оставьте устройства с DPBS в Ламинарном потоке при комнатной температуре для посева клеток. Чтобы покрыть нейронные клетки-предшественники или NPC в микрофлюидном устройстве, удалите DPBS из двух лунок на одной стороне микроборозок в устройстве с помощью пипетки 200 микролитров.Чтобы засеять в общей сложности 250 000 NPC и от 60 до 100 микролитров среды двигательных нейронов дня на устройство, в правом верхнем углу засейте половину клеточной суспензии близко к отверстию канала под углом 45 градусов. Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы клеточная суспензия текла через канал, прежде чем добавлять оставшуюся половину клеточной суспензии в нижний колодец. Используйте ручку, чтобы пометить засеянную сторону как NPC или эквивалент, для легкой ориентации устройства без микроскопа, и инкубируйте в течение пяти минут для прикрепления клеток.Затем медленно доливайте две засеянные скважины NPC дополнительным 10-дневным моторным нейроном среды общим объемом 200 микролитров на лунку. Используя пипетку объемом 200 микролитров, удалите DPBS из двух лунок на другой стороне микроборозов напротив свежепосеянных NPC. Добавьте 200 микролитров среды двигательных нейронов 10 дня на скважину в несеянные лунки.Затем добавьте шесть миллилитров DPBS на 10-сантиметровую чашку вокруг устройства, чтобы предотвратить испарение среды во время инкубации. Чтобы изменить среду, медленно удалите среду в обеих скважинах с помощью NPC, расположив наконечник пипетки объемом 200 микролитров на нижнем краю стенки скважины напротив отверстия канала. Чтобы предотвратить повреждение клеток на канале сильным потоком среды, медленно добавляйте от 50 до 100 микролитров свежей среды двигательных нейронов в каждую лунку, непрерывно перемещаясь между верхней и нижней лункой.Повторяйте процесс до тех пор, пока каждая скважина не будет содержать 200 микролитров среды. На 17-й день дифференцировки двигательных нейронов удалите моторную нейронную среду на несеянной стороне микробороздок в устройстве пипеткой 200 микролитров и промывайте колодцы DPBS. Посейте в общей сложности 200 000 первичных мезоангиобластов человека или MABs в 60-100 микролитрах питательной среды на устройство, посеяв половину клеточной суспензии в верхней лунке.Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы позволить клеточной суспензии течь через канал, прежде чем засевать оставшуюся половину клеточной суспензии в нижний колодец, как показано ранее для покрытия NPC. Инкубируйте устройство в течение пяти минут для прикрепления клеток. Затем дополните две свежезасеянные скважины MAB дополнительной питательной средой и снова инкубируйте, как показано на рисунке.Чтобы инициировать химиотактическую тактику и объемный градиент на 21-й день дифференцировки двигательного нейрона, добавьте 200 микролитров на лунку нейробазальной среды двигательного нейрона, содержащей факторы роста, в отсек миотрубы, затем добавьте 100 микролитров на лунку базальной среды двигательного нейрона без факторов роста в отсек моторных нейронов. Важно оценить потенциал дифференцировки клеточных линий перед их совместной культивированием в микрофлюидных устройствах. Был определен индекс слияния МАБ, и около 8% были оценены как достаточные для совместной культуры.Сгенерированные культуры двигательных нейронов были от 85 до 95% положительными для маркеров двигательных нейронов. Для характеристики и количественной оценки количества нервно-мышечных соединений или NMJ количество колокализаций между двигательным нейроном и пресинаптическими маркерами нейрофиламентной тяжелой цепи и маркером синаптофизина и постсинаптического ацетиленового рецептора альфа-бунгаротоксина подсчитывали через каждый стек заболевания и нормализовали при ряде миозин-тяжелой цепи, меченных миотубами, присутствующих в Z-стеке. NMJ появились как единственная точка контакта NMJ, где нейрит касался кластера тонкого холинового рецептора в одной точке взаимодействия.Или в виде нескольких точек контакта NMJ, где нейрит раздувается и взаимодействует с тонким кластером рецепторов холина на большей поверхности. Количественная оценка процента инновационных моторных нейронов Myotubes показала, что не все Myotube содержат NMJ. При активации двигательных нейронов хлоридом калия наблюдался приток кальция в меченых Fluo-4 миотубах, что подтвердило функциональную связь через нейрит двигательных нейронов в миотрубе, добавление блокатора NMJ d-тубокурарина или DTC к отсеку Myotube привело к ингибированию притока кальция.Чтобы иметь наибольший успех с этой моделью, невероятно важно выполнить проверку качества клеточной линии и избежать образования пузырьков воздуха в каналах устройства. Сочетание нервно-мышечного соединения в чашке с другими типами прямых клеток МПК еще лучше имитирует ситуацию in vitro, что также позволяет изучить роль этих типов клеток.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная нейромышечных синапсах

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Малоберцового нерва Метод Травма: Надежный Анализ для идентификации и испытания факторов, которые Ремонт нервно-мышечных синапсах

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D кинематический анализ для функциональной оценки в Крыса Модель Сиатический нерв Давка травмы

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Трехмерное моторное нервное органоидное поколение

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Функциональная изоляция однодвигательных агрегатов крысиных медиальных мышц гастроконемиуса

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Рассечение волокон одиночных скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельномышечных соединений

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...