Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Los autores agradecen a Nikky Corthout y Sebastian Munck de LiMoNe, Grupo de Investigación de Neurobiología Molecular (VIB-KU Leuven) por sus consejos sobre los registros de fluorescencia transitoria de calcio de células vivas. Esta investigación fue apoyada por la Comisión Fulbright a Bélgica y Luxemburgo, KU Leuven (C1 y Fondo "Abriendo el Futuro"), el VIB, la Agencia para la Innovación por la Ciencia y la Tecnología (IWT; SBO-iPSCAF), el "Fondo para la Investigación Científica de Flandes" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, la ALS Liga België (Una cura para la ELA), el Gobierno belga (Programa Interuniversitario de Polos de Atracción P7/16 iniciado por la Oficina Federal de Política Científica de Bélgica), la Fundación Thierry Latran y la "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. y J.B. están respaldados por becas de doctorado otorgadas por FWO-Vlaanderen.

L.V.D.B. tiene una patente sobre el uso de inhibidores de HDAC en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (US-2013227717-A1), es cofundador científico de Augustine Therapeutics y miembro de su consejo asesor científico. Los otros autores no declaran intereses contrapuestos.

El protocolo describe un método relativamente fácil de usar, que genera unidades motoras humanas con NMJ funcionales en dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente en menos de 30 días. Se describe cómo los NMJ pueden evaluarse morfológicamente a través de técnicas estándar como ICC y SEM y funcionalmente a través de registros de calcio de células vivas.
Una gran ventaja de este protocolo es el uso de la tecnología de células madre. Esto permite una adaptabilidad total en la que los NMJ pueden evaluarse tanto en salud como en enfermedad, independientemente del perfil del donante. El modelo ya ha demostrado ser exitoso y beneficioso en la investigación de la ELA, donde identificamos deficiencias en el crecimiento de neuritas, el rebrote y los números de NMJ como nuevos fenotipos debidos a mutaciones en el gen FUS18. Con este modelo, es posible ampliar la investigación para incluir formas esporádicas de ELA, donde se desconoce la etiología, mediante el uso de iPSCs de pacientes esporádicos con ELA. Esto proporciona una ventaja sobre los modelos animales tradicionales, que se basan en la sobreexpresión transgénica de genes mutados para recapitular la enfermedad humana23,24. Además, nuestro sistema completamente humano permite una posible recapitulación de la fisiología y la enfermedad específicas del ser humano. Estudios previos demostraron las diferencias entre la morfología de NMJ en roedores y humanos25, lo que sugiere que se debe tener precaución al usar roedores para abordar la patología de NMJ humana. Aunque este sistema es una configuración in vitro relativamente simple, que carece de la complejidad de un modelo in vivo, fue posible demostrar que la morfología NMJ mostrada en los dispositivos microfluídicos se parecía a las NMJ de amputaciones humanas25. Además, este modelo permite la evaluación de NMJ durante la formación y maduración de NMJ, revelando potencialmente fenotipos tempranos de la enfermedad, que están ausentes, no identificables o pasados por alto en muestras humanas post mortem.
Los MAB proporcionan una opción válida para generar miotubos, aunque su supervivencia limitada de 10 días es una desventaja del sistema. La supervivencia del miotubo depende de su unión a la superficie, que probablemente se ve comprometida por las contracciones espontáneas de las miofibras. Después de más de 10 días, la mayoría de los miotubos se habrán desprendido, haciendo que la cultura NMJ sea inutilizable. Idealmente, los miotubos también se generarían a partir de iPSC. Sin embargo, los protocolos actuales han demostrado ser difíciles de reproducir26 debido a la variabilidad en el índice de fusión27,28,29,30.
Mediante el uso de dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente, generamos un sistema estandarizado, que es totalmente accesible. Existen otros modelos NMJ31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Sin embargo, generalmente se basan en compartimentos individuales, que carecen de la compartimentación y el aislamiento fluídico entre los tipos de células, o en recipientes de cultivo hechos a medida, lo que reduce la disponibilidad y potencialmente también la reproducibilidad. Los dispositivos microfluídicos utilizados para este protocolo se pueden adquirir con microgrooves de varias longitudes, lo que permite realizar análisis posteriores como el transporte axonal43,44 o la axotomía18,45,46 investigaciones. El aislamiento fluídico entre compartimentos permite además el tratamiento farmacológico compartimentado de las neuronas motoras o los miotubos, lo que puede ser favorable en el desarrollo de la terapia. Han surgido más empresas especializadas en microfluídica, lo que se ha abierto a una gran selección de diseños y características de dispositivos, promoviendo aún más la accesibilidad para la investigación in vitro.
En conclusión, hemos desarrollado un protocolo que proporciona un método confiable, versátil y fácil para cultivar unidades motoras humanas con NMJ funcionales.

Los NMJ facilitan la comunicación entre las neuronas motoras espinales inferiores y las fibras musculares esqueléticas a través de la liberación de neurotransmisores1. En los trastornos de las neuronas motoras como la ELA y la AME, los NMJ se degeneran, lo que provoca una interrupción en la comunicación con los músculos2,3,4,5,6,7. Esto hace que los pacientes pierdan gradualmente su función muscular, lo que hace que estén en silla de ruedas y, finalmente, dependan del soporte vital respiratorio debido a la atrofia progresiva de grupos musculares vitales como el diafragma. Se desconocen los mecanismos subyacentes exactos responsables de esta profunda pérdida de NMJ en estos trastornos. Se han realizado muchos estudios en modelos animales transgénicos, lo que nos ha dado algunas ideas sobre la patogénesis de la degeneración nmJ5,6,8,9,10,11. Sin embargo, para comprender completamente la patología y contrarrestar la denervación, es importante contar con un sistema humano, que permita la plena accesibilidad.
Aquí, el protocolo describe una forma relativamente simple de generar NMJ humanos a través del co-cultivo de neuronas motoras derivadas de hiPSC y miotubos primarios humanos derivados de MAB utilizando dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente. El uso de microfluídica para polarizar y aislar fluidamente los somas y axones de las neuronas se conoce desde la primera descripción de las cámaras 'Campenot'12 a finales de la década de 1970. Desde entonces, se han fabricado más diseños microfluídicos, incluidas las opciones comerciales. Los dispositivos utilizados en este protocolo contienen dos compartimentos, y cada compartimento consta de dos pozos conectados con un canal13. Los dos compartimentos están reflejados y conectados con varios microgrooves. Estos microgrooves tienen un tamaño que facilita el crecimiento de neuritas manteniendo el aislamiento fluídico entre los dos compartimentos a través de una presión hidrostática capilar13,14. Usando este sistema, es posible cultivar neuronas motoras en un compartimento y células musculares en el otro, cada una en su medio de cultivo específico, al tiempo que facilita una conexión física a través de neuritas que pasan a través de los microgrooves y se involucran con las células musculares. Este modelo proporciona un sistema in vitro totalmente accesible y adaptable de una unidad motora humana, que se puede utilizar para estudiar la patología temprana de NMJ en enfermedades como la ELA y la AME.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Las uniones neuromusculares (NMJ) son sinapsis especializadas entre el axón de la neurona motora inferior y el músculo que facilita el compromiso de la contracción muscular. En los trastornos de las neuronas motoras, como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la atrofia muscular espinal (AME), los NMJ se degeneran, lo que resulta en atrofia muscular y parálisis progresiva. El mecanismo subyacente de la degeneración de NMJ es desconocido, en gran parte debido a la falta de modelos de investigación traducibles. Este estudio tuvo como objetivo crear un modelo in vitro versátil y reproducible de una unidad motora humana con NMJ funcionales. Por lo tanto, las neuronas motoras derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y los miotubos derivados de mesoangioblastos primarios (MAB) humanos se cocultivaron en dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente. El uso de microcompartimentos aislados fluidamente permite el mantenimiento de microambientes específicos de la célula, al tiempo que permite el contacto de célula a célula a través de microgrooves. Mediante la aplicación de un gradiente quimiotáctico y volumétrico, se estimuló el crecimiento de neuronas motoras-neuritas a través de los microgrooves promoviendo la interacción miotubo y la formación de NMJ. Estos NMJ se identificaron inmunocitoquímicamente a través de la co-localización del marcador presináptico de la neurona motora sinaptofisina (SYP) y el marcador del receptor postsináptico de acetilcolina (AChR) α-bungarotoxina (Btx) en los miotubos y se caracterizaron morfológicamente mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La funcionalidad de los NMJ se confirmó midiendo las respuestas de calcio en los miotubos tras la despolarización de las neuronas motoras. La unidad motora generada utilizando dispositivos microfluídicos estándar y tecnología de células madre puede ayudar a futuras investigaciones centradas en los NMJ en la salud y la enfermedad.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Describimos un método para generar unidades motoras humanas en dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente mediante el cocultivo de neuronas motoras derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos con miotubos derivados de mesoangioblastos primarios humanos, lo que resulta en la formación de uniones neuromusculares funcionalmente activas.

Generación de Unidades Motoras Humanas con Uniones Neuromusculares Funcionales en Dispositivos Microfluídicos

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Este método relativamente simple puede ayudar a la investigación centrada en las neuronas motoras y las uniones neuromusculares en la salud y la enfermedad. Este protocolo utiliza tecnología estándar de células madre y dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente que aumentan la reproducibilidad. La desconexión de las neuronas motoras y las células musculares es un fenómeno temprano en varias enfermedades neuromusculares.Un modelo humanizado simple podría ayudar a desarrollar estrategias para contrarrestar este fenómeno. Utilizamos este modelo para investigar el trastorno de la neurona motora, la esclerosis lateral amiotrófica, sin embargo, este modelo también se puede utilizar para otros trastornos en los que la unidad motora es esencial. Comience transfiriendo el dispositivo utilizando los fórceps del contenedor de envío a la placa de Petri que contiene 10 mililitros de 70% a 100% de etanol para la esterilización durante 10 segundos.Transfiera el dispositivo con fórceps a un pedazo de papel para que se seque al aire en el flujo laminar durante unos 30 minutos. Una vez que un dispositivo está seco, use fórceps para mover cada dispositivo a una placa de Petri individual de 10 centímetros. Para recubrir el dispositivo con Poly-L-ornitina u PLO, agregue 100 microlitros de solución PLO al pozo superior y observe el fluido que pasa del pozo superior a través del canal al pozo inferior.Luego, agregue 100 microlitros de solución PLO al pozo inferior y repita en el otro lado de las micro ranuras. Termine agregando 100 microlitros de solución PLO en un lado para crear un gradiente de volumen entre los dos lados espejados del dispositivo para recubrir las micro ranuras. Incubar durante tres horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Después de tres horas, lave el dispositivo tres veces durante cinco minutos con DPBS. Cubra el dispositivo con 20 microgramos por mililitro de laminina y medio neurobasal siguiendo el procedimiento similar al recubrimiento PLO. Incubar el dispositivo durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, use una pipeta de 200 microlitros y coloque la punta en el pozo opuesto a la abertura del canal para eliminar el recubrimiento de laminina de los pozos. Después de agregar DPBS a todos los pozos, deje los dispositivos con DPBS en el flujo laminar a temperatura ambiente para la siembra de celdas. Corte las hojas SCM al tamaño del dispositivo dejando unos milímetros a cada lado.Después de esterilizar los dispositivos y las láminas SCM en una placa de Petri que contiene 10 mililitros de 70% a 100% de etanol durante 10 segundos, transfiera los dispositivos con fórceps a una placa de seis pocillos y las hojas SCM a una placa de Petri de 10 centímetros para el secado al aire en el flujo laminar. Coloque el dispositivo en el borde para permitir que todos los lados se sequen durante unos 30 minutos. Cubra los dispositivos agregando un mililitro de solución PLO por pocillo a cada dispositivo en la placa de seis pocillos.Asegúrese de que el dispositivo esté flotando sobre la solución PLO con el canal y el lado de la micro ranura hacia abajo en el líquido. Cubra las hojas de SCM agregando 10 mililitros de solución de PLO a la placa de Petri de 10 centímetros, y use las pinzas para empujar hacia abajo las hojas de SCM hacia el líquido. Incubar dispositivos y hojas SCM durante tres horas como se demostró anteriormente.Después de tres horas, lave los dispositivos y las hojas de SCM dos veces durante cinco minutos con DPBS seguido de otro lavado durante cinco minutos con agua estéril. Luego transfiera cada hoja SCM a una placa de Petri individual de 10 centímetros para secar al aire. Mientras trabaja bajo un microscopio en el flujo laminar, use fórceps para montar el dispositivo de silicona con el canal y la micro ranura hacia abajo en un ángulo de 90 grados sobre la lámina SCM, asegurando que todos los lados estén alineados.Presione ligeramente hacia abajo sobre el dispositivo para asegurarse de sellar no solo los bordes exteriores, sino también alrededor de pozos, canales y micro ranuras. Para recubrir el dispositivo con laminina, dentro del flujo laminar y bajo el microscopio, agregue 100 microlitros de 20 microgramos por mililitro de solución de laminina en el pozo superior utilizando una pipeta de 200 microlitros. Observe el fluido que pasa del pozo superior a través del canal al pozo inferior sin ninguna fuga alrededor del pozo y el canal.Posteriormente, agregue 100 microlitros de solución de laminina al pozo inferior, repita en el otro lado de las micro ranuras y termine con 100 microlitros adicionales de laminina en un lado para crear un gradiente de volumen entre los dos lados espejados del dispositivo para recubrir las micro ranuras, luego incube el dispositivo durante la noche. Al día siguiente, retire el recubrimiento de los pozos con la pipeta de 200 microlitros colocando la punta en el pozo opuesto a la abertura del canal, después de agregar DPBS a todos los pozos, deje los dispositivos con DPBS en el flujo laminar a temperatura ambiente para la siembra de celdas. Para colocar placas de las células progenitoras neurales o NPC en el dispositivo microfluídico, retire DPBS de dos pocillos en un lado de las micro ranuras en el dispositivo utilizando una pipeta de 200 microlitros.Para sembrar un total de 250, 000 NPC y 60 a 100 microlitros de medio de neurona motora del día 10 por dispositivo, en el pozo superior derecho, sembra la mitad de la suspensión celular cerca de la abertura del canal en un ángulo de 45 grados. Haga una pausa durante unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de agregar la mitad restante de la suspensión celular en el pozo inferior. Use un bolígrafo para marcar el lado sembrado como NPC o equivalente, para facilitar la orientación del dispositivo sin un microscopio, e incube durante cinco minutos para la unión celular.A continuación, rellene lentamente los dos pozos sembrados de NPC con un medio adicional de neurona motora de día 10 a un volumen total de 200 microlitros por pozo. Usando una pipeta de 200 microlitros, retire DPBS de los dos pozos al otro lado de los micro surcos opuestos a los NPC recién sembrados. Agregue 200 microlitros de medios de neurona motora del día 10 por pozo a los pozos no sembrados.Luego agregue seis mililitros de DPBS por plato de 10 centímetros alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio durante la incubación. Para cambiar el medio, retire lentamente los medios en ambos pozos con NPC colocando la punta de pipeta de 200 microlitros en el borde inferior de la pared del pozo frente a la abertura del canal. Para evitar que un fuerte flujo medio dañe las células en el canal, agregue lentamente de 50 a 100 microlitros de medio de neurona motora fresca a cada pozo cambiando continuamente entre el pozo superior e inferior.Repita el proceso hasta que cada pozo contenga 200 microlitros de medio. En el día 17 de la diferenciación de la neurona motora, retire el medio de la neurona motora en el lado no sembrado de los micro surcos en el dispositivo con una pipeta de 200 microlitros y lave los pocillos con DPBS. Sembrar un total de 200, 000 mesoangioblastos primarios humanos o MAB, en 60 a 100 microlitros de medio de crecimiento por dispositivo sembrando la mitad de la suspensión celular en el pozo superior.Haga una pausa durante unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de sembrar la mitad restante de la suspensión celular en el pozo inferior, como se demostró anteriormente para el recubrimiento de NPC. Incube el dispositivo durante cinco minutos para la fijación de la célula. Luego rellene los dos pozos recién sembrados del MAB con un medio de crecimiento adicional e incube nuevamente como se ha demostrado.Para iniciar la táctica de quimioterapia y el gradiente volumétrico en el día 21 de la diferenciación de la neurona motora, agregue 200 microlitros por pocillo de medio neurobasal de la neurona motora que contenga factores de crecimiento al compartimiento de Myotube, luego agregue 100 microlitros por pozo de medio basal de la neurona motora sin factores de crecimiento al compartimiento de la neurona motora. Es importante evaluar el potencial de diferenciación de las líneas celulares antes de co-cultivarlas en dispositivos microfluídicos. Se determinó el índice de fusión de los MAB, y se estimó que alrededor del 8% era suficiente para el cocultivo.Los cultivos de neuronas motoras generados fueron de 85 a 95% positivos para los marcadores de neuronas motoras. Para caracterizar y cuantificar la cantidad de uniones neuromusculares o NMJ, se contó el número de colocalizaciones entre la neurona motora y los marcadores presinápticos de cadena pesada de neurofilamento y sinaptofisina y marcador del receptor de acetileno postsináptico alfa bungarotoxina, se contó a través de cada pila de enfermedad y se normalizó en una serie de miosinas de cadena pesada marcadas con miotubos presentes en la pila Z. Los NMJ aparecieron como NMJ de punto de contacto único donde la neurita tocó un grupo de un receptor de colina sutil en un punto de interacción.O como NMJ de punto de contacto múltiple donde una neurita se desplegó y se involucró con un grupo sutil de receptores de colina sobre una superficie más grande. La cuantificación del porcentaje de myotubos innovados por neuronas motoras indicó que no todos los miotubos contenían NMJ. Tras la activación de la neurona motora con cloruro de potasio, se observó afluencia de calcio en los Miotubos marcados con Fluo-4, lo que confirmó una conexión funcional a través de la neurita de la neurona motora en el Miotubo, la adición del bloqueador NMJ d-tubocurarina, o DTC al compartimiento de Myotube resultó en una inhibición de la afluencia de calcio.Para tener el mayor éxito con este modelo es increíblemente importante realizar un control de calidad de la línea celular y evitar la formación de burbujas de aire en los canales del dispositivo. La combinación de la unión neuromuscular en un plato con otros tipos de células directas IPC imita aún mejor la situación in vitro, esto también permite estudiar el papel de estos tipos de células.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Investigación

Neurociencias

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

El nervio peroneo Método de lesiones: un ensayo fiable para identificar y Factores de prueba de que la reparación neuromusculares uniones

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Transporte axónico de organelos en cultivos de neuronas motoras utilizando el sistema de cámaras microfluídicas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Generación de organoides nerviosos motores tridimensionales

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Aislamiento funcional de unidades de motor único de Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...