Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Författarna tackar Nikky Corthout och Sebastian Munck från LiMoNe, Forskargruppen Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) för deras råd om levande cell kalcium transient fluorescens inspelningar. Denna forskning stöddes av Fulbrightkommissionen i Belgien och Luxemburg, KU Leuven (C1 och "Opening the Future"-fonden), VIB, Byrån för innovation inom vetenskap och teknik (IWT; SBO-iPSCAF), "Fonden för vetenskaplig forskning Flandern" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiska regeringen (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 initierat av belgiens federala vetenskapspolitiska kontor), Thierry Latran Foundation och "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. och J.B. stöds av doktorandstipendier som delas ut av FWO-Vlaanderen.

L.V..B D. har ett patent på användning av HDAC-hämmare i Charcot-Marie-Tooth disease (US-2013227717-A1), är en vetenskaplig medgrundare av Augustine Therapeutics, och medlem av dess vetenskapliga rådgivande styrelse. De andra författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Protokollet beskriver en relativt lättanvänd metod, som genererar mänskliga motorenheter med funktionella NMJs i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter på mindre än 30 dagar. Det beskrivs hur NMJs kan bedömas morfologiskt genom standardtekniker som ICC och SEM och funktionellt genom levande cell kalcium inspelningar.
En stor fördel med detta protokoll är användningen av stamcellsteknik. Detta möjliggör full anpassningsförmåga där NMJs kan utvärderas i både hälsa och sjukdom, oberoende av givarprofilen. Modellen har visat sig redan framgångsrik och fördelaktig i ALS forskning, där vi identifierade nedskrivningar i neurit utväxt, återväxt och NMJ nummer som nya fenotyper på grund av mutationer i FUS gen18. Med denna modell är det möjligt att utöka forskningen till att omfatta sporadiska former av ALS, där etiologin är okänd, genom att använda iPSCs från sporadiska ALS-patienter. Detta ger en fördel jämfört med traditionella djurmodeller, som förlitar sig på transgent överuttryck av muterade gener för att rekapitulera mänsklig sjukdom23,24. Dessutom möjliggör vårt helt mänskliga system potentiell rekapitulering av människospecifik fysiologi och sjukdom. Tidigare studier visade skillnaderna mellan gnagare och human NMJ morfologi25, vilket tyder på att försiktighet måste genomföras när man använder gnagare för att ta itu med mänsklig NMJ patologi. Även om detta system är en relativ enkel in vitro-installation, som saknar komplexiteten hos en in vivo-modell, var det möjligt att visa att NMJ-morfologin som visas i de mikrofluidiska enheterna liknade NMJs av mänskliga amputater25. Dessutom tillåter denna modell NMJ-utvärdering under NMJ-bildande och mognad, vilket potentiellt avslöjar tidiga sjukdom fenotyper, som är frånvarande, oidentifierbara eller förbises i mänskliga obduktion prover.
MABs ger ett giltigt alternativ för att generera myotubes, även om deras begränsade överlevnad på 10 dagar är en nackdel med systemet. Myotube överlevnad förlitar sig på deras fastsättning till ytan, som sannolikt äventyras av spontana sammandragningar av myofibers. Efter mer än 10 dagar kommer de flesta myotubes att ha lossnat, vilket gör NMJ-kulturen oanvändbar. Helst skulle myotubes också genereras från iPSCs. Nuvarande protokoll har dock visat sig vara svåra att reproducera26 på grund av variationer i fusionsindex27,28,29,30.
Genom att använda kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter genererade vi ett standardiserat system som är fullt tillgängligt. Andra NMJ-modeller finns31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. De förlitar sig dock vanligtvis på enskilda fack, som saknar compartmentalization och fluidic isolering mellan celltyper, eller på skräddarsydda odlingskärl, vilket sänker tillgängligheten och potentiellt också reproducerbarheten. De mikrofluidiska anordningar som används för detta protokoll kan köpas med mikrogrooves av olika längder, vilket möjliggör ytterligare analys såsom axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersökningar. Den fluidic isolering mellan fack möjliggör ytterligare compartmentalized läkemedelsbehandling av antingen motor neuroner eller myotubes, vilket kan vara gynnsamt i terapi utveckling. Fler företag som specialiserat sig på mikrofluidik har dykt upp, vilket har öppnat upp för ett stort urval av enhetsdesign och funktioner, vilket ytterligare främjar tillgängligheten för in vitro-forskning.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett protokoll som ger en pålitlig, mångsidig och enkel metod för att odla mänskliga motorenheter med funktionella NMJs.

NMJs underlättar kommunikationen mellan lägre spinal motor nervceller och skelettmuskulaturfibrer genom frisättning av signalsubstanser1. I motoriska neuron störningar som ALS och SMA, NMJs degenerera, vilket orsakar en störning i kommunikationen med musklerna2,3,4,5,6,7. Detta resulterar i att patienter gradvis förlorar sin muskelfunktion, vilket gör att de är rullstolsbundna och så småningom beroende av andningslivsstöd på grund av progressiv atrofi av vitala muskelgrupper som membranet. De exakta underliggande mekanismerna som ansvarar för denna djupgående förlust av NMJs i dessa störningar är okända. Många studier har gjorts på transgena djurmodeller, vilket har gett oss några insikter om patogenesen vid NMJ degeneration5,6,8,9,10,11. Men för att fullt ut förstå patologin och motverka denervationen är det viktigt att ha ett mänskligt system, vilket möjliggör full tillgänglighet.
Här beskriver protokollet ett relativt enkelt sätt att generera mänskliga NMJs genom samodling av hiPSC-härledda motoriska nervceller och mänskliga primära MAB-härledda myotuber med kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter. Användningen av mikrofluidik för att polarisera och fluidiskt isolera somas och axoner av nervceller har varit känd sedan den första beskrivningen av "Campenot" kamrar12 i slutet av 1970-talet. Sedan dess har mer mikrofluidiska mönster tillverkats, inklusive kommersiella alternativ. De enheter som används i detta protokoll innehåller två fack, och varje fack består av två brunnar anslutna till en kanal13. De två facken är speglade och anslutna till flera mikrogrooves. Dessa mikrogrooves har en storlek som underlättar neurit tillväxt samtidigt upprätthålla fluidisk isolering mellan de två facken genom en kapillär hydrostatiskt tryck13,14. Med hjälp av detta system är det möjligt att odla motoriska nervceller i ett fack och muskelceller i det andra, var och en i deras specifika odlingsmedium, samtidigt som det underlättar en fysisk anslutning genom neuriter som passerar genom mikrogrationerna och engagerar sig med muskelcellerna. Denna modell ger ett fullt tillgängligt och anpassningsbart in vitro-system hos en mänsklig motorenhet, som kan användas för att studera tidig NMJ-patologi vid sjukdomar som ALS och SMA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Neuromuskulära korsningar (NMJs) är specialiserade synapser mellan axon av den nedre motoriska neuron och muskeln som underlättar engagemanget av muskelkontraktion. I motoriska neuron störningar, såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS) och spinal muskelatrofi (SMA), NMJs degenerera, vilket resulterar i muskelatrofi och progressiv förlamning. Den underliggande mekanismen för NMJ-degeneration är okänd, till stor del på grund av bristen på översättningsbara forskningsmodeller. Denna studie syftade till att skapa en mångsidig och reproducerbar in vitro-modell av en mänsklig motorenhet med funktionella NMJs. Därför var humanduced pluripotent stamcell (hiPSC)-härledda motor nervceller och mänskliga primära mesoangioblast (MAB)-härledda myotubes samkulturerade i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter. Användningen av fluidt isolerade mikrofack möjliggör underhåll av cellspecifika mikromiljö samtidigt som cell-till-cell-kontakt tillåts via mikrogrooves. Genom att tillämpa en chemotactic och volumetric gradient stimulerades tillväxten av motor neuron-neuriter genom mikrogrooves främja myotube interaktion och bildandet av NMJs. Dessa NMJs identifierades immunocytochemically genom samlokalisering av motor neuron presynaptic markör synaptophysin (SYP) och postsynaptic acetylkolin receptor (AChR) markör α-bungarotoxin (Btx) på myotubes och karakteriseras morfologiskt med skanning elektronmikroskopi (SEM). Funktionen hos NMJs bekräftades genom att mäta kalcium svar i myotubes vid depolarization av motor nervceller. Den motorenhet som genereras med hjälp av vanliga mikrofluidiska enheter och stamcellsteknik kan bidra till framtida forskning med fokus på NMJs inom hälsa och sjukdom.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

Vi beskriver en metod för att generera mänskliga motor enheter i kommersiellt tillgängliga microfluidic enheter genom samodling mänskliga inducerad pluripotenta stamcell-härledda motor nervceller med mänskliga primära mesoangioblast-härledda myotubes som resulterar i bildandet av funktionellt aktiva neuromuskulära korsningar.

Generering av mänskliga motorenheter med funktionella neuromuskulära korsningar i mikrofluidiska enheter

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Denna relativt enkla metod kan hjälpa forskning med fokus på motoriska nervceller och neuromuskulära korsningar i hälsa och sjukdom. Detta protokoll använder standardstamcellsteknik och kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter som ökar reproducerbarheten. Frånkoppling av motoriska nervceller och muskelceller är ett tidigt fenomen i flera neuromuskulära sjukdomar.En enkel humaniserad modell kan bidra till att utveckla strategier för att motverka detta fenomen. Vi använder denna modell för att undersöka motor neuron störning, amyotrofisk lateral skleros, men denna modell kan också användas för andra sjukdomar där motorenheten är avgörande. Börja med att överföra enheten med tången från fraktbehållaren till Petri-skålen som innehåller 10 milliliter 70% till 100% etanol för sterilisering i 10 sekunder.Överför enheten med tång till ett papper för att lufttorka i Laminar Flow i ca 30 minuter. När en enhet har torkats, använd tång för att flytta varje enhet till en individuell 10 centimeter Petriskål. För att belägga enheten med Poly-L-ornitin eller PLO, tillsätt 100 mikroliter PLO-lösning till toppen och observera vätskan som passerar från toppen väl genom kanalen till bottenbrunnen.Tillsätt sedan 100 mikroliter PLO-lösning till bottenbrunnen och upprepa på andra sidan av mikrospåren. Avsluta med att lägga till 100 mikroliter PLO-lösning på ena sidan för att skapa en volymgradient mellan enhetens två speglade sidor för att belägga mikrospåren. Inkubera i tre timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Tvätta enheten tre timmar efter tre timmar i fem minuter med DPBS. Täck enheten med 20 mikrogram per milliliter laminin och neurobasal medium genom att följa proceduren som liknar PLO-beläggning. Inkubera enheten över natten vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Följande dag använd en 200 mikroliter pipett och placera spetsen i brunnen mittemot kanalöppningen för att ta bort lamininbeläggningen från brunnarna. Efter att ha lagt till DPBS i alla brunnar, lämna enheterna med DPBS i Laminar Flow vid rumstemperatur för cellsådd. Kapa SCM-arken till enhetens storlek samtidigt som du lämnar några millimeter på varje sida.Efter sterilisering av enheterna och SCM-arken i en Petri-skål som innehåller 10 milliliter 70 till 100% etanol i 10 sekunder, överför enheterna med tång till en sexbrunnplatta och SCM-arken till en 10 centimeter Petriskål för lufttorkning i Laminar Flow. Placera enheten på kanten så att alla sidor torkar i ca 30 minuter. Täck enheterna genom att tillsätta en milliliter PLO-lösning per brunn till varje enhet i sexbrunnsplattan.Se till att enheten flyter ovanpå PLO-lösningen med kanal- och mikrospårsidan vänd nedåt i vätskan. Täck SCM-arken genom att tillsätta 10 ml PLO-lösning till 10 centimeter Petriskålen och använd tångarna för att trycka ner SCM-arken i vätskan. Inkubera enheter och SCM-ark i tre timmar, vilket visats tidigare.Efter tre timmar tvättar du enheterna och SCM-arken två gånger i fem minuter med DPBS följt av ytterligare en tvätt i fem minuter med sterilt vatten. Överför sedan varje SCM-ark till en individuell 10 centimeter Petriskål för att lufttorka. När du arbetar under ett mikroskop i Laminar Flow, använd tång för att montera silikonanordningen med kanal- och mikrospårsidan nedåt i 90 graders vinkel på SCM-arket och se till att alla sidor är justerade.Tryck lätt ner på enheten för att se till att försegla inte bara ytterkanter, men också runt brunnar, kanaler och mikrospår. För att belägga enheten med laminin, inuti Laminar Flow och under mikroskopet, tillsätt 100 mikroliter av 20 mikrogram per milliliterlösning av laminin i toppbrunnen med en 200 mikroliterpipett. Observera vätskan som passerar från toppen väl genom kanalen till bottenbrunnen utan läckage runt brunnen och kanalen.Lägg därefter till 100 mikroliter lamininlösning till bottenbrunnen, upprepa på andra sidan av mikrospåren och avsluta med ytterligare 100 mikroliter laminin på ena sidan för att skapa en volymgradient mellan enhetens två speglade sidor för att täcka mikrospåren och inkubera sedan enheten över natten. Följande dag, ta bort beläggningen från brunnarna med 200 mikroliterpipetten genom att placera spetsen i brunnen mittemot kanalöppningen, efter att ha lagt till DPBS till alla brunnar, lämna enheterna med DPBS i Laminar Flow vid rumstemperatur för cellsådd. För att plätera neurala stamceller eller NPC: er i den mikrofluidiska enheten, ta bort DPBS från två brunnar på ena sidan av mikrospåren i enheten med hjälp av en 200 mikroliter pipett.För att så totalt 250 000 NPC och 60 till 100 mikroliter dag 10 motor neuron medium per enhet, i den övre högra brunnen, frö hälften av cellfjädringen nära kanalöppningen i en vinkel på 45 grader. Pausa i några sekunder så att cellupphängningen kan flöda genom kanalen innan du lägger till den återstående halvan av cellupphängningen i den nedre brunnen. Använd en penna för att markera den sådda sidan som NPC eller motsvarande, för enkel orientering av enheten utan mikroskop, och inkubera i fem minuter för cellfäste.Fyll sedan långsamt på de två NPC-sådda brunnarna med ytterligare en dag 10 motor neuron medium till en total volym på 200 mikroliter per brunn. Använd en 200 mikroliter pipett, ta bort DPBS från de två brunnarna på andra sidan av mikrospåren mittemot de nysådda NPCs.Tillsätt sedan sex milliliter DPBS per 10 centimeter skål runt enheten för att förhindra avdunstning av mediet under inkubation. För att ändra mediet, ta långsamt bort media i båda brunnarna med NPC: er genom att placera 200 mikroliter pipetterspetsen vid bottenkanten av brunnsväggen mittemot kanalöppningen. För att förhindra att ett starkt mediumflöde skadar cellerna på kanalen, tillsätt långsamt 50 till 100 mikroliter av färsk motorisk neuronmedium till varje brunn genom att kontinuerligt byta mellan toppen och bottenbrunnen.Upprepa processen tills varje brunn innehåller 200 mikroliter medium. På dag 17 av motorisk neurondifferentiering, ta bort motorneuronmediet på den osedda sidan av mikrospåren i enheten med en 200 mikroliter pipett och tvätta brunnarna med DPBS. Frö totalt 200 000 mänskliga primära mesoangioblaster eller MAB, i 60 till 100 mikroliter tillväxtmedium per enhet genom att så hälften av cellfjädringen i den övre brunnen.Pausa i några sekunder för att låta cellfjädringen flöda genom kanalen innan du sår den återstående halvan av cellupphängningen i bottenbrunnen, vilket tidigare visats för plätering av NPCs. Inkubera enheten i fem minuter för cellfäste. Fyll sedan på de två nytillsädda MAB-sådda brunnarna med ett extra tillväxtmedium och inkubera igen som visats.För att initiera kemo taktik och volymetrisk gradient på den 21: a dagen av motor neuron differentiering, lägg till 200 mikroliter per brunn av motor neuron neurobasal medium som innehåller tillväxtfaktorer till Myotube facket, sedan lägga till 100 microliters per brunn av motor neuron basal medium utan tillväxtfaktorer till motor neuron facket. Det är viktigt att bedöma differentieringspotentialen hos cellinjerna innan de samkulteras i mikrofluidiska enheter. Fusionsindexet för MAB fastställdes och cirka 8% uppskattades vara tillräckligt för samkultur.De genererade motor neuron kulturer var 85 till 95%positiva för motor neuron markörer. För att karakterisera och kvantifiera mängden neuromuskulära korsningar eller NMJs, antalet co-localizations mellan motor neuron och pre-synaptic markörer neurofilament tung kedja och synaptophysin och postsynaptic acetylen receptor markör alfa bungarotoxin, räknades genom varje sjukdom stack och normaliserades vid ett antal myosin-tunga kedjan märkt Myotubes närvarande i Z-stack. NMJs uppträdde som enda kontaktpunkt NMJs där neurit berörde ett kluster av en subtil kolin receptor vid en interaktion punkt.Eller som flera kontaktpunkt NMJs där en neurit fann ut och engagerade med en subtil kolin receptor kluster över en större yta. Kvantifiering av andelen motor neuron innoverade Myotubes indikerade att inte alla Myotubes innehöll NMJs. Vid motor neuron aktivering med kaliumklorid observerades kalcium tillströmningen i Fluo-4 märkt Myotubes, som bekräftade en funktionell anslutning till motor neuron neurit i Myotube, tillsats av NMJ blockerare d-tubocurarine eller DTC till Myotube facket resulterade i en hämning av kalcium tillströmning.För att ha den största framgången med denna modell är det oerhört viktigt att utföra en celllinjekvalitetskontroll och för att undvika bildandet av luftbubblor i enhetens kanaler. Att kombinera den neuromuskulära korsningen i en maträtt med andra IPC-direkta celltyper efterliknar ännu bättre in vitro-situationen, detta gör det också möjligt att studera rollen för dessa celltyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analys av Utveckling Tooth Germ Innervation Använda mikroflödes Co-kultur-enheter

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Fibular Nerve Injury Metod: En tillförlitlig analys för att identifiera och testa faktorer som Reparation neuromuskulära korsningar

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analys för funktionell utvärdering i Rat Modell av Sciatic Nerve Crush Skada

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal Transport av organeller i motor neuron kulturer med microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Tredimensionell motorisk nervorganoidgeneration

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Funktionell Isolering av single motor enheter av Råtta Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Dissekering av enstaka skelettmuskelfibrer för immunofluorescerande och morfometriska analyser av neuromuskulära korsningar på hela berget

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...