Name: generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Yazarlar, canlı hücre kalsiyum geçici floresan kayıtları hakkındaki tavsiyeleri için LiMoNe, Research Group Moleküler Nörobiyoloji'den (VIB-KU Leuven) Nikky Corthout ve Sebastian Munck'a teşekkür ediyor. Bu araştırma Fulbright Komisyonu tarafından Belçika ve Lüksemburg, KU Leuven (C1 ve "Geleceği Açma" Fonu), VIB, Bilim ve Teknoloji İnovasyon Ajansı (IWT; SBO-iPSCAF), "Bilimsel Araştırmalar Fonu Flanders" (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), Belçika Hükümeti (Belçika Federal Bilim Politika Ofisi tarafından başlatılan Üniversitelerarası Cazibe Direkleri Programı P7/16), Thierry Latran Vakfı ve "Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires" (ABMM). T.V. ve J.B.

L.V.D.B. Charcot-Marie-Tooth hastalığında (US-2013227717-A1) HDAC inhibitörlerinin kullanımına ilişkin bir patente sahiptir, Augustine Therapeutics'in bilimsel kurucularından ve bilimsel danışma kurulunun bir üyesidir. Diğer yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Protokol, 30 günden kısa bir sürede ticari olarak kullanılabilen mikroakışkan cihazlarda fonksiyonel NMJ'lere sahip insan motor üniteleri üreten nispeten kolay bir kullanım yöntemini tanımlamaktadır. NMJ'lerin ICC ve SEM gibi standart tekniklerle ve fonksiyonel olarak canlı hücre kalsiyum kayıtlarıyla morfolojik olarak nasıl değerlendirilebileceği açıklanmaktadır.
Bu protokolün büyük bir avantajı kök hücre teknolojisinin kullanılmasıdır. Bu, NMJ'lerin donör profilinden bağımsız olarak hem sağlık hem de hastalıkta değerlendirilebileceği tam uyum sağlar. Model, FUS geninde mutasyonlara bağlı olarak neurit büyüme, yeniden büyüme ve NMJ sayılarındaki bozuklukları yeni fenotipler olarak tanımladığımız ALS araştırmalarında zaten başarılı ve faydalı olduğunu kanıtlamıştır18. Bu model ile sporadik ALS hastalarından iPSC'ler kullanılarak, etiyolojinin bilinmediği ALS'nin sporadik formlarını da kapsayacak şekilde araştırmayı genişletmek mümkündür. Bu, insan hastalığını yeniden canlandırmak için mutasyona uğramış genlerin transgenik aşırı ifadesine dayanan geleneksel hayvan modellerine göre bir avantaj sağlar23,24. Buna ek olarak, tamamen insan sistemimiz, insana özgü fizyoloji ve hastalığın potansiyel olarak yeniden kapsüllenmesine izin verir. Önceki çalışmalar kemirgen ve insan NMJ morfolojisi arasındaki farkları göstermiştir25, bu da insan NMJ patolojisini ele almak için kemirgenler kullanırken dikkatli olunması gerektiğini göstermektedir. Bu sistem, bir in vivo modelin karmaşıklığından yoksun nispeten basit bir in vitro kurulum olmasına rağmen, mikroakışkan cihazlarda görüntülenen NMJ morfolojisinin insan amputatlarının NMJ'lerine benzediğini göstermek mümkündü25. Ayrıca, bu model NMJ oluşumu ve olgunlaşması sırasında NMJ değerlendirmesine izin verir ve insan ölüm sonrası örneklerinde bulunmayan, tanımlanamayan veya göz ardı edilen erken hastalık fenotiplerini potansiyel olarak ortaya çıkarır.
MAU'lar miyotüpler oluşturmak için geçerli bir seçenek sağlar, ancak 10 günlük sınırlı hayatta kalmaları sistemin bir dezavantajıdır. Miyotüp hayatta kalma, muhtemelen miyoberlerin spontan kasılmaları ile tehlikeye giren yüzeye bağlanmalarına dayanır. 10 günden fazla bir süre sonra, çoğu miyotüt ayrılmış olacak ve NMJ kültürünü kullanılamaz hale getirecek. İdeal olarak, miyotube'lar iPSC'lerden de oluşturulur. Bununla birlikte, mevcut protokollerin füzyon indeksinde değişkenlik nedeniyle 26'yı çoğaltmanın zor olduğu kanıtlanmıştır27,28,29,30.
Ticari olarak kullanılabilen mikroakışkan cihazları kullanarak, tamamen erişilebilir standartlaştırılmış bir sistem oluşturduk. Diğer NMJ modelleri var31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Bununla birlikte, genellikle hücre tipleri arasında bölümlere ayırma ve akışkan izolasyondan yoksun olan tek bölmelere veya kullanılabilirliği ve potansiyel olarak tekrarlanabilirliği düşüren özel yapım kültür gemilerine güvenirler. Bu protokol için kullanılan mikroakışkan cihazlar, aksonal taşıma43,44 veya axotomy18,45,46 incelemeleri gibi daha fazla analize izin veren çeşitli uzunluklardaki mikrogroovlarla satın alınabilir. Bölmeler arasındaki akışkan izolasyon, motor nöronların veya miyotüplerin bölümlere ayrılmış ilaç tedavisini daha da sağlar ve bu da tedavi gelişiminde elverişli olabilir. Çok çeşitli cihaz tasarımı ve özelliklerine açılan ve in vitro araştırmalar için erişilebilirliği daha da teşvik eden mikroakışkanlar konusunda uzmanlaşmış daha fazla şirket ortaya çıkmıştır.
Sonuç olarak, fonksiyonel NMJ'lerle insan motor ünitelerini kültüre etmek için güvenilir, çok yönlü ve kolay bir yöntem sağlayan bir protokol geliştirdik.

NMJ'ler, nörotransmitterlerin salınma yoluyla alt spinal motor nöronlar ve iskelet kas lifleri arasındaki iletişimi kolaylaştırır1. ALS ve SMA gibi motor nöron bozukluklarında, NMJ'ler dejenere olur ve bu da kaslarla iletişimde bir bozulmaya neden olur2,3,4,5,6,7. Bu, hastaların yavaş yavaş kas fonksiyonlarını kaybetmelerine neden olur, bu da diyafram gibi hayati kas gruplarının ilerleyici atrofisi nedeniyle tekerlekli sandalyeye bağlı olmalarına ve sonunda solunum yaşam desteğine bağımlı olmalarına neden olur. Bu bozukluklardaki bu derin NMJ kaybının altında tam olarak altta kalan mekanizmalar bilinmemektedir. Transgenik hayvan modelleri üzerinde birçok çalışma yapılmıştır, bu da bize NMJ dejenerasyonunun patogenezine dair bazı bilgiler vermiştir5,6,8,9,10,11. Bununla birlikte, patolojiyi tam olarak anlamak ve denervasyona karşı koymak için, tam erişilebilirliğe izin veren bir insan sistemine sahip olmak önemlidir.
Burada protokol, hiPSC türevi motor nöronların ve insan birincil MAB türevli miyotüplerin ticari olarak mevcut mikroakışkan cihazlar kullanılarak ortaklaşa kült haline sokularak insan NMJ'leri üretmenin nispeten basit bir yolunu açıklar. Nöronların somalarını ve aksonlarını polarize etmek ve akışkan bir şekilde izole etmek için mikroakışkanların kullanımı, 1970'lerin sonundaki 'Campenot' odalarının12'nin ilk tanımından beri bilinmektedir. O zamandan beri, ticari seçenekler de dahil olmak üzere daha fazla mikroakışkan tasarımlar üretilmiştir. Bu protokolde kullanılan cihazlar iki bölme içerir ve her bölme bir kanal13 ile bağlı iki kuyudan oluşur. İki bölme yansıtılır ve birkaç mikrogroov ile bağlanır. Bu mikrogroovlar, kılcal hidrostatik basınç yoluyla iki bölme arasında akışkan izolasyonu korurken neurit büyümesini kolaylaştıran bir boyuta sahiptir13,14. Bu sistemi kullanarak, motor nöronları bir bölmede ve kas hücrelerini diğerinde, her biri kendi kültür ortamlarında kültüre etmek mümkündür, ancak yine de mikrogroovlardan geçen ve kas hücreleriyle etkileşime giren nötroritler aracılığıyla fiziksel bir bağlantıyı kolaylaştırır. Bu model, ALS ve SMA gibi hastalıklarda erken NMJ patolojisini incelemek için kullanılabilecek bir insan motor ünitesinin tamamen erişilebilir ve uyarlanabilir bir in vitro sistemini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35451</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.0116.1000</td>
			<td>Coating component. H226, H314. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar 33C sheet (SEM sheet)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425-25</td>
			<td>Thickness: 7.8 mil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (recombinant human protein)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>6624-AG-050</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tubulin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7751</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td>Media component. H317. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 without vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF (brain-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline acetyltransferase (ChAT)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab144P</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calfskin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF (ciliary neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2634</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15200</td>
			<td>Antibody (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20.821.296</td>
			<td>Sterilization. H225. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM live cell dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium imaging dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10B</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1020</td>
			<td>Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16050122</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human alkaline phosphatase</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB1448</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>ICC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin transferrin selenium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400045</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab4326</td>
			<td>Antibody (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Cryopreservation component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Coating component and media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 DMI8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>ICC confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myogenin (MyoG)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124800</td>
			<td>Antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin heavy chain (MyHC)</td>
			<td>In-house, SCIL</td>
			<td></td>
			<td>Antibody (1:20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Coating and media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament heavy chain (NEFH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB8135</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.30.02 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2</td>
			<td>IBL</td>
			<td>18953</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Storing equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (3 cm)</td>
			<td>nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>Diameter: 3 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833.902</td>
			<td>Diameter: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate (6-well)</td>
			<td>Cellstar Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Fluo-4 dye solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td>Coating component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>CHEM-Lab NV</td>
			<td>CL00.1133.1000</td>
			<td>Calcium imaging reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevitaCell supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2644501</td>
			<td>ROCK inhibitor solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist</td>
			<td>Merch Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0250</td>
			<td>Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin (SYP)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5461S</td>
			<td>Antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3276</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>9D10</td>
			<td>Antibody (1:300)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>MAB dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379-100G</td>
			<td>Acetylcholine receptor blocker. H301. P280.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XonaChips pre-assembled microfluidic device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>XC150</td>
			<td>Microgroove length: 150 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xona Silicone microfluidics device</td>
			<td>Xona Microfluidics</td>
			<td>SND75</td>
			<td>Microgroove length: 75 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices

Nöromüsküler kavşaklar (NMJ'ler), alt motor nöronun aksonu ile kas kasılmasının katılımını kolaylaştıran kas arasında özel sinapslardır. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve spinal müsküler atrofi (SMA) gibi motor nöron bozukluklarında, NMJ'ler dejenere olur ve bu da kas atrofisi ve ilerleyici felç ile sonuçlanır. NMJ dejenerasyonunun altında kalan mekanizma, büyük ölçüde çevrilebilir araştırma modellerinin eksikliği nedeniyle bilinmemektedir. Bu çalışma, fonksiyonel NMJ'lere sahip bir insan motor ünitesinin çok yönlü ve tekrarlanabilir bir in vitro modelini oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu nedenle, insan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) türevi motor nöronlar ve insan primer mezoangioblast (MAB) türevi miyotubelar ticari olarak mevcut mikroakışkan cihazlarda birlikte kültürlendi. Akışkan olarak izole edilmiş mikro bölmelerin kullanımı, hücreye özgü mikroçevinlerin korunmasına izin verirken, mikrogroovlar aracılığıyla hücreden hücreye temasa izin verir. Kemotaktik ve hacimsel bir gradyan uygulanarak, miyotube etkileşimini ve NMJ'lerin oluşumunu teşvik eden mikrogroovlar aracılığıyla motor nöron-nötrallerin büyümesi teşvik edildi. Bu NMJ'ler, motor nöron presynaptik belirteç sinaptofiz (SYP) ve postsinaptik asetilkolin reseptörü (AChR) belirteci α-bungarotoxin (Btx) ile eş lokalizasyon yoluyla immünostokimyasal olarak tanımlandı ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılarak morfolojik olarak karakterize edildi. NMJ'lerin işlevselliği, motor nöronların depolarizasyonu üzerine miyotüplerdeki kalsiyum yanıtları ölçülerek doğrulandı. Standart mikroakışkan cihazlar ve kök hücre teknolojisi kullanılarak üretilen motor ünitesi, sağlık ve hastalıkta NMJ'lere odaklanan gelecekteki araştırmalara yardımcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices at JoVE.com

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

fonksiyonel olarak aktif nöromüsküler kavşakların oluşumuyla sonuçlanan insan primer mezoangioblast türevli miyotüplerle birlikte insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi motor nöronları birlikte kült haline getirmekle ticari olarak mevcut mikroakışkan cihazlarda insan motor üniteleri üretmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mikroakışkan Cihazlarda Fonksiyonel Nöromüsküler Kavşaklara Sahip İnsan Motor Ünitelerinin Üretimi

Neuromuscular junctions (NMJs) are specialized synapses between the axon of the lower motor neuron and the muscle facilitating the engagement of muscle ...

Bu nispeten basit yöntem, sağlık ve hastalıkta motor nöronlara ve nöromüsküler kavşaklara odaklanan araştırmalara yardımcı olabilir. Bu protokol, standart kök hücre teknolojisini ve tekrarlanabilirliği artıran ticari olarak kullanılabilen mikroakışkan cihazları kullanır. Motor nöronların ve kas hücrelerinin kopukluğu, çeşitli nöromüsküler hastalıklarda erken bir fenomendir.Basit bir insanlaştırılmış model, bu fenomene karşı koymak için stratejiler geliştirmeye yardımcı olabilir. Bu modeli motor nöron bozukluğunu, amyotrofik lateral sklerozu araştırmak için kullanıyoruz, ancak bu model motor ünitenin gerekli olduğu diğer bozukluklar için de kullanılabilir. Forsepsleri kullanarak cihazı nakliye kabından 10 saniye boyunca sterilizasyon için% 70 ila% 100 etanol içeren Petri kabına aktararak başlayın.Cihazı forseps ile laminar akışında yaklaşık 30 dakika boyunca havayla kuruması için bir kağıt parçasına aktarın. Bir cihaz kuruduktan sonra, her cihazı tek bir 10 santimetre Petri kabına taşımak için tokmaklar kullanın. Cihazı Poli-L-ornitin veya FKÖ ile kaplamak için, üst kuyuya 100 mikrolitre FKÖ çözeltisi ekleyin ve üstten kanala doğru iyi geçen sıvıyı iyice gözlemleyin.Ardından, tabana 100 mikrolitre FKÖ çözeltisi ekleyin ve mikro olukların diğer tarafında tekrarlayın. Mikro olukları kaplamak için cihazın iki aynalı tarafı arasında hacim gradyanı oluşturmak için bir tarafa 100 mikrolitre FKÖ çözeltisi ekleyerek bitirin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte üç saat kuluçkaya yatır.Üç saat sonra, cihazı DPBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. FKÖ kaplamaya benzer prosedürü izleyerek cihazı mililitre laminin ve nörobakal ortam başına 20 mikrogram ile kaplayın. Cihazı gece boyunca 37 santigrat derece ve%5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Ertesi gün 200 mikroliter pipet kullanın ve laminin kaplamayı kuyulardan çıkarmak için ucu kanal açıklığın karşısındaki kuyuya yerleştirin. Tüm kuyulara DPBS ekledikten sonra, hücre tohumlama için ODA SıCAKLıĞıNDA Laminar Akışında DPBS'li cihazları bırakın. Her iki tarafta birkaç milimetre bırakırken SCM sayfalarını cihazın boyutuna kadar kesin.Cihazları ve SCM levhalarını 10 saniye boyunca% 70 ila% 100 etanol içeren bir Petri kabında sterilize ettikten sonra, forsepsli cihazları altı kuyulu bir tabağa ve SCM levhalarını Laminar Akışında hava kurutmak için 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Tüm tarafların yaklaşık 30 dakika kurumasını sağlamak için cihazı kenara yerleştirin. Altı kuyulu plakadaki her cihaza kuyu başına bir mililitre FKÖ çözeltisi ekleyerek cihazları kapleyin.Cihazın, kanal ve mikro oluk tarafı sıvıya bakacak şekilde FKÖ çözümünün üstünde yüzdür olduğundan emin olun. 10 santimetrelik Petri kabına 10 mililitre FKÖ çözeltisi ekleyerek SCM levhalarını kaplayın ve SCM levhalarını sıvıya itmek için forseps kullanın. Cihazları ve SCM sayfalarını daha önce gösterildiği gibi üç saat boyunca kuluçkaya yatırın.Üç saat sonra, cihazları ve SCM levhalarını DPBS ile beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından steril suyla beş dakika boyunca başka bir yıkayın. Daha sonra her bir SCM levhasını hava kurutacak şekilde 10 santimetrelik tek bir Petri kabına aktarın. Laminar Akışı'nda mikroskop altında çalışırken, silikon cihazı kanal ve mikro oluk tarafı ile SCM levhasına 90 derecelik bir açıyla monte etmek için tüm tarafların hizalanmasını sağlamak için önps kullanın.Sadece dış kenarları değil, kuyuları, kanalları ve mikro olukları da kapattığından emin olmak için cihazın üzerine hafifçe bastırın. Cihazı laminin ile kaplamak için, Laminar Akışı içinde ve mikroskop altında, 200 mikrolitre pipet kullanarak üst kuyuya mililitre başına 20 mikrogram lamininin 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu ve kanalın etrafında herhangi bir sızıntı olmadan, kanaldan tabana giden sıvıyı iyi gözlemleyin.Daha sonra, alt kısma 100 mikrolitre laminin çözeltisi ekleyin, mikro olukların diğer tarafında tekrarlayın ve mikro olukları kaplamak için cihazın iki aynalı tarafı arasında bir hacim gradyanı oluşturmak için bir tarafta ek 100 mikrolitre laminin ile bitirin, ardından cihazı bir gecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, ucu kanal açıklığın karşısındaki kuyuya konumlandırarak 200 mikrolitre pipet ile kaplamayı kuyulardan çıkarın, tüm kuyulara DPBS ekledikten sonra, HÜCRE tohumlama için Oda sıcaklığında Laminar Akışında DPBS bulunan cihazları bırakın. Mikroakışkan cihazdaki sinir progenitör hücrelerini veya NPC'leri plakalamak için, 200 mikroliter pipet kullanarak cihazdaki mikro olukların bir tarafındaki iki kuyudan DPBS'yi çıkarın.Toplam 250. Hücre süspansiyonunun kalan yarısını alt kuyuya eklemeden önce hücre süspansiyonunun kanaldan akmasını sağlamak için birkaç saniye bekleyin. Mikroskop olmadan cihazın kolay yönlendirilmeleri için tohumlu tarafı NPC veya eşdeğeri olarak işaretlemek için bir kalem kullanın ve hücre eki için beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, iki NPC tohumlu kuyuyu yavaşça ek bir gün 10 motor nöron ortamı ile kuyu başına toplam 200 mikrolitre hacimde toplar. 200 mikrolitre pipet kullanarak, DPBS'yi taze tohumlu NPC'lerin karşısındaki mikro olukların diğer tarafındaki iki kuyudan çıkarın.Daha sonra kuluçka sırasında ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafına 10 santimetrelik tabak başına altı mililitre DPBS ekleyin. Ortamı değiştirmek için, 200 mikrolitre pipet ucunu kanal açıklığının karşısındaki kuyu duvarının alt kenarına konumlandırarak NPC'lerle her iki kuyudaki medyayı yavaşça çıkarın. Güçlü bir ortam akışının kanaldaki hücrelere zarar vermesini önlemek için, üst ve alt arasında sürekli olarak iyice değiştirerek her kuyuya 50 ila 100 mikrolitre taze motor nöron ortamı ekleyin.Her kuyu 200 mikrolitre orta içerene kadar işlemi tekrarlayın. Motor nöron farklılaşması 17. gününde, cihazdaki mikro olukların emişsiz tarafındaki motor nöron ortamını 200 mikroliter pipetle çıkarın ve kuyuları DPBS ile yıkayın. Toplam 200.000 insan birincil mezoangioblast veya MAB tohum, üst kuyu hücre süspansiyonunun yarısını tohumlayarak cihaz başına 60 ila 100 mikrolitre büyüme ortamı.Hücre süspansiyonunun kalan yarısını alttaki tohumlamadan önce kanaldan akmasına izin vermek için birkaç saniye bekleyin, daha önce NPC'lerin kaplaması için gösterildiği gibi, hücre eki için cihazı beş dakika kuluçkaya bırakın. Daha sonra iki yeni MAB tohumlu kuyuyu ek bir büyüme ortamı ile toplar ve gösterildiği gibi tekrar kuluçkaya yatırın.Motor nöron farklılaşmasında 21. günde kemoterapi taktiğini ve hacimsel gradyanı başlatmak için, Myotube bölmesine büyüme faktörleri içeren motor nöron nörobasal ortamın kuyusu başına 200 mikrolitre ekleyin, ardından motor nöron bölmesine büyüme faktörü olmadan motor nöron bazal ortamın kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin. Hücre hatlarının farklılaşma potansiyelini mikroakışkan cihazlarda birlikte kültlemeden önce değerlendirmek önemlidir. MGB'lerin füzyon indeksi belirlendi ve yaklaşık% 8'inin ortak kültür için yeterli olduğu tahmin edildi.Üretilen motor nöron kültürleri motor nöron belirteçleri için %85 ila %95 pozitifti. Nöromüsküler kavşakların veya NMJ'lerin miktarını karakterize etmek ve ölçmek için, motor nöron ve pre-sinaptik belirteçler nörofilament ağır zincir ve sinaptofisin ve postsinaptik asetilen reseptör marker alfa bungarotoxin arasındaki ko-lokalizasyonların sayısı, her hastalık yığını boyunca sayıldı ve Z yığınında bulunan miyosin ağırlıklı zincirli Myotubes'ta normalleştirildi. NMJ'ler, neurite'in bir etkileşim noktasında ince bir kolin reseptörü kümesine dokunduğu tek temas noktası NMJ'ler olarak ortaya çıktı.Ya da bir neurite'in daha büyük bir yüzey üzerinde ince bir kolin reseptör kümesiyle kaplandığı ve etkileşime girdiği birden fazla temas noktası NMJ olarak. Motor nöron yenilikli Myotubes yüzdesinin ölçülmesi, tüm Myotube'ların NMJ içermediğini gösterdi. Potasyum klorür ile motor nöron aktivasyonu üzerine, Fluo-4 etiketli Myotubes'ta kalsiyum akını gözlendi, bu da Myotube'daki motor nöron neurite ile fonksiyonel bir bağlantıyı doğruladı, Myotube bölmesine NMJ bloker d-tubocurarine veya DTC eklenmesi kalsiyum akınının inhibisyonuna neden oldu.Bu modelde en büyük başarıya sahip olmak için bir hücre hattı kalite kontrolü yapmak ve cihazın kanallarında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek inanılmaz derecede önemlidir. Bir tabaktaki nöromüsküler kavşağı diğer IPC doğrudan hücre tipleriyle birleştirmek, in vitro durumu daha da iyi taklit eder, bu aynı zamanda bu hücre tiplerinin rolünü incelemeye izin verir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Fibula Sinir Yaralanması Yöntem: Güvenilir Testi tanımak ve Test O Tamir Nöromüsküler Junctions Faktörleri

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Sıçan Medial Gastroknemius KasTek Motor Üniteleri Fonksiyonel İzolasyon

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...